Name: Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Öğrenin, fare yeni doğan korteksi veya yetişkin omuriliğinden primer mikroglia hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için bu yöntemi. Hücreler dinlenme durumuna döner ve immünofloresan mikroskopi ile analiz edilebilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz onların tavsiye ve yararlı yorumlar için Tsirka laboratuar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma JCN RB, bir NSF-3MT IGERT ve LT için bir Turner Tez dostluk ve NSF-3MT IGERT için, 12PRE12060489 SET R01NS42168 tarafından desteklenmiştir.

1. Diseksiyon (Gün 0) <ol><li> Hipotermi ile p0-2 fare yavrular için anestezi neden. Doku dezenfekte% 70 etanol batırılmış bir Kimwipe ile yavrular başkanları silin. </li><li> 10 cm kültür plaka başına 4 yavrular kullanarak, bir makas ile kafaları çıkarın. Buz Hank tampon içeren bir petri başkanları yerleştirin. </li><li> Göz çukurları ile kavisli bir forseps kullanarak kafaları demir ve dikkatli bir şekilde düz microforceps ile kafatası kaplayan deri kaldırmak. </li><li> Değil delinme veya hasar korteks için dikkatli kullanarak, düz microforceps ile kafatası kemikleri çıkarın. En etkili bir şekilde bu bölgede atılır olarak, başın tabanında yer alır beyincik, yanından başlayıp kaldırma başlamak etmektir. </li><li> Küçük bir spatula ile beyin çıkarın ve buz Hank tampon içeren yeni bir petri (4) beyin yerleştirin. </li><li> Bu noktadan itibaren tüm adımları microforceps kullanmak ve bir disse altında gerçekleştirilirction mikroskop. Beynin ventral tarafında başlayarak, beyincik tutarak doku demir ve orta beyin her iki tarafında iki küçük kesiler yapmak. Korteks bu bölgede orta beyin kapak olarak, doku üzerinden tüm yol kesmek için dikkat edin. </li><li> Yavaşça iki korteks gelen tek parça halinde orta beyin ve beyincik kızdırmak. İki korteks içbükey bir şekil oluşturmalıdır. </li><li> Daha fazla diseksiyon için medial yüzü iki korteks ve yönlendirmek tek korteks ayırın. Hipokampus gözlemlemek için zor olabilir, ama korteksin sivri ucunda küçük bir nodül olarak görünen koku ampul karşısında yer almaktadır. </li><li> Bir hilal şekli vardır hipokampus, çıkarın. Sırt tarafında görmek için korteks ters çevirin. </li><li> Bir başlangıç ​​noktası olarak koku ampul kullanarak, tüm zarları ve korteksten koku ampul kendisini kaldırmak. </li><li> Parçalara korteks col 14 ml &#39;si ile 15 ml konik tüp içine yerleştirilmelidirbuz üzerinde d Hank tamponlu tuzlu. </li></ol> 2. Hücre Kültürü (gün 0) <ol><li> 37 ° C&#39;de 3 saat boyunca otoklava su içinde seyreltildi poli-D-lizin (PDL) 5 ug / ml &#39;si ile ön kat 10 cm doku kültür tabaklarında </li><li> Otoklava su ile bir kez PDL ve yıkama plakaları aspire. 20 dakika boyunca doku kültürü kaputu UV altında kuru plakası. Bu adım, diseksiyon işlemi hemen önce yapılmalıdır. </li><li> 4 Brain her birinden korteks içeren tüpler aspire Hank tampon 1x tripsin / EDTA çözeltisi, 4 ml uygulamak ° C inkübatör 15 dakika boyunca 37 P1000 ucu ve yerine borular ile doku çiğnemek. </li><li> Enzimatik sindirim, mix, durdurmak ve 5 dakika boyunca 1.5K rpm içeriğini aşağı dönmeye tüp başına tam mikrogliyal medya 4 ml ekleyin. </li><li> Süpernatant aspire ve eksiksiz bir medya 4 ml yıkama tekrarlayın. 