Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Bu prosedürün genel amacı, primer mikroglial hücreleri yenidoğan fare korteksinden veya yetişkin bir farenin omuriliğinden izole etmektir. Bu, önce doğum sonrası bir gün sıfır veya iki fare yavrusunun veya yetişkin bir omuriliğin beynini çıkararak gerçekleştirilir. Daha sonra ya korteksler yenidoğan dokusundan alınır ya da omurilik dokusu sindirilir.

Kortikal ve omurilik dokusu hücreleri daha sonra deneysel kullanıma kadar kültürlenir. Sonuçta, hasat edilen yenidoğan ve yetişkin mikroglial hücreler, immünofloresan mikroskobu ile analiz edilebilir. Yenidoğan mikroglial kültür protokolümüzün, karışık kortikal plakalar için mikroglial hücrelerin çalkalanması gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, hücrelerin kolayca dinlenme durumuna dönmesi ve in vivo olarak mikroglial hücre davranışının daha doğru bir resmini sağlayabilmesidir.

Erişkin omurilikten alınan mikrogliadaki kültürün temel avantajı, hücrelerin esas olarak erişkin merkezi sinir sistemini etkileyen patolojiler bağlamında gösterilebilmesidir. Otoklav suyunda seyreltilmiş mililitre başına beş mikrogram poli de lisin veya PDL içeren Preco 10 santimetre doku kültürü kapları 37 santigrat derecede üç saat sonra, PDL'yi aspire edin ve yenidoğan mikroglia diseksiyonuna başlamadan hemen önce plakaları bir kez otoklav suyuyla yıkayın. Plakaları UV ışığı altında bir doku kültürü başlığında 20 dakika kurutun.

Ardından, kafaları bir makasla çıkardıktan sonra anestezi uygulanmış doğum sonrası sıfır ila iki yavrunun kafalarını dezenfekte etmek için% 70 etanole batırılmış bir Kim mendili kullanın. Buz gibi soğuk çileler tamponlu tuzlu su çözeltisi içeren 10 santimetrelik Petri kaplarına plaka başına dört kafa yerleştirin. Kavisli forseps kullanarak, kafaları göz yuvalarından geçirin ve ardından kafatasını kaplayan cildi dikkatlice çıkarmak için düz mikro forseps kullanın.

Daha sonra beyinciğin yanından başlayarak, korteksleri delmemeye veya zarar vermemeye dikkat ederek kafatası kemiklerini çıkarın. Beyinleri çıkarmak için küçük bir spatula kullanın, organları buz gibi soğuk HBSS içeren taze bir Petri kabında toplayın. Şimdi beynin ventral tarafından başlıyor.

Dokuyu sabitlemek için beyinciği mikro forseps ile tutun ve ardından dokuyu tamamen kesmeden orta beynin her iki tarafında iki küçük kesi yapın. Orta beyni ve beyinciği, içbükey bir şekil oluşturması gereken kortekslerden tek parça halinde nazikçe kızdırın. Daha sonra izole korteksleri ayırın ve daha fazla diseksiyon için medial tarafı yukarı bakacak şekilde tek bir korteksi yönlendirin.

Hem yenidoğan hem de erişkin protokollerinde, en karmaşık adımlardan biri meninkslerin yeterli şekilde çıkarılmasıdır. Hipokampusu çıkarmak da zordur. Yenidoğan protokolünde, dokuları sertleştirmek için buz gibi çileli tamponlu salin solüsyonu kullanıyoruz ve ayrıca parçalamayı en aza indirmek için yavaş, metodik bir diseksiyon prosedürü kullanıyoruz.

Korteksin sivri ucunda küçük bir nodül olarak görünen koku soğancığının karşısında bulunan hilal şeklindeki hipokampusu çıkarın. Ardından sırt tarafını görmek için korteksi ters çevirin. Daha sonra, koku ampulünü başlangıç noktası olarak kullanarak, tüm meninksleri ve koku ampulünün kendisini korteksten çıkarın.

Daha sonra diseke korteksleri buz üzerinde 14 mililitre buz gibi HBSS içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe çekin. Şimdi HBSS'yi Cordis'ten aspire edin ve korteksleri birkaç kez tritrate etmek için bir P 1000 pipet ucu kullanın. Dokulara dört mililitre tripsin EDTA ekleyin ve ardından dokuları 37 santigrat derecede inkübe edin.

15 dakika sonra, enzimatik reaksiyonu dört mililitre tam mikroglial ortam ile durdurun ve ardından hücre süspansiyonlarını 1000 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca döndürün. Dört mililitre tam ortam resüsü ile ikinci bir yıkamadan sonra, hücre peletini 10 mililitre tam mikroglial ortamda askıya alın ve ardından hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir ağ hücre süzgecinden süzün. Son olarak, hücreleri PD L kaplı 10 santimetrelik doku kültürü plakalarından birinde 10 mililitre mikroglial ortam başına sekiz korteks yoğunluğunda kaplayın ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

10 günlük hücre kültüründen sonra, doku kültürü plakasına HBSS'de 400 mikrolitre 60 milimolar lidokain ekleyerek mikrogliayı ayırın ve plakayı oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe edin. Sonra yeniden askıya alınan hücreleri toplayın. Plakayı HBSS ile bir kez durulayın ve kalan mikrogliaları geri kazanmak için yıkamayı toplayın.

