ELISA Yöntemi
ELISA veya enzime bağlı immünosorbent testi, belirli bir hedef proteinin varlığını veya yokluğunu belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
Bir dizi yıkama ve bağlama adımı aracılığıyla, bir enzime konjuge edilmiş veya bağlanmış bir antikor, 96 oyuklu bir plakanın dibindeki bir hedef proteini tanıyacaktır. Numuneye substrat eklendiğinde, hedef proteinin tanımlanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren bir renk değişikliğine neden olan bir enzimatik reaksiyon meydana gelecektir.
Bir ELISA'nın nasıl gerçekleştirileceğini tartışmadan önce, ihtiyaç duyacağınız ekipman ve reaktifleri tanıyalım.
Bir ELISA reaksiyonu için ayar tipik olarak 96 oyuklu düz tabanlı bir plakadır. Kuyucukların düz tabanları, deney numunenizin yanı sıra yakalama ve tespit antikorlarınızın eşit dağılımını kolaylaştırmaya yardımcı olacaktır.
ELISA'lar, deneysel sulu çözeltilerde spesifik hedef proteinlerin varlığını tespit eder. İdrar, hücre kültürü ortamı ve serum yaygın deneysel örneklerdir.
Bir ELISA'da, hedef proteine doğrudan bağlanan antikor, birincil antikordur. Hedef proteinin bir epitopu - belirli bir bölgesi - için yüksek afiniteye, yani sıkıca bağlanma kabiliyetine sahiptir. Primer antikor genellikle etiketlenmemiş veya konjuge değildir.
Belirtildiği gibi, antikorlar çoğunlukla belirli bir epitopa yüksek afinite bağlanması yoluyla hedef proteinlerine bağlanır. Bununla birlikte, deneysel numune, spesifik olmayan bağlanma bölgelerini ifade eden hücre parçaları, dedektör antikorlarınızın sabit veya epitop spesifik olmayan bölgesini bağlayabilen bölgeler içerebilir.
Bu nedenle, deneysel numunelerinizdeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerini kapsamak için bir ELISA'da bir bloke edici tamponun eklenmesi çok önemlidir. Aksi takdirde, hedef protein içermeyen kuyucuklarda enzimatik reaksiyonlar meydana gelebilir ve bu da size yanlış pozitif veriler verir!
Bir ELISA'daki ikincil antikor, birincil antikoru tanımak için kullanılan antikordur. Bu antikor genellikle bir enzime konjuge edilir. Bazen ikincil antikorun korkak bir adı vardır. Örneğin, ikincil antikor, bir keçide yetiştirilen bir birincil antikoru tanımak için bir eşekte yapıldıysa veya yükseltildiyse, ikincil antikor, bir eşek anti-keçi antikoru olarak adlandırılacaktır. İkincil antikorların adlandırılması söz konusu olduğunda, ilk isim ikincil antikoru üreten organizmayı, ikinci isim ise birincil antikoru üreten organizmayı temsil eder.
İkincil antikora bağlı enzimin aktif bölgesine bağlanan bir substrat da gerekli olacaktır. Bu reaksiyon sırasında meydana gelen kimyasal reaksiyon, aksi takdirde renksiz olan substratta bir renk değişikliğine neden olur. Kolorimetrik test olarak adlandırılan bu test, hedef proteinin varlığının tanımlanmasına ve miktarının belirlenmesine izin verir.
Enzimatik reaksiyon, mevcut substrat olduğu sürece devam edecektir. Bu nedenle, kısa bir inkübasyon süresinden sonra, reaksiyonun gerçekten durdurulduğunu göstermek için başka bir renk değişikliğine neden olan bir durdurma çözeltisi kuyucuklara eklenir.
Her bir oyuktaki absorbansı, yani renkli ürün miktarını okuyarak her bir oyuktaki ilgilenilen proteinin konsantrasyonunu ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanılacaktır. Absorbans, mevcut hedef protein miktarı ile orantılıdır.
Artık tüm ekipmanınız hazır olduğuna göre, bir ELISA çalıştıralım!
Standart veya doğrudan bir ELISA gerçekleştirmek için, önce 96 oyuklu plakanın kuyularını, kaplama tamponunda seyreltilmiş hedef proteininizle kaplayın. Pozitif ve negatif kontrollerinizi de bu zamanda plakalayın.