40 mikro 10 ile tam bir ortam mikroglial ml (% 10 FBS DMEM,% 1 sodyum piruvat,% 0.08 gentamisin), ve filtre hücrelerin tekrarn örgü hücre süzgecinden. </li><li> 37, bir doku kültürü inkübatöründe 10 cm doku kültürü plakası ve yerine 10 ml başına 8 korteks yoğunluğunda Plaka ° C ve% 5 CO2 (Yetişkin Mikroglia protokolü bakınız). </li></ol> (Gün 3) <ol><li> Tam mikrogliyal medya ile tüm hücre kültürü yemekleri ortamı değiştirin. </li></ol> (Gün 10) <ol><li> 60 mM 400 mikrolitre 10 cm doku kültürü plakaları, orta ve 10-15 dakika için oda sıcaklığında (RT) inkübe HBSS (mikroglia ayırmak için), lidokain ekleyin. </li><li> Plakadan medya / hücre süspansiyonu toplayın ve Hank tamponu ile bir kez plaka yıkayın. Kalan mikroglia kurtarmak için yıkama tamponu toplayın. </li><li> 50 uM veya bir 1/100 dilüsyon nihai bir konsantrasyona hücre süspansiyonu 5 mM EDTA (pH 8.0) ilave edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 1000 xg (1500 rpm) hücre süspansiyonu aşağı Spin ve% 1 FBS ile 1 ml DMEM yeniden askıya. </li><li> (Canlı hücre sayısını Yetişkin Mi görecroglia 3.1/3.2) ve istenen deney yoğunluğunda doku kültürü plakaları halinde bölünmüş hücreleri. Yaklaşık 1x10 6 mikrogliya 4 beyninden korteks içeren 10 cm plaka hasat edilir. Immünofloresans için, 18 mm lamel başına 2.5x10 4 hücre yoğunluğunda tavsiye edilir. </li><li> Mikroglial hücreleri için en az 24 saat tam kullanmadan önce kendi dallanmış, dinlenme durumuna geri dönmek için izin verin. </li></ol> Protokol Yazı: (Yetişkin Mikroglia) 1. Doku Toplama <ol><li> 37 °, 3 saat boyunca poli-D-lizin (PDL) ile kaplayın doku kültürü plakaları ° C ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de Otoklava bir kez su ile kullanılmadan hemen önce plakalar, yıkama. </li><li> CO 2 boğulma ve ötenazi eksiksiz olduğunu tespit tarafından fare Euthanize. % 70 etanol ile omurilik alanı temizleyin. </li><li> Bir makas kullanarak omurilik üstüne deri kesilir, sonra bölge T1 T12 için omurilik kesip geçin. Kesmekomurilik tarafın kalan kas kapalı. </li><li> Yavaş yavaş hafifçe parmak uçlarınızla omurilik tutmak olarak microscissors kullanarak vertebra kesti. Doku çok yumuşak olduğu gibi delinme omurilik için dikkatli olun. Yavaş yavaş microforceps kullanarak omurilik ayıklayın. </li><li> Buz HBSS içeren bir petri Batmak omurilik. Bir ışık mikroskobu kullanarak microforceps kullanan tüm görünür zarları çıkarın </li><li> Çeşitli parçaları üretmek için küçük çapraz bölümler halinde omurilik kesin. Parçaları kalınlığı etkin sindirim kolaylaştırmak için 2 mm&#39;den fazla olmamalıdır. 1 ml buz gibi soğuk HBSS içeren 15 ml konik bir tüp omurilik parçaları aktarın. Sindirim adım kadar buz üzerinde tüp tutun. </li></ol> 2. Doku sindirimi <ol><li> Omurilik dokusu içeren 15 ml konik tüp HBSS aspire. Doku herhangi bir parça aspire için dikkatli olun. </li><li> Tripsin (2 1 ml ilave edilir.5 g / L, ışınlanmış domuz tripsin ve HBSS içinde 0.2 g / L EDTA) ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Sindirim tripsin çıkarın ve enzimatik sindirim durdurmak için serum içeren birincil mikroglia orta 3 ml ekleyin durdurmak için. </li><li> Pipet yukarı ve aşağı doku çıkarmak için. 40 mikron hücre süzgecinden kullanılarak hücre süspansiyonu filtre. </li></ol> 3. Hücre Sayım ve Kaplama <ol><li> Hücre süspansiyonu ve DAPI çözeltisinin eşit bir hacmi karıştırın. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> 5-7x10 5 hücre / PDL kaplı 35 x 10 mm yemekleri ml arasında bir yoğunlukta plaka. Hücreler 35 x 10 mm tabaklar ile karşılaştırıldığında daha küçük bir alana sahip 12 oyuklu plakalar içinde kültürlendi bile daha düşük bir yoğunlukta Kaplama hücre büyümesini engellemiştir. </li></ol>

