2.9: Plazmid Saflaştırma

Plazmitler dairesel, ekstra kromozomal, DNA molekülleridir ve moleküler biyolojide belirli bir DNA parçası için taşıyıcı veya vektör görevi görürler. Bakteriler plazmitleri çoğaltmak için kullanılır, böylece ilgilendiğiniz DNA seri üretilir. Araştırmacıların bakterilerden plazmitleri elde etme işlemine, bu videoda açıklanacak olan plazmit saflaştırması denir.

Açıkçası, plazmit saflaştırması, plazmitlerin saflaştırılmasını içerir, ancak bu tam olarak ne anlama geliyor? Plazmitleri saflaştırmak için bakteri kromozomundan, proteinlerden, bakteri zarından ve bakteri ribozomlarından izole edilmeleri gerekir.

Plazmitleri saflaştırmak için birçok farklı kit mevcut olsa da, plazmit saflaştırmasının arkasındaki temel prensip herkes için aynı kalır. İlk olarak, seçilen bakteri kolonisi, doğru antibiyotikleri içeren uygun bir kültür ortamında büyütülür. Plazmit tarafından kodlanan bir antibiyotik direnç geni sayesinde, bu ortamda sadece plazmidi içeren bakteriler üreyecektir. Bakteriler hasat edilir ve yüksek pH altında parçalanır. PH nötralize edilir, tuz eklenir ve daha sonra kalıntı ve genomik DNA'yı çıkarmak için karışım döndürülür.

Nötralize hücre lizatı bir silika kolonuna eklenir. Plazmid DNA'nın, güçlü bir anyon olan DNA'nın bir katyon tuz köprüsü yoluyla negatif yüklü kolona bağlandığı anyon değişimi adı verilen bir mekanizma yoluyla kolona yapıştığına inanılmaktadır. Proteinler gibi lizattan elde edilen diğer malzemeler, yüksek tuz tamponları ile kolondan yıkanır. Son olarak, tuz köprüsünü bozan düşük bir tuz tamponu eklendiğinde saflaştırılmış plazmit kolondan salınır.

Bu işlem için laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler giyilmelidir.

İstenilen plazmid DNA ile transforme edilen bakteri kültürleri, 37°C'lik çalkalama inkübatörde uygun antibiyotik ile üreme ortamında gece boyunca büyütülmelidir.

Ertesi gün, bakteri kültürü santrifüjleme ile peletlenir ve süpernatan uzaklaştırılır. Kalan pelet, lizis tamponunda yeniden süspanse edilir.

Yeniden süspanse edildikten sonra, bakteriler lizis tamponunun eklendiği daha küçük bir tüpe aktarılabilir. Lizis tamponu yüksek bir pH'a sahiptir ve bakteri zarlarını bozan ve böylece bakterileri parçalayan sodyum dodesil sülfat gibi deterjanlar içerir. Çözelti, lizis tamponunun eklenmesiyle bulanıklaşacak ve karıştırıldıktan sonra çözelti daha berrak hale gelecektir. Genomik DNA'nın kesilmesi veya parçalanması olasılığı nedeniyle karışım girdaplanmamalıdır, bu da daha sonra plazmit DNA saflaştırmasını kontamine edebilir.

Daha sonra, alkali koşulları nötralize etmek ve pH'ı düşürmek için nötralizasyon tamponu eklenir. Nazikçe karıştırıldığında, genomik DNA ve ona bağlı herhangi bir protein çökelirken, plazmit DNA çözelti içinde kalacaktır. Bir kez daha girdaptan kaçının, böylece plazmitleriniz genomik DNA kontaminasyonundan arınmış olur.

Karışım daha sonra santrifüjlenir ve genomik DNA/protein çökeltisi peletlenir. Süpernatant, plazmid DNA'nın yanı sıra çözünür proteinleri de içerir.

Bu süpernatant, dökmek için süslü bir isim olan boşaltma veya pipetleme yoluyla kolona yerleştirilir. Pelet atılabilir.

Daha sonra, DNA silikaya bağlı kalırken yüksek tuzlu yıkama tamponu kolondan geçer. Yüksek tuz tamponu ile tekrarlanan yıkama adımları, endonükleazları, RNA'yı, proteinleri, boyaları ve düşük moleküler ağırlıklı safsızlıkları giderir. Yıkama adımlarının akışı atılmalıdır. Son yıkama adımından sonra, filtrenin herhangi bir tampon kalmadan tamamen kuru olduğundan emin olun. Plazmit DNA hala filtrenin üzerinde bulunur.

Plazmid DNA, steril su veya bir elüsyon tamponu ile ayrıştırılır. DNA, çok çeşitli uygulamalarda hemen kullanım için hazırdır.

Saflaştırmadan sonra plazmitlerin saflığını doğrulamanın birkaç yolu vardır. Plazmit DNA konsantrasyonunu belirlemek için farklı dalga boylarında absorbansı karşılaştırmak için bir spektrometre kullanılabilir. Saflaştırılmış plazmitin bir agaroz jel analizi, plazmitin doğru boyutta olup olmadığını ve kirletici olup olmadığını belirleyebilir. Bu adım, genomik DNA kontaminasyonu olmamasını ve plazmitin bakterilerde modifiye edilmemesini sağlar.

Plazmid saflaştırma prosedürü, farklı plazmit boyutlarını, kopya sayısını, kültür hacmini barındıracak şekilde değiştirilebilir ve bağlama, yıkama ve elüsyon adımları için farklı ekipman içerebilir. Verim, plazmid preparatları arasındaki en belirgin ayrımlardan biridir ve istenen verime bağlı olarak genellikle mini preparat veya miniprep, midiprep, maxiprep ve megaprep olarak ikiye ayrılır.

Aşağı akış uygulamaları açısından, yaygın olarak plazmit saflaştırmasını takip eden bir prosedür, plazmit DNA'nın ökaryotik hücrelere sokulmasını içeren transfeksiyondur. Genellikle bir transfeksiyon deneyinin amacı, hücrelerin ve dokuların yapısını, burada gördüğünüz görüntülerdeki nöronları etiketleyenler gibi raportör proteinlerle görselleştirmektir.

Bazen birkaç saflaştırma preparatı ile saflaştırılan çoklu plazmitler aynı bakteriye sokulabilir, böylece plazmitler tarafından kodlanan bir dizi enzimin üretimi yoluyla bütün bir biyosentetik yol yeniden üretilebilir. Sonuç, burada gördüğünüz antibiyotik gibi karmaşık bir bileşiğin hücre tarafından üretilmesidir.

Saflaştırılmış plazmitler, plazmit tarafından kodlanan büyük miktarlarda protein üretmek için bakterilere yeniden verilebilir. Burada, hedef proteini izole etmek için afinite saflaştırması adı verilen bir teknik gerçekleştirilmeden önce bakteri hücrelerinin homojenize edildiğini ve parçalandığını görüyorsunuz. Saflaştırılmış protein kristalize edilir ve daha sonra yapısı tanımlanır.

JoVE'nin plazmid saflaştırmasına girişini az önce izlediniz. Bu videoda, bu yöntemin arkasındaki temel ilkeleri, adım adım açıklamasını ve plazmid hazırlığınızın bir avuç uygulamasını tartıştık. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!