Kaplanmış plakayı, proteinin plakanın dibine tamamen adsorbe etmesi veya yapışması için zaman tanıyacak kadar uzun süre inkübe ettikten sonra, fazla kaplama solüsyonunu bileğinizin hızlı bir hareketiyle boşaltın.
Ardından, her bir kuyucuğu blokaj tamponunda inkübe ederek olası herhangi bir spesifik olmayan bağlanmayı veya arka plan sinyalini bloke edin.
Şimdi bloke edici tamponu boşaltın ve kuyuları fosfat tamponlu salin veya PBS ve% 1 BSA içinde kısa bir oda sıcaklığında inkübasyon ile yıkayın.
Kuyucuklar PBS ile durulanırken, standart bir eğri oluşturmak için hedef proteinin bilinen bir konsantrasyonunun seyreltmelerini hazırlayın. Hedef proteinin bilinen konsantrasyonlarını içeren standart eğri kuyucuklarının absorbansı, numune kuyucuklarının absorbansının standart eğri kuyularının absorbansı ile karşılaştırılmasına dayalı olarak deneysel numune kuyucuklarınızdaki hedef protein konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılacaktır.
Şimdi tespit veya birincil antikoru ekleme zamanı!
Plaka daha sonra, proteinin daha sonra tespiti ve miktarının belirlenmesi için yeterli miktarda antikorun hedef proteine bağlanmasına izin vermek için genellikle oda sıcaklığında inkübe edilir.
Bu inkübasyondan sonra, fazla antikor çıkarılır ve kuyucuklar kısa bir süre PBS ile yıkanır.
İkincil antikor daha sonra plakaya eklenir ve ikincil antikorun bağlanmasına izin vermek için plaka bir kez daha inkübe edilir - tipik olarak dönen bir platform üzerinde. Yıkama adımları daha önce olduğu gibi tekrarlanır.
Ardından, hangi kuyucukların hedef proteininizi içerdiğini görmek için alt tabakayı plakaya ekleyin. Reaksiyonu ışıktan korumak için plakayı örtün ve ardından kısa bir inkübasyondan sonra, reaksiyonu durdurma çözeltisi ile durdurun.
Son olarak, her bir oyuktaki renkli çözeltinin emilimini veya miktarını ölçmek için plakanızı mikroplaka okuyucuya yerleştirin. Okuyucunun hangi kuyuları analiz etmesini istediğinizi seçmeniz gerekecektir. Cihaz plakayı okumayı bitirdiğinde, her bir kuyucuk için absorbansın bir okuması görüntülenecektir.
Her ELISA kitinin bir algılama limiti olduğuna dikkat etmek önemlidir. Yani, sadece belirli sınırların üstündeki ve altındaki protein konsantrasyonları doğru bir şekilde belirlenebilir. Çok küçük protein konsantrasyonları genellikle spesifik olmayan boyamanın arka plan seviyelerine çok yakındır, çok yüksek konsantrasyonlar ise fazla protein veya antikorun o numune kuyucuğunda uygun şekilde yıkanmadığını gösterebilir.
Öyleyse neden bir ELISA yapabilirsiniz? Birkaç yaygın uygulamaya bir göz atalım.
Muhtemelen gerçekleştirilen en yaygın ELISA türü sandviç ELISA'dır.
Bir sandviç ELISA'da, 96 oyuklu bir plaka ilk olarak ilgilenilen hedef proteini tanıyan bir birincil antikor ile kaplanır.
Bu deneyde, insan antikoru üreten hücre hatlarından toplanan hücre kültürü ortamı, insan antikorlarını tanıyan bir birincil antikor ile önceden kaplanmış 96 oyuklu plakalar üzerine otomatik bir sistem tarafından kaplandı.
Fazla numuneyi PBS ile yıkadıktan sonra, enzime bağlı bir ikincil antikor eklenir ve ardından kolorimetrik bir substrat eklenir.
Absorbans daha sonra tipik bir ELISA ile aynı şekilde ölçülür. Örneğin, bu deneyde, bu ELISA verileri, hangi hücre hatlarının, hedef antijenine en yüksek afiniteye sahip insan antikorunu ürettiğini belirlemek için kullanılacaktır - bu, hedef antijene doğru bir şekilde bağlanma yeteneğidir.