<ol><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Physiology%3A+Unique+Stimuli%2C+Specialized+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses.</a> Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330, (2010).</li>
<li>Kraft, A. D., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+microglia+and+neuroinflammation+relevant+to+environmental+exposure+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Env.+Res.+Pub.+Health%22%5BJournal%5D)">Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity.</a> Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).</li>
<li>Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+shape+adult+hippocampal+neurogenesis+through+apoptosis-coupled+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis.</a> Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).</li>
<li>Emmetsberger, J., Tsirka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+inhibitory+factor+%28MIF%2FTKP%29+mitigates+secondary+damage+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury.</a> Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).</li>
<li>Gao, Z., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+MS+Reveal+Multiple+Roles+of+Microglia+in+Disease+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis.</a> Neurol Res. Int. , 383087(2011).</li>
<li>Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X4R%2B+microglia+drive+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">P2X4R+ microglia drive neuropathic pain.</a> Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).</li>
<li>Olson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+by+microglia+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune response by microglia in the spinal cord.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).</li>
<li>Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+inflammation+in+the+brain+and+spinal+cord+following+mechanical+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury.</a> J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).</li>
<li>Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ex+vivo+nitric+oxide+production+by+acutely+isolated+neonatal+and+adult+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia.</a> J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).</li>
<li>Brannan, C. A., Roberts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+microglia+from+adult+mice+are+refractory+to+nitric+oxide-inducing+stimuli+due+to+impaired+NOS2+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression.</a> Glia. 48, 120-131 (2004).</li>
<li>Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+microglia+isolation+from+mixed+glial+cell+cultures+of+neonatal+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue.</a> J. Vis. Exp. (66), e3814(2012).</li>
<li>Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+culture+system+that+supports+adult+microglial+cell+proliferation+and+maintenance+in+the+resting+state%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state.</a> J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).</li>
<li>Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+actively+regulate+the+number+of+functional+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Microglia actively regulate the number of functional synapses.</a> PLoS One. 8, e56293(2013).</li>
<li>Tremblay, M. -È, Majewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+microglia+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Comm.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for microglia in synaptic plasticity.</a> Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).</li>
<li>DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+microglial+phagocytosis+of+senile+plaque+cores+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expt.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer's disease.</a> Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).</li>
<li>Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-12+production+by+central+nervous+system+microglia+is+inhibited+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes.</a> J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).</li>
<li>Min, K. -J., Yang, M. -S., Kim, S. -U., Jou, I., Joe, E. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+induce+hemeoxygenase-1+expression+in+microglia%3A+a+feasible+mechanism+for+preventing+excessive+brain+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation.</a> J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).</li>
<li>Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101, 1155-1163 (2003).</li>
<li>Ekdahl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+-+tuning+and+pruning+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Microglial activation - tuning and pruning adult neurogenesis.</a> Front Pharmacol. 3, 14(2012).</li>
<li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55, 412-424 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Mikroglia MSS normal işleyişi yanı sıra çeşitli patolojiler için inflamatuar yanıtları modüle. Mikroglia tarafından fonksiyonel sinaptik yeniden normal beyin dengesinin 15 bakım sorumlu tutulmuştur. Nörojenik kaskad sırasında, hipokampus 4, 16 dentat girus gelen nöral progenitör hücrelerin boşluk katılmak. Bu nedenle, mikrogliya birden fazla ayrı işlevlere sahip olan boyunca gelişim ve yetişkinlik büyük tarama alanı kapsayacak yenidoğan ve yetişkin mikroglia, çalışma hangi bir kültür sistemi gelişt...

