Desenli ve Yaratılış 3D Hücre Kültürü için iki bileşenli Hidrojeller için Thermoresponsive Ters Kalıpları Baskı

Bu prosedürün genel amacı, 3D hücre kültürü için desenli iki bileşenli hidrojeller oluşturmak için bir ters kalıp yazdırmaktır. Bu, ilk olarak, dört santigrat derecede bir sıvı, ancak oda sıcaklığında yumuşak bir jel olan termo tersinir bir polimerden bir ters kalıp basılarak gerçekleştirilir. Bu ters kalıp daha sonra atlatılabilir.

İkinci adım, ters kalıbı tercih edilen bir biyopolimer ile doldurmaktır. Burada aros kullandık. Biyopolimer, enzimatik, UV veya sıcaklık çapraz bağlama ile çapraz bağlanabilir.

Daha sonra, kalıbın soğuk suya batırılmasıyla ters kalıp El ima edilir. Bu adımdan sonra, ortaya çıkan AROS kalıbı daha sonraki işlemler için hazırdır. Son adım, boşlukları hücreler içerebilen ve enzimler, UV ışığı veya sıcaklık yoluyla çapraz bağlanabilen ikinci bir biyopolimer ile doldurmaktır.

Sonuç olarak, mekansal olarak organize edilmiş D hücre kültürü iskeleleri oluşturmak için tekrarlanabilir bir yöntem oluşturduk. Bu yöntem için ilk olarak, bir meslektaşımız Oxr'nin ısıya duyarlı özelliklerinden bir kurban kalıbı olarak yararlanarak yararlanabileceğimizi önerdiğinde aklımıza geldi. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Misha Muah olacak.

Başlamak için, bir cam şişeye 60 mililitre buz gibi soğuk PBS çözeltisi ekleyin ve manyetik bir karıştırma kullanarak kuvvetlice karıştırın. Daha sonra 24.5 gram Paul ER'yi tartın ve küçük miktarlarda soğuk PBS'ye ekleyin. Daha fazlasını eklemeden önce Paul Oxr'un PBS'de kısmen çözünmesini bekleyin.

Tüm Paul Oxr eriyene kadar çözeltiyi karıştırmaya devam edin. Daha sonra, 100 mililitrelik nihai hacme ulaşılana kadar ek buz gibi soğuk PBS ekleyin ve hacim başına ağırlık% 24,5'lik bir nihai konsantrasyon elde edin. Daha sonra karışımı iyice karışana kadar karıştırın.

Çözeltiyi karıştırmayı bırakın ve çözeltideki kabarcıklar ve köpük kaybolana kadar gece boyunca dört santigrat derecede dinlendirin. Jel içinde sıkışan kabarcıklar yazıcı kartuşuna aktarılır ve basılan kurban kalıplarında kusurlara yol açar. Steril Filtre: İğneyi tıkayabilecek istenmeyen parçacıkları gidermek için bir ön soğutma filtresi kullanarak çözeltiyi doğrudan baskı kartuşuna filtreleyin.

Kartuşu deneyden 30 dakika öncesine kadar dört santigrat derecede saklayın. Solenoid valfi ve iğneyi, ultra saf suyla doldurulmuş ayrı 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine yerleştirerek ve 30 dakika boyunca birleştirerek baskıya hazırlayın. Daha sonra temizlenmiş valfleri etanol ile durulayın ve bir nitrojen tabancası ile kurulayın.

Ardından, temiz solenoid valfi ve iğneyi yazıcıya takın. Ayrıca, sistemi test etmek için boş bir temiz yazıcı kartuşu takın. Sisteme üç bar basınç uygulayın ve takılı valf ve iğneden kalan sıvıları basınçlı hava ile üfleyin.

Küçük iğne çapları için. İğneyi tıkayabilecek küçük parçacıkların girmesini önlemek için basınçlı havanın çıkışına bir filtre takın. Ardından basıncı kapatın.

Basınç sıfıra düştüğünde, poli oxr ile önceden yüklenmiş kartuşu takın. Kartuşu monte etmeden yaklaşık 30 dakika önce kartuş buzdolabından çıkarılmalıdır, böylece hala sıvı olan poli oxr yazdırmadan önce oda sıcaklığına ve jele ulaşabilir. Kartuşu çevirerek poli oksr'nin jöleli olup olmadığını kontrol edin.

Ardından, sisteme üç bar basınç uygulayın ve Paul Emer'i iğne ucuna ulaşana ve sürekli bir iplik halinde ekstrüde edilene kadar dağıtın. Bio CAD yazılımını kullanarak, yazıcı yazılımı ayarları menüsünde yazdırmayı düşündüğünüz yapı ile yaklaşık aynı uzunlukta tek bir çizgi çizin. Parametre bölümünde solenoid valfi 50 hertz'lik yüksek bir frekansa ayarlayın ve yüksek basınç ayarını üç bar'a elle ayarlayın.

Ardından, bir cam mikroskobu ayarlayın, yazıcıyı kaydırın ve vakumu açarak yerine sabitleyin. Ardından, dakikada 300 milimetre sahne hızıyla tek bir satırın bir katmanını yazdırın. Her yeni hat için yazılımda yer alan basınç ve frekans ayarlarını el ile azaltarak istenilen hat genişliğini elde edin, hattın sürekli kaldığından emin olun.