Reçetesiz satılan hamilelik testi, bir tür sandviç ELISA'dır.
Potansiyel olarak hamile kadının idrarı teste eklendiğinde, teste bağlı enzime bağlı primer antikorlar, varsa hamilelik hormonu hCG'yi bağlayacaktır. Kadın hamileyse, birincil antikorlar test bölgesinde substrata bağlı ikincil antikorlar tarafından tanındığında bir substrat-enyzme reaksiyonu meydana gelir ve renkli bir çizgi belirir.
Başka bir ELISA türü, antikorların varlığını tespit etmek için kullanılabilen rekabetçi ELISA'dır.
İlgilenilen antikorlar numunede mevcutsa, plakanın dibine bağlı hedef proteine bağlanacaktır. Daha sonra, enzime bağlı tespit antikorları plakaya eklendiğinde, enzime bağlı antikorlar bağlanacak çok az protein bulacak veya hiç bulmayacaktır; Deney örneğindeki ilgili antikorlar tarafından "rekabet edebilecek" olacaklar.
Rekabetçi bir ELISA'da, renkli kuyucuklar, aslında ilgilenilen antikoru içermeyen numuneleri gösterir! Hasta plazma numuneleri, numunede HIV virüsü gibi belirli patojenler için antikorların bulunup bulunmadığını belirlemek için tipik olarak rekabetçi bir ELISA'da çalıştırılır.
JoVE'un bir ELISA gerçekleştirmeye giriş bölümünü az önce izlediniz. Bu videoda şunları inceledik: ELISA'nın ne olduğu ve nasıl çalıştığı; hangi ekipman ve reaktifleri gerçekleştirmeniz gerekecek ve ELISA; ve tahlilin bazı farklı uygulamaları. İzlediğiniz için teşekkürler ve alt tabakanızın aşırı gelişmesine izin vermemeyi unutmayın!
Enzime bağlı bir immünosorbent testi (ELISA) tipik olarak, deneysel bir numune içinde ilgilenilen bir hedef proteinin varlığını ve/veya miktarını tesp…
ELISA veya enzime bağlı immünosorbent testi, belirli bir hedef proteinin varlığını veya yokluğunu belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
Bir dizi yıkama ve bağlama adımı aracılığıyla, bir enzime konjuge edilmiş veya bağlanmış bir antikor, 96 oyuklu bir plakanın dibindeki bir hedef proteini tanıyacaktır. Numuneye substrat eklendiğinde, hedef proteinin tanımlanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren bir renk değişikliğine neden olan bir enzimatik reaksiyon meydana gelecektir.
Bir ELISA'nın nasıl gerçekleştirileceğini tartışmadan önce, ihtiyaç duyacağınız ekipman ve reaktifleri tanıyalım.
Bir ELISA reaksiyonu için ayar tipik olarak 96 oyuklu düz tabanlı bir plakadır. Kuyucukların düz tabanları, deney numunenizin yanı sıra yakalama ve tespit antikorlarınızın eşit dağılımını kolaylaştırmaya yardımcı olacaktır.
ELISA'lar, deneysel sulu çözeltilerde spesifik hedef proteinlerin varlığını tespit eder. İdrar, hücre kültürü ortamı ve serum yaygın deneysel örneklerdir.
Bir ELISA'da, hedef proteine doğrudan bağlanan antikor, birincil antikordur. Hedef proteinin bir epitopu - belirli bir bölgesi - için yüksek afiniteye, yani sıkıca bağlanma kabiliyetine sahiptir. Primer antikor genellikle etiketlenmemiş veya konjuge değildir.
Belirtildiği gibi, antikorlar çoğunlukla belirli bir epitopa yüksek afinite bağlanması yoluyla hedef proteinlerine bağlanır. Bununla birlikte, deneysel numune, spesifik olmayan bağlanma bölgelerini ifade eden hücre parçaları, dedektör antikorlarınızın sabit veya epitop spesifik olmayan bölgesini bağlayabilen bölgeler içerebilir.