Mikroglia en yakın yapı ve fonksiyon 1 periferik makrofaj benzeri MSS, yerleşik bağışıklık hücreleri bulunmaktadır. Son zamanlarda doğum sonrası mikroglial hücreleri ilkel myeloid öncü hücrelerden elde ve doğum sonrası hematopoetik ataları yetişkin beyin 2 mikroglia kaynağı olduğu önceki kavramı upending, embriyogenez sekizinci gün önce oluşturulan olduğu gösterilmiştir. Onlar çeşitli nörolojik hastalıklarda önemli rol oynayan ve hızlı bir şekilde pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar sitokinler 3 bırakarak enfeksiyon veya yaralanma yanıt verebilir. Böylece mikroglia hastalığın ilerlemesini etkileyecek manipüle edilebilir MSS bağımsız bir birim kapsayacak. Izole etmek için sağlam ve üretken kültür ve yenidoğan veya yetişkin mikroglial hücreleri geliştirme ileri çalışmalar için önemlidir. Mikroglia beyin patolojilerinin bir dizi kritik oyuncu olduğu bilinmektedir. Daha yakın zamanda, roles hipokampus 1, 4 dentat girus gelen mikroglia fagosite aşırı nöral progenitör hücrelerin normal beyin gelişimi ve işlevi hücreleri için ortaya çıkmaktadır. Mikroglia da MS gibi omurilik etkileyen çeşitli nörolojik koşulları, nöropatik ağrı, ve spinal kord yaralanması 5-7 modüle olabilir. Omurilik mikroglia yerel ortamda farklılıklar nedeniyle muhtemelen aktivasyon sinyalleri 8, 9, yanıt olarak beyin mikrogliya göre farklı şekilde etkiler. Bu nedenle in vitro kültür sisteminde uygun bir tesis ve omurilik mikroglia incelemek için önemlidir. Yenidoğan mikroglia, IFN-γ, TNF-a ya da 10,11 bazı hastalıkların bağlamında mikroglia incelemek için yetişkin hücrelerin kullanımı ihtiyacını daha vurgulayarak. Ile in vitro stimülasyondan sonra yetişkin hücrelere kıyasla, pro-inflamatuar sitokin, nitrik oksit önemli ölçüde daha fazla üretmek Biz cu laboratuarda istihdam protokolüLTURE yenidoğan mikroglia hücre kültürü şişesi 12 yüzeyinden mikrogliya kaldırmak için bir çaba karışık glial kültürlerin sallayarak kullanmak en yeni tekniklerin bir çeşididir. Ayrıca, ilk Yip ve ark 13 ile tarif edilen bir protokole göre yetişkin fare omurilik kültürüne mikroglia için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, mevcut diğer protokolleri 14 ile karşılaştırıldığında kültür yetişkin hücrelere daha hızlı bir yol sağlar. Sonuçta elde edilen müstahzarlarda% 70 mikroglia olan, geri kalan yüzde astrositler oluşmaktadır. Bizim kültür saflığının başka yayınlanmış yöntemler 13 kıyasla daha düşük olmasına rağmen, bu kültür sisteminde özellikle omuriliği ve hastalıkların çalışması için çeşitli aktive edici uyaran hem de kültür yanıt olarak mikroglial keşfetmek için yararlı olan güçlü bir hangi inflamatuvar yanıt bir ana özelliğidir. Açıklanan tüm protokoller Stony Brook üniversite tarafından onaylanmıştırty IACUC.

<table><tbody><tr><td>EDTA, 5mM</td><td>Invitrogen</td><td>15567-028</td><td></td></tr><tr><td>Lidokain, 60mM</td><td>Sigma</td><td>L-5647</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin / EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 1X</td><td>Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Cellgro</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin Sülfat</td><td>Biowittaker</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10mm doku kültürü kabı</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin, 100 & mu; g/ml</td><td></td><td></td><td>Seyreltik 1:20</td></tr><tr><td>HBSS, 1X</td><td>Cellgro</td><td>20-023-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

yenidoğan ve erişkin merkezi sinir sisteminin kültüre mikroglia

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Mikroglia gibi, bu MSS gelişiminde olgunlaşma, multipl skleroz ve spinal kord yaralanması gibi fizyolojik ve patolojik süreçlerde kritik önemli rolleri olan, merkezi sinir sistemi (MSS) yerleşik makrofaj benzeri hücreler ve. Mikroglia aktif ve MS veya inme kaynaklanan iskemik beyin travması görüldüğü aksonal hasar nöronal yaralanma veya stimülasyon, harekete için işe edilebilir. MSS Bu bağışıklık üyeleri de patolojik olmayan koşullarda sinaptik plastisite rol olduğu düşünülmektedir. Biz diğer merkezi sinir sistemi hücre tipleri ve hücre kültürü enkaz varlığı olarak karıştırıcı değişkenler, en aza indirirken canlı hücre sayıları en üst düzeye çıkarmak amaçlanmıştır yenidoğan ve yetişkin dokulardan kültür mikrogliya için protokolleri kullanır. Biz tüm süreci uygulanabilir ve tekrarlanabilir hale getirir büyük ve kolayca ayırt MSS bileşenleri (örneğin korteks, spinal kord segmentleri), kullanmaktadır. Yetişkin hücrenin kullanımınıbirçok patolojiler özellikle doğum sonrası omurilik etkiler okudu olarak s, neonatal beyin mikroglia kullanımına uygun bir alternatiftir. Bu kültür sistemleri de doğrudan ya da inhibe etmek veya mikrogliyal aktivasyonun teşvik edebilir bileşiklerin etkisini test etmek için yararlıdır. Mikrogliyal aktivasyonun, yetişkin merkezi sinir sisteminde hastalıkların sonuçları şekil bu yana, neonatal ve yetişkin mikroglia kültürlenir ve incelenmiştir edilebileceği in vitro sistemler için bir ihtiyaç vardır.