Daha sonra, hücre süspansiyonuna beş milimolar final konsantrasyonuna 0.5 molar EDTA ekleyin ve ardından hücreleri resüsle döndürün. Damağı% 1 FBS ile bir mililitre DMEM'de askıya alın ve trian mavisi dışlama ile canlı hücrelerin sayısını belirleyin. Daha sonra hücreleri istenen deney yoğunluğunda kültürleyin.

Örneğin, immünofloresan mikroskopi plakası ile analiz için, hücreler yetişkin mikroglia doku koleksiyonu için 18 milimetre kapak kayması başına 2.5 kez 10 ila dördüncü hücredir. Ötenazi uygulanmış yetişkin bir farenin omurgasını temizlemek için% 70 etanol kullanarak başlayın. Daha sonra omuriliğin üzerindeki cildi kesmek için bir makas kullanın ve kordonu T 1'den T 12'ye kadar kesmeye devam edin.

Omuriliğin kenarlarından kalan kası kesin ve ardından omuriliği bir elinizin parmak uçlarıyla nazikçe tutun. Kordonu delmeden omurları yavaşça kesmek için mikro makas kullanın. Daha sonra omuriliği yavaşça çıkarmak için bir çift mikro forseps kullanın, kordonu buz gibi soğuk HBSS içeren bir Petri kabına batırın ve ardından mikroskop altında tüm görünür meninksleri çıkarın.

Şimdi omuriliği, verimli sindirimi kolaylaştırmak için iki milimetreden daha kalın olmayan enine segmentler halinde kesin ve ardından parçaları, buz üzerinde bir mililitre buzla soğutulmuş HBSS içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Omurilik dokusu parçalarını sindirmek için, dokuyu rahatsız etmemeye dikkat ederek, HBS'yi omurilik dokusundan aspire ederek başlayın. Daha sonra dokuyu 37 santigrat derecede bir mililitre tripsin içinde inkübe edin.

30 dakika sonra, tripsini çıkarın ve enzimatik sindirimi durdurmak için serum içeren üç mililitre birincil mikroglia ortamı ekleyin. Dokuyu çıkarmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetledikten sonra, hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün. Daha sonra hücre süspansiyonunun bir alikotunu eşit hacimde DPI ile karıştırın ve toplam canlı hücre sayısını belirlemek için hücreleri bir floresan mikroskop altında sayın.

Son olarak, ayrışmış omurilik dokusu hücrelerini uygun deneysel yoğunlukta PD L kaplı plakalara koyun. Fazla hücre kalıntılarını gidermek için kaplamadan dört saat sonra tam bir ortam değişikliği yapın. Bu ilk görüntü setinde, dinlenme ve aktive edilmiş mikroglial hücreler, mikroglia sergisinin kaplanmasından 24 saat sonra, dallanma veya paslanma morfolojisine maruz kaldıktan sonra, astar reaktifi bakteriyel lipopolisakkarit'e maruz kalma, hücreler aktive oldukça mikroglial morfolojide daha amipoid bir şekle dönüşmeyle sonuçlanır.

Makrofaj ve mikroglial hücre yüzey proteinine özgü bir işaretleyiciyi boyayan ve yeşil renkte görünen göz küresi, hücrelerin görüntülenmesini kolaylaştırır. Parlak alan görüntüsü, genel hücre popülasyonlarını gösterir ve mavi renkli DPI, çekirdekleri vurgular ve kültürün saflığını gösterir. Yetişkin bir fare omuriliğinden izole edilen hücrelerin bu temsili görüntüsünde, yaklaşık yedi kez 10 ila beşinci canlı hücre elde edildi.

Parlak alan ve floresan mikroskobu ayarları, DAPI pozitif hücrelerin yanı sıra doğru bir hücre sayımı için hemo sitometre ızgarasını görselleştirmek için birleştirildi. Mikroglia, yaklaşık iki gün sonra PD L kaplı kültür plakalarına tamamen bağlanır. Buradaki kültürde, mikroglia ve makrofaj promotörü CSF one R'nin kontrolü altında GFP'yi eksprese eden Mac yeşil farelerinin omuriliğinden izole edilen mikroglia, parlak alan görüntüsünde gösterilmiştir.

Mavi oklarla gösterilen mikroglia ve kırmızı oklarla gösterilen astrositler, ustalaştıktan sonra gözlemlenebilir. Bu işlemi takiben yaklaşık bir saat içinde bu teknik tamamlanabilir. Mikroglia'nın diğer hücreler üzerindeki etkisini incelemek için kültürleşme, diğer hücre tipleriyle birlikte mikroglia gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü takiben, neokortikal ve yetişkin omurilik hücrelerini kültürlemek için gerekli olan hassas diseksiyonun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamalı ve bu hücreleri aşağı akış uygulamalarında kullanmalısınız.