Transsinaptik Kolera Toksin ve Biotinlenmiş Dekstran Aminler Çift Etiketleme Ardından Pseudorabies'e Virüs ile Periferik Hedefler gelen İzleme

Bu prosedürün genel amacı, belirli bir periferik hedefe etki eden dağıtılmış hücrelerin merkezi premotor ağını keşfetmek ve daha sonra beyindeki bu hücreler arasındaki spesifik bağlantıları doğrulamaktır. Bu, ilk olarak premotor devreleri, kas yoluyla periferik olarak iletilen bir trans sinaptik viral vektör ile retrograd enfekte ederek gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, enfekte olmuş hücrelerin ışık floresan mikroskobu ile görüntülenmesidir.

Üçüncü adım, bir ön motor devresinde daha önce tanımlanmış düğümleri hedef alan monos sinaptik izleyiciler enjekte ederek beyindeki belirli bağlantıları doğrulamaktır. Sonuç olarak, sonuçlar, dağıtılmış bir pre-motor ağdaki hücrelerin, trans sinaptik viral izleme ve geleneksel monos sinaptik nöro anatomik tekniklerin bir kombinasyonu yoluyla birbirine nasıl bağlandığını gösterebilir. Bu tekniğin geleneksel monos sinaptik nöro izleme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, dağıtılmış bir nöro ağın düğümlerinin tanımlanabilmesi ve bu ağdaki hücreler arasındaki spesifik bağlantıların anestezi uygulanmış bir farede çözülebilmesidir.

Saçları keserek ve cildi en az üç alternatif Betadine ve% 70 alkol ile dezenfekte ederek cerrahi bölgeyi hazırlayın. Şimdi boğaz bölgesinde bir cilt kesisi yapın ve ilgilenilen kası ortaya çıkarın. Örneğin, krikotiroid laringeal kasına erişmek için, önce Sterno hyoid kasının üstteki kısmını çıkarmak, kesilen kasları veteriner bağ dokusu yapıştırıcısı ile kapatmak gerekir.

Daha sonra 10 mikrolitrelik nano dolgulu mikro şırınga sistemini taze çözülmüş PR RV solüsyonu ile yükleyin. Ölü alanı yavaşça temizleyin ve solüsyonun mikro şırınga ucundan çıktığını doğrulayın. Sıvıyı biyolojik olarak tehlikeli atık olarak atın ve stereotaksik cihaza dikkatlice monte edin.

Mikro konumlandırma cihazını kullanarak, iğne ucunu dikkatlice ilgilenilen kasın içine yerleştirin. Ardından hafif bir şişlik görünene kadar kası yavaşça doldurun. Şimdi şırıngayı bir sonraki ilgilenilen kaslara, bu durumda lateral krikoaritenoide taşıyın ve tekrarlayın.

Enjeksiyon prosedürü sadece her bir kası deler. Bir kez enjeksiyon hızı, kasın boyutuna ve enjekte edilecek hacme bağlı olarak değişecektir. Örneğin, krikotiroid kasını doldurmak için saniyede dört nanolitre hızında 200 nanolitrelik beş enjeksiyon, aynı bölgede bir dakika arayla yapılmalıdır.

Mikro şırıngayı geri çektikten sonra, veteriner bağı doku yapıştırıcısı kullanarak ön panodaki kırılmayı kapatın. Tüm enjeksiyonlar bittiğinde, veteriner bağ dokusu yapıştırıcısı kullanarak yarayı kapatın. Sternal yaslanmış görünene kadar hayvanı izleyin.

Daha sonra kurumsal hayvanınızın gerektirdiği şekilde analjezi, yiyecek, su ve bakım sağlayın. Yönergeleri kullanın. EGFP ekspresyonu ve PRV ile enfekte nöronları analiz etme prosedürü metin protokolünde ayrıntılı olarak ele alınmaktadır.