<html> Dinlenme ve aktive mikroglial hücreleri bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Mikroglia kaplama sonra 24 saat görüntülendi (Şekil 1a) ve dallanmış (dinlenme) morfoloji gösterirler edildi. Astar reaktif maruz kalmak, hücreler olarak mikrogliyal morfolojisi değişiklikler bakteriyel lipopolisakkarid (LPS) sonuçları (Şekil 1b) aktif olur. Kaplama için hücre sayımı bir örnek Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Hücre artıklar...

Biz neonatal serebral korteks ve yetişkin omurilik canlı mikroglia verimli ve hızlı izolasyon / kültür yöntemleri özetlemektedir. Kortikal mikrogliya diseksiyonu ve kaplama ilk diseksiyonu sonrasında yer ~ 10 gün alarak sonraki mikrogliyal hasat ile, 90 dakika içinde yapılabilir.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Bu prosedürün genel amacı, neonatal fare korteksinden veya yetişkin bir farenin spinal kordundan primer mikroglial hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle postnatal sıfırıncı veya ikinci gündeki bir fare yavrusunun beyninin veya yetişkin bir farenin spinal kordunun çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, neonatal dokudan korteksler toplanır veya spinal kord dokusu sindirilir.Kortikal ve spinal doku hücreleri daha sonra deneysel kullanım aşamasına kadar kültüre alınır. Nihayetinde, toplanan neonatal ve yetişkin mikroglial hücreler immünofloresan mikroskopi ile analiz edilebilir. Neonatal mikroglial kültür protokolümüzün, karışık kortikal plaklar için mikroglial hücrelerin çalkalanması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücrelerin kolayca dinlenme durumuna geri dönebilmesi ve in vivo mikroglial hücre davranışının daha doğru bir resmini sunabilmesidir.Yetişkin omuriliğinden elde edilen mikroglia kültürünün temel avantajı, hücrelerin öncelikle yetişkin merkezi sinir sistemini etkileyen patolojiler bağlamında değerlendirilebilmesidir. Diseksiyon öncesinde, 10 santimetrelik doku kültürü kaplarını, otoklavlanmış suda seyreltilmiş mililitrede beş mikrogram polilizini veya

culturing-microglia-from-the-neonatal-and-adult-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Beynin hücresel heterojenite birincil mikroglia Yalıtımlı fizyolojik ve patolojik hem de kendi rolünü araştırmak için esastır. Bu protokol bir mekanik izolasyon ve yüksek verim ve yüksek saflıkta sağlar karışık hücre kültürü tekniği için geçerli birincil mikroglia hücreleri...

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Video, yenidoğan bir fare beyninden hücreleri izole etme ve kültürleme yöntemini gösterdi. Beynin enzimatik ve mekanik ayrışmasını ve ardından karışık bir glial popülasyon elde etmek için nöronal büyüme faktörü olmayan büyüme ortamında kültürlemeyi içeriyordu.

Yenidoğan Fare Beyninden Karışık Glial Hücre Kültürü Elde Edilmesi

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücrelerin patolojik değişiklikleri kapsar. Bu hücrelerin in vitro incelenmesi için, yetişkin omurilik dokusu elde edilir ve tasarlanmış güvenilir bir glial kültür sistemi yoksundur. Bu nedenle, biz yetişkin fare omurilik dokusu primer karışık glial kültürlerin nasıl kurulabileceğini burada gösteriyor.

Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Bu protokol, canlı, yetişkin, insan beyin dokusundan birincil mikroglia izole etkili, uygun maliyetli ve sağlam bir yöntemdir. İzole birincil insan mikroglia homeostaz ve hastalık hücresel süreçleri incelemek için bir araç olarak hizmet verebilir.

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Bu protokol, embriyonik 15-16. günlerde fare embriyolarından izole edilen primer nöronal hücrelerden ve doğum sonrası 1-2. günlerde yenidoğan farelerinin beyinlerinden üretilen primer mikrogliadan kurulan bir mikroglia-nöronal ko-kültürü tanımlar.

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Biz Gram-negatif bakterilerden lipopolisakkarid (LPS) arıtılması için modifiye edilmiş bir sıcak sulu-fenol ekstraksiyon yöntemi açıklar. Bir kez çıkarılan, LPS sonradan SDS-PAGE ile analiz ve direkt boyama ya da Batı immunoblotting tarafından görüntülenebilir.

Sıcak Sulu-fenol Ekstraksiyon tarafından Gram-negatif bakteriler arınma ve Lipopolisakkaritlerinin Görselleştirmesi

Öğrenin, fare yeni doğan korteksi veya yetişkin omuriliğinden primer mikroglia hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için bu yöntemi. Hücreler dinlenme durumuna döner ve immünofloresan mikroskopi ile analiz edilebilir.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Daha fazla video keşfet