Bu nedenle, deneysel numunelerinizdeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerini kapsamak için bir ELISA'da bir bloke edici tamponun eklenmesi çok önemlidir. Aksi takdirde, hedef protein içermeyen kuyucuklarda enzimatik reaksiyonlar meydana gelebilir ve bu da size yanlış pozitif veriler verir!
Bir ELISA'daki ikincil antikor, birincil antikoru tanımak için kullanılan antikordur. Bu antikor genellikle bir enzime konjuge edilir. Bazen ikincil antikorun korkak bir adı vardır. Örneğin, ikincil antikor, bir keçide yetiştirilen bir birincil antikoru tanımak için bir eşekte yapıldıysa veya yükseltildiyse, ikincil antikor, bir eşek anti-keçi antikoru olarak adlandırılacaktır. İkincil antikorların adlandırılması söz konusu olduğunda, ilk isim ikincil antikoru üreten organizmayı, ikinci isim ise birincil antikoru üreten organizmayı temsil eder.
İkincil antikora bağlı enzimin aktif bölgesine bağlanan bir substrat da gerekli olacaktır. Bu reaksiyon sırasında meydana gelen kimyasal reaksiyon, aksi takdirde renksiz olan substratta bir renk değişikliğine neden olur. Kolorimetrik test olarak adlandırılan bu test, hedef proteinin varlığının tanımlanmasına ve miktarının belirlenmesine izin verir.
Enzimatik reaksiyon, mevcut substrat olduğu sürece devam edecektir. Bu nedenle, kısa bir inkübasyon süresinden sonra, reaksiyonun gerçekten durdurulduğunu göstermek için başka bir renk değişikliğine neden olan bir durdurma çözeltisi kuyucuklara eklenir.
Her bir oyuktaki absorbansı, yani renkli ürün miktarını okuyarak her bir oyuktaki ilgilenilen proteinin konsantrasyonunu ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanılacaktır. Absorbans, mevcut hedef protein miktarı ile orantılıdır.
Artık tüm ekipmanınız hazır olduğuna göre, bir ELISA çalıştıralım!
Standart veya doğrudan bir ELISA gerçekleştirmek için, önce 96 oyuklu plakanın kuyularını, kaplama tamponunda seyreltilmiş hedef proteininizle kaplayın. Pozitif ve negatif kontrollerinizi de bu zamanda plakalayın.
Kaplanmış plakayı, proteinin plakanın dibine tamamen adsorbe etmesi veya yapışması için zaman tanıyacak kadar uzun süre inkübe ettikten sonra, fazla kaplama solüsyonunu bileğinizin hızlı bir hareketiyle boşaltın.
Ardından, her bir kuyucuğu blokaj tamponunda inkübe ederek olası herhangi bir spesifik olmayan bağlanmayı veya arka plan sinyalini bloke edin.
Şimdi bloke edici tamponu boşaltın ve kuyuları fosfat tamponlu salin veya PBS ve% 1 BSA içinde kısa bir oda sıcaklığında inkübasyon ile yıkayın.
Kuyucuklar PBS ile durulanırken, standart bir eğri oluşturmak için hedef proteinin bilinen bir konsantrasyonunun seyreltmelerini hazırlayın. Hedef proteinin bilinen konsantrasyonlarını içeren standart eğri kuyucuklarının absorbansı, numune kuyucuklarının absorbansının standart eğri kuyularının absorbansı ile karşılaştırılmasına dayalı olarak deneysel numune kuyucuklarınızdaki hedef protein konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılacaktır.
Şimdi tespit veya birincil antikoru ekleme zamanı!
Plaka daha sonra, proteinin daha sonra tespiti ve miktarının belirlenmesi için yeterli miktarda antikorun hedef proteine bağlanmasına izin vermek için genellikle oda sıcaklığında inkübe edilir.
Bu inkübasyondan sonra, fazla antikor çıkarılır ve kuyucuklar kısa bir süre PBS ile yıkanır.
İkincil antikor daha sonra plakaya eklenir ve ikincil antikorun bağlanmasına izin vermek için plaka bir kez daha inkübe edilir - tipik olarak dönen bir platform üzerinde. Yıkama adımları daha önce olduğu gibi tekrarlanır.
Ardından, hangi kuyucukların hedef proteininizi içerdiğini görmek için alt tabakayı plakaya ekleyin. Reaksiyonu ışıktan korumak için plakayı örtün ve ardından kısa bir inkübasyondan sonra, reaksiyonu durdurma çözeltisi ile durdurun.