Doku işleme, bu videoda daha sonra ele alınana çok benzer. Yetişkin bir fareyi uyuşturarak, gözlerini koruyarak ve başının pozisyonunu sabitleyerek başlayın. Daha sonra cerrahi bölgeyi daha önce belirtildiği gibi alternatif Betadine ve% 70 alkol fırçaları ile hazırlayın.

Şimdi bir kafa derisi kesisi yapın ve kafa derisini beynin üzerine geri çekin. İlgi alanı. Matkapla uygun stereotaksik koordinatlarda küçük bir kraniyotomi yapın.

Örneğin, yetişkin bir farede PRV izleme ile tanımlanan laringeal bağlı motor korteksin koordinatları, bgma'ya 1.2 milimetre lateral ve 0.2 milimetre rostraldir. Daha sonra, steril suda% 7.5'lik bir biyotinile dekstran amin çözeltisi hazırlayın. Ardından nano jet iki mikro pipet sistemine planlanan enjeksiyonlar için yeterli BDA solüsyonu yükleyin.

Ölü alanı yavaşça temizleyin ve solüsyonun mikro pipet ucundan çıktığını doğrulayın. Mikro konumlandırma cihazını kullanarak, mikro pipet ucunu dikkatlice ilgilenilen beyin bölgesine indirin ve BDA solüsyonunu yavaşça enjekte edin. Etiketlenecek bölgenin boyutuna bağlı olarak hızı ayarlayın.

Örneğin, 4.6 nanolitrelik 12 enjeksiyon dört farklı yerde yapılmalıdır. 0.2 milimetre aralıklarla. Yetişkin bir farede gırtlağa bağlı motor korteksi kaplamak için Stro coddle.

Son enjeksiyon hacmi, ilgilenilen bölgenin büyüklüğüne göre ayarlanmalıdır. Bu etiketin enjeksiyon çekirdeğinden beyin dokusu yoluyla ve etiketli nöronların süreçleri boyunca yayılabileceğini akılda tutarak. Kraniotomiyi steril salin ile temizleyin ve ıslatın ve kafa derisi yarasını veteriner bağ doku yapıştırıcısı kullanarak kapatın.

Sternal yaslanmış görünene kadar hayvanı izleyin. Daha sonra kurumsal hayvanınızın gerektirdiği şekilde analjezi, yiyecek, su ve bakım sağlayın. Yönergeleri kullanın.

Altı gün sonra, kolera toksini alt birimi B, hayvanın kasına enjekte edilebilir. Daha sonra üç gün içinde hayvan analiz için kurban edilmelidir. Bir kriyostatta 40 mikronluk kesitleri kesin ve yüzen bölümleri 0,1 molar PBS'de kaydedin, bölümleri PBS'de %0,3 hidrojen peroksit ile 30 dakika çalkalayarak ve ışıktan koruyarak söndürün.

Bölümleri PBS'de yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra oda sıcaklığında taze hazırlanmış A, b, C çözeltisinde bir saat reaksiyona sokun. Şimdi bölümleri fosfat tamponunda yıkama başına 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Daha sonra fosfat tamponunda çalkalama ile bölümleri sekiz dakika boyunca geliştirin. DAB, hidrojen peroksit ve nikel klorür içeren pH 7.4. Hücrelerin içindeki DAB reaksiyon ürünü siyah görünmelidir.

Daha sonra, vektör leke elit kitinden normal tavşan serumu ile% 0.3 ara 20 içeren PBS'de 30 dakika çalkalarken bölümleri bloke edin. Daha sonra, tıkalı bölümleri keçi anti CTB'de oda sıcaklığında iki saat çalkalayarak inkübe edin. Daha sonra bölümleri PBS'de yıkama başına beş dakika boyunca üç kez daha yıkayın.

VE kitinden tavşan antigo sekonder antikorunu uygulayın ve oda sıcaklığında bir saat çalkalarken bölümleri inkübe edin. Bölümleri PBS'de yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve ardından oda sıcaklığında taze hazırlanmış A, b, C çözeltisinde 30 dakika boyunca reaksiyona sokun. Bölümleri fosfat tamponunda 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve bölümleri sekiz dakika inkübe edin.

