2.10: Jel Arıtma

Jel saflaştırma, elektroforetik ayırmadan sonra agaroz jellerden istenen DNA fragmanlarını geri kazanmak için gerçekleştirilen standart bir prosedürdür. Jel fragmanı çözüldükten ve özel bir filtreden geçirdikten sonra, bu prosedür, sonraki uygulamalar için uygun olan tuzlar, serbest nükleotidler ve enzimler gibi safsızlıklardan arındırılmış DNA verir.

Agaroz jelden DNA geri kazanımının arkasındaki temel ilke, bir dizi bağlama, yıkama ve elüte adımını içerir. Jel çözündürücü tampona girdikten sonra, bir "döndürme sütunu" üzerine uygulanır. Bu, santrifüjleme üzerine, safsızlıklar bir toplama tüpüne akarken DNA moleküllerinin seçici olarak bir silika filtreye bağlanmasına izin verir.

DNA, jel çözündürme tamponundaki yüksek tuz konsantrasyonu sayesinde silikaya bağlanabilir. Bu tamponun, filtrenin etrafındaki hidrasyon yapısını bozduğuna ve filtre üzerindeki güçlü negatif yükler ile DNA üzerindeki negatif yükler arasında bir katyon tuzu köprüsü oluşturduğuna inanılmaktadır. Artık safsızlıklar etanol ile yıkanarak giderilir.

Kolona su veya düşük tuzlu tampon eklenir ve ?elute,? ya da ondan DNA'yı serbest bırakmak, muhtemelen katyon köprüsünü bozarak. DNA artık jelden saflaştırılmıştır.

Jel saflaştırma prosedüründeki ilk adım, agaroz jelin dökülmesini ve DNA örneklerinin elektroforezinin gerçekleştirilmesini içerir. Jel çalışması tamamlandıktan sonra, istenen DNA fragmanları UV ışığına karşı görselleştirilir ve fragmanlar bir moleküler ağırlık standardı ile karşılaştırıldıktan sonra seçilir.

Jel lekelenmemişse, bant konumu DNA merdiveni ile yapılan bir karşılaştırmaya dayalı olarak yaklaşık olarak belirlenebilir. Jeli jiletle keserken, mümkün olduğunca az agaroz ile mümkün olduğunca fazla DNA'yı geri kazanmaya özen gösterilmelidir.

Etidyum bromür lekeli jelleri tutarken ve UV ışığının önünde çalışırken eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalıdır. İstenilen DNA'yı jelden kestikten sonra, jeli ve çalışan tamponu kurumsal güvenlik protokollerine uygun olarak uygun şekilde atın.

İzole edildikten sonra, jel parçası bir mikrofüj tüpüne yerleştirilir ve bir terazide tartılır. 100 mg jelin 100 l'yi kapladığı yaklaşımı kullanılarak, jel parçasına jel ağırlığının 4 katı olan bir çözündürme tamponu hacmi eklenir. Tampona yerleştirildikten sonra, jel parçası agarozu eritmek için yaklaşık 50 ° C'de inkübe edilir.

Eritildikten sonra, çözündürülmüş jel bir döndürme kolonuna eklenir ve çözelti santrifüjlenir, bu da tüm DNA ve diğer partiküllerin filtreye yapışmasına neden olur.

Daha sonra, bağlı DNA, filtreye% 70 etanol eklenerek yıkanır, ardından filtreden kalan safsızlıkları giderecek olan santrifüjleme yapılır. Akış atılır ve bu yıkama adımı daha sonra genellikle üç defaya kadar tekrarlanır. Boş filtre, artık etanolü uzaklaştırmak için tekrar döndürülür ve silika filtrenin oda sıcaklığında kurumasına izin verilir. Filtreye su veya elüsyon tamponu eklenir ve başka bir santrifüjleme turu ile saflaştırılmış DNA tüpün dibinde toplanır.

Az önce gördüğünüz yöntem, silika spin kolon filtreleri ile jel saflaştırma için geçerlidir. DNA'nın silikaya bağlanmasının aynı temel ilkelerini ve ardından yıkama ve elüsyon adımlarını kullanan başka yöntemler de mevcuttur. Örneğin, silika, ?cam süt" adı verilen bir süspansiyonda DNA ile karıştırılabilir. peletlenebilir ve yıkanabilir ve daha sonra ayrıştırılabilir. Ayrıca, DNA'yı silika filtrelerden çekmek ve daha sonra onu elüte etmek için emme kullanılabilir. Laboratuvarınızın jel saflaştırma prosedürlerini anladığınızdan emin olun.

Artık agaroz jellerinden DNA'nın nasıl geri kazanılacağını öğrendiğinize göre, jel saflaştırmasından elde edilen DNA'yı kullanan birkaç aşağı akış uygulamasını inceleyelim.

Örneğin, jel saflaştırma, hangi dizilerin düzenlendiğini belirlemek için genomik DNA'yı demetleyen düzenleyici proteinleri izole etmeyi amaçlayan bir teknik olan Kromatin İmmünopresipitasyonda bir ara adımdır. İzole edilen fragmanlar, tek tek kromozom bölgelerine haritalandırılmak üzere jel ile saflaştırılır ve sıralanır.

Alt klonlama - bir geni bir vektörde diğerine taşıma işlemi - jel saflaştırmasını içerebilir. Örneğin, bir vektörden alınan gen dizileri bir yapıdan sindirilebilir ve PCR yoluyla kimerik diziler halinde birleştirilebilir, daha sonra jel saflaştırılır ve diğer yapılara konabilir.

Jel saflaştırmanın belki de en basit uygulaması, -80 ° C'de uzun süreli depolamadan sonra kullanılmasıdır. Elektroforezi takiben eksize edilen DNA bantlarının C'si.

Artık agaroz jelden DNA fragmanlarının nasıl çıkarılacağını, bireysel kullanıcı tercihine göre izlenen bağlama, yıkama ve elüte prosedürlerinin varyasyonlarını ve son olarak bu yöntemin olası aşağı akış uygulamalarından bazılarını öğrendiniz. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkür ederim.