Son olarak, her bir oyuktaki renkli çözeltinin emilimini veya miktarını ölçmek için plakanızı mikroplaka okuyucuya yerleştirin. Okuyucunun hangi kuyuları analiz etmesini istediğinizi seçmeniz gerekecektir. Cihaz plakayı okumayı bitirdiğinde, her bir kuyucuk için absorbansın bir okuması görüntülenecektir.
Her ELISA kitinin bir algılama limiti olduğuna dikkat etmek önemlidir. Yani, sadece belirli sınırların üstündeki ve altındaki protein konsantrasyonları doğru bir şekilde belirlenebilir. Çok küçük protein konsantrasyonları genellikle spesifik olmayan boyamanın arka plan seviyelerine çok yakındır, çok yüksek konsantrasyonlar ise fazla protein veya antikorun o numune kuyucuğunda uygun şekilde yıkanmadığını gösterebilir.
Öyleyse neden bir ELISA yapabilirsiniz? Birkaç yaygın uygulamaya bir göz atalım.
Muhtemelen gerçekleştirilen en yaygın ELISA türü sandviç ELISA'dır.
Bir sandviç ELISA'da, 96 oyuklu bir plaka ilk olarak ilgilenilen hedef proteini tanıyan bir birincil antikor ile kaplanır.
Bu deneyde, insan antikoru üreten hücre hatlarından toplanan hücre kültürü ortamı, insan antikorlarını tanıyan bir birincil antikor ile önceden kaplanmış 96 oyuklu plakalar üzerine otomatik bir sistem tarafından kaplandı.
Fazla numuneyi PBS ile yıkadıktan sonra, enzime bağlı bir ikincil antikor eklenir ve ardından kolorimetrik bir substrat eklenir.
Absorbans daha sonra tipik bir ELISA ile aynı şekilde ölçülür. Örneğin, bu deneyde, bu ELISA verileri, hangi hücre hatlarının, hedef antijenine en yüksek afiniteye sahip insan antikorunu ürettiğini belirlemek için kullanılacaktır - bu, hedef antijene doğru bir şekilde bağlanma yeteneğidir.
Reçetesiz satılan hamilelik testi, bir tür sandviç ELISA'dır.
Potansiyel olarak hamile kadının idrarı teste eklendiğinde, teste bağlı enzime bağlı primer antikorlar, varsa hamilelik hormonu hCG'yi bağlayacaktır. Kadın hamileyse, birincil antikorlar test bölgesinde substrata bağlı ikincil antikorlar tarafından tanındığında bir substrat-enyzme reaksiyonu meydana gelir ve renkli bir çizgi belirir.
Başka bir ELISA türü, antikorların varlığını tespit etmek için kullanılabilen rekabetçi ELISA'dır.
İlgilenilen antikorlar numunede mevcutsa, plakanın dibine bağlı hedef proteine bağlanacaktır. Daha sonra, enzime bağlı tespit antikorları plakaya eklendiğinde, enzime bağlı antikorlar bağlanacak çok az protein bulacak veya hiç bulmayacaktır; Deney örneğindeki ilgili antikorlar tarafından "rekabet edebilecek" olacaklar.
Rekabetçi bir ELISA'da, renkli kuyucuklar, aslında ilgilenilen antikoru içermeyen numuneleri gösterir! Hasta plazma numuneleri, numunede HIV virüsü gibi belirli patojenler için antikorların bulunup bulunmadığını belirlemek için tipik olarak rekabetçi bir ELISA'da çalıştırılır.
JoVE'un bir ELISA gerçekleştirmeye giriş bölümünü az önce izlediniz. Bu videoda şunları inceledik: ELISA'nın ne olduğu ve nasıl çalıştığı; hangi ekipman ve reaktifleri gerçekleştirmeniz gerekecek ve ELISA; ve tahlilin bazı farklı uygulamaları. İzlediğiniz için teşekkürler ve alt tabakanızın aşırı gelişmesine izin vermemeyi unutmayın!