Geliştirme çözeltisinde, hücrelerin içindeki DAB reaksiyon ürünü kahverengi görünmelidir. Şimdi bölümleri süper donlara ve slaytlardaki slaytlara monte edin, dokuyu kademeli alkol serisi ile kurutun, ardından ksilen içinde iki temizleme yıkaması yapın. Ardından, slaytları paramount ile örtün, kaydırın ve görüntülemeye devam edin.

EGFP için boyama, P RV 1 52'nin enjekte edilmesinden 72 saat sonra primer motor nöronlarda zayıf sinyal göstermeye başlamalı ve boyama 90 saat sonra sağlam hale gelmelidir. Laringeal motor nöronları barındıran bu belirsiz çekirdek, P RV 1 52'nin yedi laringeal kasın ikisine enjeksiyonundan 94 saat sonra görülür. Çünkü virüs, enfekte kasları innerve eden nöronlar yoluyla beyne girdi.

Hipoglossal çekirdek gibi diğer atory motor nöron havuzları 90 saat sonra EGFP'yi eksprese etmez. EGFP ikinci dereceden hücrelerde görülebilir. Bu beyin sapı nöronları, belirsiz çekirdekteki birincil enfeksiyonu takiben boyandı.

Enjeksiyon tek taraflıydı ve beyin sapında ortaya çıkan etiket paterni, ipsilateral çekirdeğin enfeksiyonunu gösteriyor. Belirsiz ve soliter çekirdek retiküler inter nöronlar da enfekte oldu ve EGFP için güçlü bir şekilde boyandı. Bu inter nöronlar, atoryon motor nöron havuzları ve kontralateral çekirdek dahil olmak üzere çeşitli yapıları birbirine bağlar. Belirsiz.

Bununla birlikte, virüs yalnızca geriye doğru yayıldığı için efferent hedefleri etiketlenmemiş kalır. PRV ile sağkalım süresi sınırlıdır, ancak periferik enjeksiyon bölgesine kontralateral EGFP eksprese edilen motor kortekste üçüncü ve daha yüksek dereceden hücrelerde enfekte premotor nöronlarda EGFP boyaması gösterebilir. Muhtemelen sadece laringeal kas sisteminin motor kortikal temsilini oluşturan hücre popülasyonu enfekte olmuştur.

Ok uçları ile işaretlenmiş belirsiz çekirdek seviyesinde BDA işaretli aksonlar, kahverengi renkte görülen gırtlak kaslarına enjeksiyonlarla işaretlenmiş retrograd CTB pozitif motor nöronlarla temas eder, aksonlar laringeal motor nöronların dendritlerinin yakınında ve laringeal motor nöronların somasının yakınında varisler ve varsayılan terminal coplar oluşturur. Bu varislerin sinaptik olup olmadığını belirlemek için elektron mikroskobu veya elektrofizyoloji kullanan daha ileri deneyler gereklidir. Laringeal bağlantılı motor kortekse yerleştirilen bilateral bir BDA enjeksiyonu siyah renkte görülür, çünkü BDA yöne özgü değildir, hem afferent hem de efferent bağlantılar etiketlenebilir.

Örneğin, talamusta hem anterograd etiketli bir projeksiyon alanı hem de retrograd ile etiketlenmiş hücre gövdeleri görülür. Talamik hücreler ok ucu ile tanımlanır ve iç kapsül oryantasyon için etiketlenir. Yalancı kuduz virüsü ve DAB ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve sterilizasyon gibi önlemlerin alınabileceğini unutmayın.

% 10 ağartma çözeltisi kullanılarak PRV veya DAB ile temas eden tüm malzemeler. Bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman biyolojik olarak tehlikeli katı ve sıvı atıkların kurumunuzun yönetmeliklerine göre uygun bir şekilde bertaraf edilmesi gerekir.