2.11: Batı Lekesi

Western Blotting, antikorlar kullanarak elektroforetik olarak ayrılmış bir numunede spesifik proteinlerin varlığını tanımlamak için birçok araştırmacı tarafından kullanılan güçlü bir tekniktir.

Bu tekniğin kaliteli bir sonuç için gerekli olan 3 ana aşaması vardır: Elektroblotlama, İmmünoblotlama ve Tespit. Bu aşamalar denenmeden önce, denatüre proteinlerin bir poliakrilamid jel içinde boyutlarına göre ayrıldığı SDS-PAGE yapılmalıdır.

Elektroblotlama, aynı zamanda Batı "transferi" olarak da bilinir ve "sandviçi" bir arada tutmak için bir transfer kasetinin yanı sıra proteini bir akrilimit jelden ince bir zara aktarmak için bir aparat gerektirir. Elektroblotlama sandviçi, jel ve iki parça filtre kağıdı arasına sıkıştırılmış özel bir zardan oluşur. Transfer sırasında, proteinleri jel boyunca hareket ettirmek için bir elektrik alanı kullanılır, burada yüklü ve hidrofobik etkileşimler nedeniyle bir zar üzerinde sıkışıp kalırlar.

İmmünoblotlama, spesifik proteinler için zarı "araştırmak" için antikorlar kullanır. Antikorlar, diğer proteinlere bağlanan ve Fab bölgeleri olarak da bilinen iki parça içeren büyük Y şeklinde proteinlerdir. Fab bölgesi, bir antikorun bağlanacağı spesifik epitopu veya bir proteinin spesifik kısmını tanımlar.

Monoklonal antikorlar, tek bir epitopu tanıyan antikorlardır ve özgüllükleri nedeniyle immünoblotlama için tercih edilen antikor tipidir. Buna karşılık, poliklonal antikorlar, aynı antijen veya bir antikorun özgüllüğüne sahip olduğu protein üzerindeki birçok epitopu hedef alan bir dizi farklı antikordur. Doğrusal bir epitopu tanıyan monoklonal antikorlar, epitopun denatüre veya doğrusallaştırılmış bir protein üzerinde bulunabilmesini sağladığı için tercih edilir. Bu önemlidir, çünkü birçok antikor yalnızca konformasyonel epitopları tanır, bu da proteinleri yalnızca doğal 3D durumlarında tanıdıkları anlamına gelir.

Fab fragmanlarına ek olarak, antikorlar, antikoru üreten hayvana özgü bir Fc bölgesi içerir. İmmünoblotlamada, bu bölge esas olarak ikincil bir antikor için epitop olarak kullanılır - tespit etmeye çalıştığınız proteine bağlanan ilk antikoru tanıyan bir antikor.

Gözlemlenebilir bir sinyal üretmek için, antikorlar genellikle Fc bölgeleri aracılığıyla alkalin fosfataz veya yaban turpu peroksidaz gibi bir raportör enzime bağlanır. Bu raportör enzimler, renk değişikliklerine neden olmak veya ışık değişiklikleri üretmek için substratlarla reaksiyona girerek sinyaller üretir.

Bu değişiklikler daha sonra dansitometri kullanılarak ölçülebilir. Dansitometri, her bir bandın yoğunluğunu hesaplamak için görüntü analiz yazılımı kullanarak bir protein bandının yoğunluğunu ölçmek için kullanılan tekniktir. Bantlar daha sonra referans standartlar kullanılarak doğrudan ölçülebilir veya bir kontrol numunesi kullanılarak dahili olarak kontrol edilebilir.

Başarılı bir Western transferi için, jel önce 15 dakika boyunca transfer tamponunda dengelenir. Membran ayrıca üretim talimatlarına göre dengelenmelidir.

Daha sonra, jel transfer sandviçi, kabarcıkların sistem içinde sıkışmasını önlemek için transfer tamponunda dikkatlice hazırlanır. Sandviçin içine sıkışan baloncuklar, küçük bir pipetle üzerlerine yuvarlanarak dışarı çıkarılabilir. Küçük kabarcıklar bile proteinlerin transferini kesintiye uğratabilir ve bu zarın alt kısımlarında görülebileceği gibi eksik transfere neden olabilir.

Monte edildikten sonra, transfer haznesine ek transfer tamponu dökülür ve 2-3 saat boyunca 20-30 mA'da çalıştırılır. Transfer tamponu, proteinlerin zara bağlanmasını artıran metanol içerir.