ELISA veya enzime bağlı immünosorbent testi, belirli bir hedef proteinin varlığını veya yokluğunu belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
Bir dizi yıkama ve bağlama adımı aracılığıyla, bir enzime konjuge edilmiş veya bağlanmış bir antikor, 96 oyuklu bir plakanın dibindeki bir hedef proteini tanıyacaktır. Numuneye substrat eklendiğinde, hedef proteinin tanımlanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren bir renk değişikliğine neden olan bir enzimatik reaksiyon meydana gelecektir.
Bir ELISA'nın nasıl gerçekleştirileceğini tartışmadan önce, ihtiyaç duyacağınız ekipman ve reaktifleri tanıyalım.
Bir ELISA reaksiyonu için ayar tipik olarak 96 oyuklu düz tabanlı bir plakadır. Kuyucukların düz tabanları, deney numunenizin yanı sıra yakalama ve tespit antikorlarınızın eşit dağılımını kolaylaştırmaya yardımcı olacaktır.
ELISA'lar, deneysel sulu çözeltilerde spesifik hedef proteinlerin varlığını tespit eder. İdrar, hücre kültürü ortamı ve serum yaygın deneysel örneklerdir.
Bir ELISA'da, hedef proteine doğrudan bağlanan antikor, birincil antikordur. Hedef proteinin bir epitopu - belirli bir bölgesi - için yüksek afiniteye, yani sıkıca bağlanma kabiliyetine sahiptir. Primer antikor genellikle etiketlenmemiş veya konjuge değildir.
Belirtildiği gibi, antikorlar çoğunlukla belirli bir epitopa yüksek afinite bağlanması yoluyla hedef proteinlerine bağlanır. Bununla birlikte, deneysel numune, spesifik olmayan bağlanma bölgelerini ifade eden hücre parçaları, dedektör antikorlarınızın sabit veya epitop spesifik olmayan bölgesini bağlayabilen bölgeler içerebilir.
Bu nedenle, deneysel numunelerinizdeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerini kapsamak için bir ELISA'da bir bloke edici tamponun eklenmesi çok önemlidir. Aksi takdirde, hedef protein içermeyen kuyucuklarda enzimatik reaksiyonlar meydana gelebilir ve bu da size yanlış pozitif veriler verir!
Bir ELISA'daki ikincil antikor, birincil antikoru tanımak için kullanılan antikordur. Bu antikor genellikle bir enzime konjuge edilir. Bazen ikincil antikorun korkak bir adı vardır. Örneğin, ikincil antikor, bir keçide yetiştirilen bir birincil antikoru tanımak için bir eşekte yapıldıysa veya yükseltildiyse, ikincil antikor, bir eşek anti-keçi antikoru olarak adlandırılacaktır. İkincil antikorların adlandırılması söz konusu olduğunda, ilk isim ikincil antikoru üreten organizmayı, ikinci isim ise birincil antikoru üreten organizmayı temsil eder.
İkincil antikora bağlı enzimin aktif bölgesine bağlanan bir substrat da gerekli olacaktır. Bu reaksiyon sırasında meydana gelen kimyasal reaksiyon, aksi takdirde renksiz olan substratta bir renk değişikliğine neden olur. Kolorimetrik test olarak adlandırılan bu test, hedef proteinin varlığının tanımlanmasına ve miktarının belirlenmesine izin verir.
Enzimatik reaksiyon, mevcut substrat olduğu sürece devam edecektir. Bu nedenle, kısa bir inkübasyon süresinden sonra, reaksiyonun gerçekten durdurulduğunu göstermek için başka bir renk değişikliğine neden olan bir durdurma çözeltisi kuyucuklara eklenir.
Her bir oyuktaki absorbansı, yani renkli ürün miktarını okuyarak her bir oyuktaki ilgilenilen proteinin konsantrasyonunu ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanılacaktır. Absorbans, mevcut hedef protein miktarı ile orantılıdır.
Artık tüm ekipmanınız hazır olduğuna göre, bir ELISA çalıştıralım!
Standart veya doğrudan bir ELISA gerçekleştirmek için, önce 96 oyuklu plakanın kuyularını, kaplama tamponunda seyreltilmiş hedef proteininizle kaplayın. Pozitif ve negatif kontrollerinizi de bu zamanda plakalayın.