Çizilen çizgi kırılırsa alt sınıra ulaşılmıştır. İstenilen genişliğe sahip sürekli bir çizgi elde edildiğinde, yazdırılan yapılardaki kusurları kontrol ederek en uygun aşama hızını ve katman kalınlığını belirleyin. Katman kalınlığına ince ayar yapmak için, basınç ve frekansın da biraz yeniden ayarlanması gerekebilir.

Katman kalınlığı ayarını test etmek için, birkaç katmanı üst üste yazdırın ve iğnenin önceki katmanın üzerinde doğru konumda olduğundan emin olun. Katman kalınlığını, her katman doğrudan bir öncekinin üzerine yazdırılacak şekilde ayarlayın. Aşama hızını optimize etmek için, aşama hızını dakikada 300 milimetreden kademeli olarak düşürerek başlayın, böylece ekstrüde katmanlar öncekilerle aynı konumlarda başlar ve biter.

Sahne alanı çok hızlı hareket ederse, katmanın üst kısmında dalga benzeri bir desen belirir. Sütun yapılarını yazdırmak için CAD yazılımında bir çizgi yerine tek bir nokta çizin. Ardından, baskı hızını en üst düzeye çıkarmak için katman kalınlığını ve sütun çapını ve baskı kafasının adım süresini düzenlemek için basınç ve frekansta ince ayar yapın.

Optimize edildikten sonra, parametreleri daha sonra kullanmak üzere kaydedin. İlk olarak, bu sütun dizisi gibi iç yapıyı bir cam mikroskop lamına yazdırın ve kurumasını bekleyin. Gece boyunca kurutma, yapıların boyutunu ve kalınlığını azaltır ve yapı ile alt tabaka arasında daha iyi yapışma sağlar.

Ertesi gün, atlatmayı ve doldurmayı düşündüğünüz yapıları çevreleyen bir dış duvardan oluşan bir yapı çizin. Polimer duvar, iğnenin boyutları nedeniyle iç yapılardan en az 3,5 milimetre uzağa basılmalıdır. Daha sonra, tamamen çözündükten sonra mikrodalgada ısıtarak deiyonize su içinde %1'lik bir aros karışımı hazırlayın.

Tarımsal çözeltiyi 35 ila 45 santigrat derece arasında soğutun. Daha sonra kurban kalıbını bir pipet kullanarak agro solüsyonla doldurun. Bu, duvarın içindeki yapının tahrip olmasını önlemek için yavaşça yapılmalıdır.

Doldurulduktan sonra, jeli katılaştırmak için kalıbı dört santigrat dereceye yerleştirin. Yaklaşık 10 dakika sonra, jeli buzdolabından çıkarın ve polimer yapısını ortaya çıkarmak için 10 dakika boyunca bir buz banyosuna koyun. Daha sonra yapıyı dikkatlice çıkarın ve kalan suyu bir kağıt mendille kurulayarak çıkarın.

Üçüncü hidrojelin sızmasını önleyen iyi bir sızdırmazlık oluşturmak için yapıyı yeni bir cam mikroskop lamına dikkatlice bastırın. Daha sonra, 0.15 molar sodyum klorür içinde% 1'lik bir aljinat metakrilat çözeltisi hazırlayın. Aljinat metakrilatı çözmek için çözeltiyi girdaplayın.

Ardından hacme %2,5 hacim ekleyin. Alexa, 4 88 konjuge fibrinojen ve hacim başına% 0.05 ağırlık. Floresan yoluyla kolayca görselleştirilebilen üçüncü bir hidrojel elde etmek için lityum fenil 2 4 6 trimetil benzoil fosfat.

Bu çözeltiyi 30 gauge iğne ile donatılmış 0,3 mililitrelik bir şırıngaya yerleştirin. Ardından, kaçan polimerin bıraktığı boşlukları doldurmak için şırıngayı kullanın. İğne her sütundan çekilirken polimeri çıkararak her sütunu tamamen doldurduğunuzdan emin olun.

Son olarak, enjekte edilen polimeri beş dakika boyunca yüksek yoğunluklu bir UV lambası ile fotopolimerize edin ve ardından yapıyı bir epi floresan veya konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin. Burada gösterilen, yeni imal edilene benzer bir yapının, geri doldurmak için kullanılan floresan etiketli aljinatın 3D Zack rekonstrüksiyonudur. Sütun şekilleri yeşil sütunlar olarak görünür ve yapının dış kısmı şeffaftır.

Bu videoda gösterilen teknikler, burada gösterilen eşmerkezli daireler gibi birçok farklı 3B düzenlemeye geniş çapta uyarlanabilir. Çözünürlük, iğne çapına bağlıdır. Bu tasarım için kullanılan 150 mikron çapındaki iğne, çapı 120 ila 200 mikron arasında teller üretebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, oxr yazdırmayla ilgili adımları iyi anlamış olmalısınız. Desen hidrojelleri oluşturmak için oxr'nin kurban kalıbı olarak kullanıldığını gösterdik, ancak polimerin üretimle ilgili bir versiyonu kullanılırsa oxr de UV stabilize edilebilir.