Transfer tamamlandıktan sonra kaset demonte edilir ve transferin kalitesi Ponceau S gibi spesifik olmayan bir protein boyası kullanılarak kontrol edilebilir. Bu, protein bantlarının hızlı ve geri dönüşümlü bir şekilde algılanmasını sağlar.

İmmünoblotlamanın ilk adımı, zarın kalan alanlarını seyreltik bir protein çözeltisi ile kaplamaktır. Bu aşama bloke etme olarak adlandırılır ve zarı bloke etmek ve antikorun zara spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için gerçekleştirilir. Tipik olarak, bloke edici çözelti, tamponlu bir tuzlu su çözeltisi içinde çözülmüş sığır serum albümininden veya yağsız kuru sütten oluşur. Bu adım genellikle bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat ila gece boyunca yapılır.

Bir sonraki adım, zarın, bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edilmesidir. Bu adım 30 dakikadan gece boyunca sürebilir ve hafif bir ajitasyon ile yapılmalıdır.

Daha sonra, spesifik olmayan arka plan lekelenmesini azaltmak için zar iyice durulanır ve ikincil antikor, zara bloke edici tampon olarak eklenir. Kısa bir inkübasyondan sonra, zar tekrar iyice durulanır.

İkincil antikorlar, kendilerine bağlı olan raportör enzimler sayesinde tespit edilebilir. Doğru substratın eklenmesi üzerine, kolorimetrik veya kemilüminesan değişiklikler görüntülenebilir ve daha sonra dansitometri teknikleri kullanılarak ölçülebilir. Ek olarak, protein merdiveni, her bir proteinin doğrusal boyutunun, merdivendeki boyut belirteçlerine göre jel içinde ne kadar göç ettiğine bağlı olarak tahmin edilebilmesi için değerli bir boyut referansı sağlar. İmmünoblotlama yoluyla tespit edilen proteinlerin boyutunu gözlemlemek, antikorun doğru proteini tanıdığını ve görülen proteinin bir monomer mi yoksa çoklu bir kopyası mı olduğunu doğrulamanın iyi bir yoludur.

Bir numune içindeki spesifik proteinlerin saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren, ticari olarak temin edilebilen binlerce birincil antikor vardır. Burada bir araştırmacı, hipoksiyi taramak için hücre kültürlerinde bu oksijene duyarlı transkripsiyon faktörünün miktarını ölçmek için HIF-1α için bir antikor kullanır. Ayrıca, bir yükleme kontrolü olarak işlev görmesi için beta-aktin için bir antikor kullandılar. Gördüğünüz gibi, normal oksijen koşullarında kültürlenen hücreler, düşük oksijen koşullarında kültürlenenlerden çok daha az HIF-1 üretti.

2D jel elektroforezi ve immünoblotlama kombinasyonu, protein komplekslerinin varlığı hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Burada, numuneler önce protein kompleksi boyutuna göre çalıştırıldı ve daha sonra denatüre edildi, böylece kompleksteki her bir protein kendi boyutlarına göre ayrılabilirdi. Üç farklı protein için antikorlar, her biri dikey bir çizgide düzenlenmiş olan bu proteinlerin farklı sayılarını içeren üç benzersiz kompleks gösterir. En soldaki sütun, beta-2 ve MCP-21'in yanı sıra bu belirteçler tarafından gösterilmeyen başka bir protein içerir. Orta sütun, 3 proteinin tümünü içeren bir kompleksi gösterir ve sağ sütun sadece beta-2 ve MCP-21 içerir.

İmmünoblotlama, protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek için de kullanılabilir. Bu, önce proteinlerin bir jelden bir nitroselüloz membrana aktarılması ve daha sonra bu zarın ek proteinlerle incelenmesiyle gerçekleştirilir. İmmünoblotlama daha sonra, eklenen proteinlerin zar üzerinde hareketsiz hale getirilen proteinlerden herhangi biri ile kompleks oluşturup oluşturmadığını tespit etmek için kullanılır.

Az önce JoVE'nin immünoblotlama ile ilgili videosunu izlediniz. Artık proteinleri bir zara nasıl aktaracağınızı, zarı antikorlarla nasıl inceleyeceğinizi ve sinyali nasıl tespit edeceğinizi anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!