Kaplanmış plakayı, proteinin plakanın dibine tamamen adsorbe etmesi veya yapışması için zaman tanıyacak kadar uzun süre inkübe ettikten sonra, fazla kaplama solüsyonunu bileğinizin hızlı bir hareketiyle boşaltın.
Ardından, her bir kuyucuğu blokaj tamponunda inkübe ederek olası herhangi bir spesifik olmayan bağlanmayı veya arka plan sinyalini bloke edin.
Şimdi bloke edici tamponu boşaltın ve kuyuları fosfat tamponlu salin veya PBS ve% 1 BSA içinde kısa bir oda sıcaklığında inkübasyon ile yıkayın.
Kuyucuklar PBS ile durulanırken, standart bir eğri oluşturmak için hedef proteinin bilinen bir konsantrasyonunun seyreltmelerini hazırlayın. Hedef proteinin bilinen konsantrasyonlarını içeren standart eğri kuyucuklarının absorbansı, numune kuyucuklarının absorbansının standart eğri kuyularının absorbansı ile karşılaştırılmasına dayalı olarak deneysel numune kuyucuklarınızdaki hedef protein konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılacaktır.
Şimdi tespit veya birincil antikoru ekleme zamanı!
Plaka daha sonra, proteinin daha sonra tespiti ve miktarının belirlenmesi için yeterli miktarda antikorun hedef proteine bağlanmasına izin vermek için genellikle oda sıcaklığında inkübe edilir.
Bu inkübasyondan sonra, fazla antikor çıkarılır ve kuyucuklar kısa bir süre PBS ile yıkanır.
İkincil antikor daha sonra plakaya eklenir ve ikincil antikorun bağlanmasına izin vermek için plaka bir kez daha inkübe edilir - tipik olarak dönen bir platform üzerinde. Yıkama adımları daha önce olduğu gibi tekrarlanır.
Ardından, hangi kuyucukların hedef proteininizi içerdiğini görmek için alt tabakayı plakaya ekleyin. Reaksiyonu ışıktan korumak için plakayı örtün ve ardından kısa bir inkübasyondan sonra, reaksiyonu durdurma çözeltisi ile durdurun.
Son olarak, her bir oyuktaki renkli çözeltinin emilimini veya miktarını ölçmek için plakanızı mikroplaka okuyucuya yerleştirin. Okuyucunun hangi kuyuları analiz etmesini istediğinizi seçmeniz gerekecektir. Cihaz plakayı okumayı bitirdiğinde, her bir kuyucuk için absorbansın bir okuması görüntülenecektir.
Her ELISA kitinin bir algılama limiti olduğuna dikkat etmek önemlidir. Yani, sadece belirli sınırların üstündeki ve altındaki protein konsantrasyonları doğru bir şekilde belirlenebilir. Çok küçük protein konsantrasyonları genellikle spesifik olmayan boyamanın arka plan seviyelerine çok yakındır, çok yüksek konsantrasyonlar ise fazla protein veya antikorun o numune kuyucuğunda uygun şekilde yıkanmadığını gösterebilir.
Öyleyse neden bir ELISA yapabilirsiniz? Birkaç yaygın uygulamaya bir göz atalım.
Muhtemelen gerçekleştirilen en yaygın ELISA türü sandviç ELISA'dır.
Bir sandviç ELISA'da, 96 oyuklu bir plaka ilk olarak ilgilenilen hedef proteini tanıyan bir birincil antikor ile kaplanır.
Bu deneyde, insan antikoru üreten hücre hatlarından toplanan hücre kültürü ortamı, insan antikorlarını tanıyan bir birincil antikor ile önceden kaplanmış 96 oyuklu plakalar üzerine otomatik bir sistem tarafından kaplandı.
Fazla numuneyi PBS ile yıkadıktan sonra, enzime bağlı bir ikincil antikor eklenir ve ardından kolorimetrik bir substrat eklenir.
Absorbans daha sonra tipik bir ELISA ile aynı şekilde ölçülür. Örneğin, bu deneyde, bu ELISA verileri, hangi hücre hatlarının, hedef antijenine en yüksek afiniteye sahip insan antikorunu ürettiğini belirlemek için kullanılacaktır - bu, hedef antijene doğru bir şekilde bağlanma yeteneğidir.
Reçetesiz satılan hamilelik testi, bir tür sandviç ELISA'dır.
Potansiyel olarak hamile kadının idrarı teste eklendiğinde, teste bağlı enzime bağlı primer antikorlar, varsa hamilelik hormonu hCG'yi bağlayacaktır. Kadın hamileyse, birincil antikorlar test bölgesinde substrata bağlı ikincil antikorlar tarafından tanındığında bir substrat-enyzme reaksiyonu meydana gelir ve renkli bir çizgi belirir.
Başka bir ELISA türü, antikorların varlığını tespit etmek için kullanılabilen rekabetçi ELISA'dır.
İlgilenilen antikorlar numunede mevcutsa, plakanın dibine bağlı hedef proteine bağlanacaktır. Daha sonra, enzime bağlı tespit antikorları plakaya eklendiğinde, enzime bağlı antikorlar bağlanacak çok az protein bulacak veya hiç bulmayacaktır; Deney örneğindeki ilgili antikorlar tarafından "rekabet edebilecek" olacaklar.
Rekabetçi bir ELISA'da, renkli kuyucuklar, aslında ilgilenilen antikoru içermeyen numuneleri gösterir! Hasta plazma numuneleri, numunede HIV virüsü gibi belirli patojenler için antikorların bulunup bulunmadığını belirlemek için tipik olarak rekabetçi bir ELISA'da çalıştırılır.
JoVE'un bir ELISA gerçekleştirmeye giriş bölümünü az önce izlediniz. Bu videoda şunları inceledik: ELISA'nın ne olduğu ve nasıl çalıştığı; hangi ekipman ve reaktifleri gerçekleştirmeniz gerekecek ve ELISA; ve tahlilin bazı farklı uygulamaları. İzlediğiniz için teşekkürler ve alt tabakanızın aşırı gelişmesine izin vermemeyi unutmayın!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is an ELISA and how does it detect target proteins?
An ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, detects specific target proteins in experimental samples through antibody binding. Antibodies conjugated to enzymes recognize target proteins coating the bottom of a 96-well plate. When substrate is added, an enzymatic reaction occurs, causing a color change that allows identification and quantification of the target protein.
Q2: Why is a blocking buffer essential in ELISA procedures?
A blocking buffer covers nonspecific binding sites in experimental samples that could otherwise bind detector antibodies. Without blocking, enzymatic reactions may occur in wells lacking target protein, producing false positive results. This step prevents background signal and ensures accurate detection of only the target protein of interest.
Q3: How do primary and secondary antibodies work together in an ELISA?
The primary antibody directly binds to the target protein with high affinity for a specific epitope region. The secondary antibody, typically raised in a different organism, recognizes and binds to the primary antibody. The secondary antibody is enzyme-conjugated, enabling the colorimetric reaction when substrate is added.
Q4: What role does the microplate reader play in ELISA analysis?
The microplate reader quantifies protein concentration by measuring absorbance, or the amount of colored product, in each well. The absorbance is proportional to the target protein present. By comparing sample well absorbance to a standard curve of known protein concentrations, the reader determines the protein concentration in experimental samples.
Q5: What is a sandwich ELISA and how does it differ from a standard ELISA?
In a sandwich ELISA, the 96-well plate is coated first with a primary antibody that recognizes the target protein, rather than coating with the target protein itself. The target protein binds between the plate-bound primary antibody and an enzyme-linked secondary antibody, creating a sandwich structure. This format is commonly used in pregnancy tests and cell line screening applications.
Q6: How does a competitive ELISA detect antibodies in patient samples?
In a competitive ELISA, antibodies of interest in the sample bind to target protein attached to the plate bottom. When enzyme-linked detection antibodies are added, they find few binding sites because the sample antibodies have already bound the target protein. Colored wells indicate samples without the antibody of interest, making this format useful for detecting pathogen antibodies like HIV.
Q7: What determines the detection limits of an ELISA assay?
Each ELISA kit has specific detection limits based on protein concentration ranges. Very low protein concentrations are too close to background levels of nonspecific staining and cannot be accurately detected. Very high concentrations may indicate excess protein or antibody was not properly washed away, affecting result accuracy.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:43
ELISA: Components and Principles
4:03
Running an ELISA
7:18
Applications
9:53
Summary
Videos from this collection: