Name: Transsinaptik Kolera Toksin ve Biotinlenmiş Dekstran Aminler Çift Etiketleme Ardından Pseudorabiese Virüs ile Periferik Hedefler gelen İzleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Keşfedin sinapslar arası izleme yöntemiyle periferik hedefleri düzenleyen santral premotor sinir devrelerini. Pseudorabies virüsü ve klasik izleme teknikleri kullanılarak nöronal bağlantılar haritalanır ve doğrulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz laringeal cerrahi tekniği öğretmek için, Kobe Üniversitesi, Japonya Dr. Toshio Terashima teşekkür ve PRV-Bartha temini için Princeton Üniversitesi&#39;nden Dr. Lynn Enquist. Araştırma Erich Jarvis D. NIH öncü ödülü DP1 OD000448 ve Gustavo Arriaga bir NSF Lisansüstü Araştırma Bursu ödülü ile desteklenmiştir. Uygun kredili önceki çalışmalarından Rakamlar derginin editoryal politikalarına uygun PLoS ONE açık erişim Creative Commons lisansı (CC-BY) altında kullanılmaktadır.

NOT: Tüm hayvan prosedürleri gözden geçirilecek ve Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Depolama Pseudorabies&#39;e Virüs <ol><li> Biz 1 x 10 9 pfu / m titrede Princeton Üniversitesi&#39;nden Dr. Lynn Enquist laboratuvar canlı virüsü (PRV152) edinin. Virüs üretmek için bir protokol 2 yayımlanmıştır. </li><li> Uygun biyogüvenlik koşulları altında -80 ° C&#39;de BSL-2 biyogüvenlik kabini ve mağaza içindeki tüp başına 20 ul virüs alikotu. </li><li> Hemen enjekte önce PRV bir kısım çözülme. </li></ol> Muscle içine Enjeksiyonlar 2. Cerrahi Hazırlık <ol><li> (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg ksilazin) ketamin-ksilazin intramüsküler enjeksiyon yoluyla, genel anestezi neden ve izofloran kullanılarak uygun bir anestezik düzlemi korumak. </li><li> Bir oftalmik merhem ile korneaları koruyun. </li><li> T hazırlayınsaç kesme ve alternatif Betadine scrubs ve% 70 alkol (3 döngü az) ile cerrahi siteyi dezenfekte tarafından aseptik tekniğe uygun diye cerrahi alan. Cerrahi alanları kapsayacak şekilde steril örtüler kullandığınızdan emin olun. Prosedürler boyunca steril tekniklere uymak için emin olun. </li><li> Bir cilt kesi yapmak ve ilgi kas ortaya koymaktadır. Örneğin, ilk sternohyoid kas örten kısmını çıkarmak için gerekli olan krikotiroid gırtlak kası erişmek için. </li><li> VetBond doku yapıştırıcısı ile herhangi transected kasları kapatın. </li></ol> Muscle içine PRV 3. Enjeksiyon <ol><li> 34 G paslanmaz çelik iğne takın, taze çözülmüş PRV çözeltisi ile 10 ul Nanofil mikroenjektör sistemini yükleyin ve özenle stereotaksik cihaz üzerinde monte edin. </li><li> Yavaşça ölü boşluğu temizlemek ve bu çözüm mikroenjektör ucu çıkar doğrulayın. Bioharzard atık olarak sıvı atın. </li><li> Bir stereotaksik microp kullanılmasıositioning cihazı dikkatlice ilgi kasına mikroenjektör ucu yerleştirin ve hafif şişlik görülebilir olana kadar yavaş yavaş kas doldurun. Kas ve birimin boyutuna bağlı olarak değişir enjeksiyon oranı enjekte edilecek. Örneğin, 4 nl / sn bir hızda 200 nl (1 ul toplam) beş enjeksiyonları krikotiroid kas doldurmak için aynı sitede 1 dakika arayla yapılmalıdır. Ilgi sonraki kas şırınga (bu durumda yanal krikoaritenoid) hareket ettirin ve enjeksiyon işlemi tekrarlayın. Sadece bir kez, her kas delinme. </li><li> Beş dakika sonra mikroenjektör geri çekin. </li><li> VetBond doku yapıştırıcı kullanılarak fasya mola Seal. </li><li> Tüm enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, VetBond doku yapıştırıcı kullanılarak yarayı kapatmak. Yerel institional hayvan kullanım yönergelerine, dikiş veya yara klipleri bağlı kullanılabilir. </li><li> Sternum yatma kadar hayvan izleyin ve analjezi, gıda, su sağlamak ve y gereği olarak bakımkurumsal hayvan kullanımı kurallar. </li><li> Deneysel olarak belirlenen yaşam süresinden sonra (bu durumda, 90 saat 2 etiket nd kortikal nöronların sipariş), pentobarbital doz aşımı ile hayvan kurban ve 0.1 M PBS içinde% 4 formaldehit, ardından% 0.9 tuzlu su ile transcardially serpmek. </li><li> Çıkarın ve 24 saat süreyle% 4 formaldehit beyin post-düzeltin. </li><li> En az 48 saat süre ile% 30 sukroz ihtiva eden fosfat tamponu içinde beyin cryoprotect. </li></ol> EGFP 4. immunokimyasal Algılama <ol><li> Sürgülü mikrotomda 40 mikron bölümleri kesmek ve 0.1M PBS içine yüzen bölümleri kaydedin. Monte edilmiş bölümleri kullanılarak boyanması daha ince bölümleri, örneğin, 30 um için kullanılabilmektedir. </li><li> Işıktan koruyarak PBS içinde% 0.3, H2O 2 30 dakika boyunca bölümler söndürülür. </li><li> PBS VECTASTAIN Elit Kit normal keçi serumu ile% 0.3 Tween 20 ihtiva eden 30 dakika boyunca bölümler halinde spesifik olmayan antijenleri engelle (kiti VE). </li><liRT&#39;de:&gt; inkübe tavşan 3,5 saat boyunca anti-eGFP (1000 1) bölümleri engelledi. </li><li> RT de kiti VE den daha sonra keçi anti-tavşan ikincil antikor, 1 saat boyunca inkübe, 5 dakika boyunca kısımlar PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre kit VE ABC çözeltisi hazırlayın. </li><li> RT de kiti VE den daha sonra ABC çözeltisi içinde 1 saat süre ile reaksiyona bunları, 5 dakika boyunca kısımlar PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> % 0.05 DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidin) ve% 0.015 H2O 2 ihtiva eden, 10 dakika süre ile fosfat tamponu içinde olan bölüm üç kez yıkayın ve fosfat tampon maddesi içinde 8 dakika, pH 7.4 gelişir. </li><li> Kademeli alkol serisi ile Dağı SuperFrost artı slaytlar üzerinde bölümleri ve kuruturlar (% 70,% 95,% 100 ve 5 dakika her biri için,% 100). </li><li> İki ksilen yıkar (5 dk) ile bölümleri temizleyin ve Permount montaj ortamı ile slaytlar lamel. </li><li> Görüntü mikroskop üzerine monte bölümler. DAB reaksiyon ürünü inside hücreler kahverengi görünmelidir. Sayısallaştırılmış görüntüleri ince süreçleri vurgulamak için ters bir renk olabilir. </li></ol> PRV İzleme tarafından keşfedilen Beyin Bölgeler içine izleyicilerin Enjeksiyon için 5. Cerrahi Hazırlık <ol><li> (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg ksilazin) ketamin-ksilazin intramüsküler enjeksiyon yoluyla, genel anestezi neden ve izofloran kullanılarak uygun bir anestezik düzlemi korumak. </li><li> Bir oftalmik merhem ile korneaları koruyun. </li><li> Uygun bir stereotaksik çerçeve içinde kafası sabitleyin. </li><li> Saç kesme ve alternatif Betadine scrubs ve% 70 alkol (3 döngü az) ile site dezenfekte ederek aseptik tekniğe uygun cerrahi siteyi hazırlayın. </li><li> Bir kafa derisi kesi yapmak ve ilgi beyin bölgesi üzerindeki deriyi geri çekin. </li><li> Uygun stereotaksik koordinatlarda küçük bir kraniotomi gerçekleştirin. Örneğin, PRV bir izlemeyi tespit laryngeally bağlanan motor korteks koordinatların erişkin fare 1,2 mm yanal ve bregmaya 0.2 mm rostral bulunmaktadır. </li></ol> Beyin içine Biyotinilat Dekstran Aminler 6. Enjeksiyon <ol><li> Steril tuz 333 ul BDA 25 mg (10.000 MW) eritilmesi ile% 7.5 biyotinlenmiş dekstran aminler (BDA) hazırlayın. </li><li> Planlanan enjeksiyonlar için yeterli BDA çözeltisi ile Nanoject II mikropipet sistemi yükleyin. </li><li> Yavaşça ölü boşluğu temizlemek ve bu çözüm mikropipet ucu çıkmadan doğrulayın. </li><li> Stereotaksik micropositioning cihazı kullanarak dikkatlice ilgi beyin bölgesi içine mikropipet ucu düşürmek ve yavaş yavaş BDA enjekte edin. Bölgenin büyüklüğüne bağlı olarak enjeksiyon oranı etiketlenmesine ayarlayın. Örneğin, 4.6 nl 12 enjeksiyonları dışında 0.2 mm (postero-kaudal yönde) yetişkin farelerde laryngeally bağlı motor korteks kapsayacak şekilde dört farklı konumlarda olması yaptırdı olmalıdır. Nihai enjeksiyon hacmi ilgi beyin bölgesinin boyutuna göre ayarlanabilir olmalıdırEtiket beyin dokusu sayesinde ve etiketli nöronların süreçler boyunca difüzyon ile enjeksiyon çekirdek yayılabilir akılda tutmak. </li><li> Diş çimento kullanarak kraniotomi Seal ve VetBond doku yapıştırıcı kullanılarak kafa derisi yarayı kapatmak. </li><li> Sternum yatma kadar hayvan izleyin ve analjezi, gıda, su sağlamak, ve kurumsal hayvan kullanımı kurallarına gereği önemsiyorum. </li></ol> Kas içine kolera toksin alt-birimlerinin b 7. Enjeksiyon <ol><li> Steril tuzlu su, 100 ul CTB, 1 mg çözülmesiyle 1% kolera toksin alt-birimlerinin b (CTB) hazırlayın. </li><li> Altı gün beyine BDA enjeksiyonundan sonra, kas içine enjeksiyon için PRV yukarıda tarif edildiği gibi, cerrahi hazırlama gerçekleştirin. </li><li> 34 G paslanmaz çelik iğne takın, CTB çözeltisi ile 10 ul Nanofil mikroenjektör sistemini yükleyin ve özenle stereotaksik cihaz üzerinde monte edin. </li><li> Daha önce de olduğu gibi ilgi kas (lar) microinjections gerçekleştirinPRV için kayıtsız kalamayız. </li><li> Sternum yatma kadar hayvan izleyin ve analjezi, gıda, su sağlamak, ve kurumsal hayvan kullanımı kurallarına gereği önemsiyorum. </li><li> Üç gün CTB enjeksiyonundan sonra, pentobarbital aşırı doz hayvan kurban ve 0.1 M PBS içinde% 4 formaldehit, ardından% 0.9 tuzlu su ile transkardiyal serpmek. </li><li> Çıkarın ve 24 saat süreyle% 4 formaldehit beyin post-düzeltin. </li><li> En az 48 saat süre ile% 30 sukroz ihtiva eden fosfat tamponu içinde beyin cryoprotect. </li></ol> Aynı bölümlerde BDA ve CTB 8. Algılama <ol><li> Bir mikrotomda 40 mikron bölümleri kesmek ve 0.1M PBS içine yüzen bölümleri kaydedin. </li><li> Işıktan koruyarak PBS içinde% 0.3, H2O 2 30 dakika boyunca bölümler söndürülür. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre kit VE ABC çözeltisi hazırlayın. </li><li> Daha sonra oda sıcaklığında, ABC çözeltisi içinde 1 saat süre ile reaksiyona bunları, 5 dakika boyunca PBS içinde olan bölüm üç kez yıkayın. </li&gt; <li> 10 dakika boyunca fosfat tamponu içinde olan bölüm üç kez yıkayın, ve% 0.05 DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidin),% 0.015 H2O 2, ve% 0.05 nikel klorür içeren fosfat tampon maddesi içinde 8 dakika, pH 7.4 gelişir. Hücre içinde DAB reaksiyon ürünü siyah görünmelidir. </li><li> VECTASTAIN Elit Kit normal tavşan serumu ile Tween 20% 0.3 içeren PBS içinde 30 dakika boyunca blok bölümleri. </li><li> RT&#39;de: inkübe keçi 2 saat boyunca anti-CTB (10,000 1) bölümleri engelledi. </li><li> RT de kiti VE den daha sonra tavşan anti-keçi ikincil antikor, 1 saat boyunca inkübe, 5 dakika boyunca PBS içinde olan bölüm üç kez yıkayın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre kit VE ABC çözeltisi hazırlayın. </li><li> Daha sonra oda sıcaklığında, ABC çözeltisi içinde 30 dakika boyunca, onları tepki, 5 dakika boyunca PBS içinde olan bölüm üç kez yıkayın. </li><li> % 0.05 DAB (3, 3 ihtiva eden, 10 dakika boyunca kısımlar fosfat tamponu içinde üç kez yıkayın ve fosfat tamponu içinde 8 dakika, pH 7.4 için geliştirmek&#39;-diaminobenzidine) ve% 0.015 H2O 2. Hücre içinde DAB reaksiyon ürünü kahverengi görünmelidir. </li><li> Kademeli alkol serisi ile Dağı SuperFrost artı slaytlar üzerinde bölümleri ve kuruturlar (% 70,% 95,% 100 ve 5 dakika her biri için,% 100). </li><li> İki ksilen yıkar (5 dk) ile bölümleri temizleyin ve Permount montaj ortamı ile slaytlar lamel. </li><li> Görüntü mikroskop üzerine monte bölümler. </li></ol>

<ol><li>Card, J. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCard%2C+JP+%22Transneuronal+circuit+analysis+with+pseudorabies+viruses.Multiple+values+selected%22">Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected</a>. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).</li>
<li>Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudorabies+virus+expressing+enhanced+green+fluorescent+protein%3A+a+tool+for+in+vitro+electrophysiological+analysis+of+transsynaptically+labeled+neurons+in+identified+central+nervous+system+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).</li>
<li>Aston Jones, G., Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+pseudorabies+virus+to+delineate+multisynaptic+circuits+in+brain+opportunities+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li>
<li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li>
<li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).</li>
<li>Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).</li>
<li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single+and+double+labeling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li>
<li>Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+a+versatile+anterograde+and+retrograde+neuronal+tracer%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer.</a> Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).</li>
<li>Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+neuronal+tracing+with+cholera+toxin+B+subunit%3A+comparison+of+three+different+visualization+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods.</a> Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).</li>
<li>Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+circuitry+involved+in+the+regulation+of+whisker+movements%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements.</a> The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).</li>
<li>Bartha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+reduction+of+virulence+of+Aujeszkys+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Magy+Allatorv+Lapja%22%5BJournal%5D)">Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus.</a> Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).</li>
<li>Kuypers, H., Ugolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+as+transneuronal+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Viruses as transneuronal tracers.</a> Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).</li>
<li>Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+pathway+from+rat+vibrissa+motor+cortex+to+facial+motor+neurons+revealed+by+lentivirus-based+axonal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).</li>
<li>Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input+output+organization+of+the+rat+vibrissal+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Input output organization of the rat vibrissal motor cortex.</a> Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).</li>
<li>Hsu, S. M., Soban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+modification+of+diaminobenzidine+%28DAB%29+precipitation+by+metallic+ions+and+its+application+for+double+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).</li>
<li>Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+avidin+biotin-peroxidase+complex+%28ABC%29+in+immunoperoxidase+techniques+a+comparison+between+ABC+and+unlabeled+antibody+%28PAP%29+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).</li>
<li>Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterograde+neuroanatomical+tracer+biotinylated+dextran+amine+comparison+with+the+tracer+Phaseolus+vulgaris+leucoagglutinin+in+preparations+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).</li>
<li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+architecture+of+nucleus+ambiguus+motoneurons+projecting+to+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).</li>
<li>Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+birds+and+men+the+mouse+ultrasonic+song+system+has+some+features+similar+to+humans+and+songlearning+birds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds.</a> PLoS ONE. 7 (10), e46610(2012).</li>
<li>Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+the+use+of+pseudorabies+virus+in+transneuronal+studies+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).</li>
<li>Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudorabies+virus+glycoprotein+gIII+is+a+major+target+antigen+for+murine+and+swine+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).</li>
<li>Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinvasiveness+of+pseudorabies+virus+injected+intracerebrally+is+dependent+on+viral+concentration+and+terminal+field+density%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density.</a> The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).</li>
<li>Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+the+attenuated+pseudorabies+virus+PRV+Bartha+results+in+infection+of+the+hamster+suprachiasmatic+nucleus+only+by+retrograde+transsynaptic+transport+via+autonomic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).</li>
<li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+use+bidirectional+fast+axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

PRV152 4,21 kullanarak bir deney planlanırken dikkate alınması gereken konulardan bir dizi vardır. Daha da önemlisi, pseudorabies virüs öldürücü. Daha önce belirtildiği gibi, insanlar da dahil olmak üzere büyük maymunlar, enfeksiyona duyarlı değildir, ancak uygun bakım diğer hayvanları korumak için dikkatli olunmalıdır. Yetişkin farelerde tipik haliyle beş ila yedi gün, zayıflatılmış PRV152 suşu ile aşılamadan sonra hayatta. Bu nedenle, PRV152 bir haftadan daha uzun bir hayatta kalma süresi gerektirir deneyle...

Transsinaptik izleme multi-sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri düzenleyen santral eferent nöronları analiz etmek için kullanılan güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yaklaşım en yaygın, özellikle zayıflatılmış suş PRV-Bartha ilk kez 1961 yılında açıklanan domuz patojen pseudorabies virüsü (PRV), kullanılarak kemirgen beyinde kullanılmaktadır 12. Burada, belirli kasların motor kortikal temsilini belirlemek için bir protokol mevcut veya gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) raportör geninin 2 eksprese eden bir rekombinant pseudorabies virüs suşu (PRV152) ile kas grupları. Açıklanan yöntem çapraz sinaps fonksiyonel devre 3,4,13 içindeki diğer nöronlar bulaştırmak için bu bulaşıcı döl üreten nörotropik virüsler, davranışını patlatır. PRV-Bartha ile izojenik olan PRV152, sadece uzak enfeksiyon sitesinden 3,5 &lt;dan retrograd sinaptik bağlantıların hiyerarşik dizisi boyunca sinaps haçlar/ sup&gt;. Tam olarak enfeksiyonun periferal sitesi kontrol edilmesiyle motor nöronların spesifik bir alt kümesi üzerinden beyne virüs girişini sınırlamak mümkündür. Virüs sırayla bağlı nöronların zincirlerini bozar gibi, beynin boyunca eGFP sinyalinin ortaya çıkan desen sonra başlangıçta enfekte hücrelere bağlı olan nöronların ağı çözecektir. Nöral izleme için virüs kullanılarak bir başka avantajı, enfekte olmuş hücreler içinde raportör proteininin (bu durumda EGFP) amplifikasyonu olup. Bu sinyal amplifikasyon bile seyrek projeksiyonlar algılanmasını sağlar duyarlılık düzeyi sağlar. Örneğin, bıyık kontrol yüz motor nöronlara bıyık motor korteks bir seyrek projeksiyon viral ifade yeşil flüoresan protein 14 ile sıçanlarda bulundu; önceki çalışmalar raportör gen amplifikasyonu 11,15 olmadan klasik izleyiciler kullanarak bu projeksiyonu bulamadılar. Ne yazık kiBirçok viral izleme vektörleri belirtilen çalışmada kullanılan gibi, bu şekilde, çok-sinaptik devreleri izlemek için kullanımlarını sınırlamaktadır sinaps geçmez. Motor devresinde katılan hücrelerin ağını tanımlamak için farklı avantajlar sunarken, transsinaptik dağıtık yapısı PRV-152 zorlu devre içinde belirli bağlantıları yorumlama yapar ile izleme. Bu nedenle, biz biyotinlenmiş dekstran aminler (BDA) ve kolera toksini alt birimi b (CTB) kullanılarak çift etiketleme PRV-152 kullanılarak tespit devreler içinde belirli bağlantıları doğrulamak için basit bir yöntem mevcut. BDA ve CTB kombine kullanımının nöronlar 6-8,11 özel setler arasındaki bağlantıları izlemek için köklü bir yaklaşımdır. Birlikte kullanıldığında, bu iki izleyiciler iki renkli DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidin) prosedürü 16 kullanarak aynı bölümünde görülebilir. Yüksek molekül ağırlıklı BDA (BDA10kDa) bu protokol için seçildi bu y çünkünöron 6,7,9 ayrıntılı etiketleme ields. BDA10kDa diğer avantajları arasında aşağıdakiler bulunmaktadır: bu tercihan anterograd yönünde 6-8 taşınır; o iyontoforetik veya basınçlı enjeksiyon 6-8 teslim edilebilir; basit bir avidin biotinillenmemiş HRP (ABC) prosedürü 17 tarafından görüntülenmiştir olabilir; ve ışık veya elektron mikroskobu 6,7,18 tarafından görüntülenebilir. Distal dendritler 10,19 gibi hücresel süreçleri ortaya çıkartılmasında etkili olduğu için peroksidaz ve DAB ile CTB immünokimyasal algılama motor nöronlar retrograd etiketlenmesi için seçildi. Biz son zamanlarda farelerde vokal motorlu yolu belirlemek ve daha önce 20 eksik olarak kabul edildi laringeal motor nöronların, primer motor korteks gelen seyrek bir bağlantı ortaya çıkarmak için bu yaklaşımı kullanılır.

<table><tbody><tr><td>Reaktif/Malzeme</td><td>Firma</td> Adı <td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>NanoFil Mikroenjeksiyon Sistemi</td><td>World Precision Instruments</td><td>IO-Kit</td><td>34 G seçeneği</td></tr><tr><td>Stereotaksik çerçeve</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Otomatik Nanolitre Enjektör</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Kayar mikrotom</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>İzofloran (Forane)</td><td>Baxter&nbsp;</td><td></td><td></td>1001936060</tr><tr><td>Betadine Swab Stick</td><td>Cardinal Health</td><td>2130-01</td><td>200 adet</td></tr><tr><td>Permount Montaj Ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus slaytlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile edilmiş dekstran aminler</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10.000 MW</td></tr><tr><td>Psödokuz virüsü</td><td>Laboratuvarı Dr. Lynn Enquist (Princeton Üniversitesi)</td><td>PRV152</td><td>Titre >1 x 107</td></tr><tr><td>Anti-Kolera Toksin B Alt Birimi (Keçi)</td><td>Listesi Biyolojik Laboratuvarlar</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>Kolera Toksin B Alt Birimi</td><td>Listesi Biyolojik Laboratuvarlar</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP</td><td>Açık Biyosistemler</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'-diaminobenzidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>10 mg tabletler</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 geçirmez</td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>%4'e seyreltin</td></tr> <tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>%30</td></tr> <tr><td>Ketamin HCl & Ksilazin HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4138</td><td>80 mg / ml ve 6 mg / ml</td></tr><tr><td>Nikel klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>1.0 M; pH 7.4</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10x; pH 7.4</td></tr><tr><td>Sodyum Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>50 mg / ml doz</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ksilenler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Histolojik sınıf</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC</td><td>Kiti Vektör Laboratuvarları</td><td>PK-6101 (tavşan); PK-6105 (keçi)</td><td></td></tr><tr><td>Optixcare oftalmik merhem</td><td>Veteriner Deposu 1017992</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transsinaptik kolera toksin ve biotinlenmiş dekstran aminler Çift etiketleme ardından pseudorabies&#39;e virüs ile periferik hedefler gelen İzleme

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsinaptik izleme multi-sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri düzenleyen santral eferent nöronları analiz etmek için kullanılan güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yaklaşım en yaygın domuz patojen pseudorabies virüsü (PRV) 1 kullanılarak beyinde kullanılmaktadır. PRV insanlar dahil olmak üzere büyük maymunları enfekte etmez, bu yüzden en yaygın küçük memeliler, özellikle kemirgenler üzerinde çalışmalarda kullanılmaktadır. Pseudorabies zorlanma PRV152 gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) raportör geni ifade ve sadece retrograd uzak enfeksiyon sitesinden 2,3 sinaptik bağlantıların hiyerarşik dizisi ile fonksiyonel sinapsların geçer. Diğer PRV suşları farklı mikrobiyolojik özelliklere sahip ve her iki yönde (PRV-Becker ve PRV-Kaplan) 4,5 &#39;de taşınabilir. Bu protokol PRV152 münhasıran ele alacağız. Böyle kas gibi, periferik yerinde virüsü teslim ederek, t içine virüsün girişini sınırlamak mümkündürnöronların belirli bir set üzerinden beyni. Beyin boyunca eGFP sinyalinin elde edilen şablon, bu durumda başlangıçta enfekte olan hücrelere bağlı nöronların giderir. Pseudorabies virüs transsinaptik izleme dağıtık yapısı zor bir tanımlanmış bir ağ içinde belirli bağlantı yorumlama yapar, biz kullanılarak tespit hücreleri arasındaki bağlantıları teyit için biyotinli dekstran aminler (BDA) ve kolera toksini alt birimi b (CTB) kullanılarak hassas ve güvenilir bir yöntem sunmak PRV152. Onlar uzak dendritler 6-11 olmak üzere hücresel süreçleri ortaya etkilidir çünkü peroksidaz ve DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidin) ile BDA ve CTB immunokimyasal tespiti seçildi.

EGFP için boyama kasına PRV152 enjekte sonra birincil motor nöronların yaklaşık 72 saat zayıf sinyali gösteren başlamalıdır. Çoğaltma ve virüsün transsinaptik taşıma titer- ve zamana bağlı 4 bulunmaktadır. Yaklaşık 90 saat enjeksiyonundan sonra, eGFP boyama 2. sırası ile enfekte hücrelerde sağlam sinyal ortaya çıkaracaktır. Daha uzun yaşam süreleri 3 rd ve yüksek mertebeden hücreleri ortaya çıkaracaktır ama sağkalım süreleri yaklaşık 5 gün aşılamadan sonra PRV ölümcül ile sınırlıdır. </p...

Transsinaptik izleme, çoklu sinaptik devreler aracılığıyla periferik hedefleri düzenleyen merkezi eferentleri analiz etmek için güçlü bir araç haline gelmiştir. Burada, işlevsel bir beyin devresini tanımlamak ve lokalize etmek için transsinaptik psödorabies virüsünü kullanan bir protokol sunuyoruz, ardından tanımlanmış nöron grupları arasındaki devredeki belirli bağlantıları doğrulamak için klasik yol izleme teknikleri sunuyoruz.

Transsinaptik Kolera Toksin ve Biotinlenmiş Dekstran Aminler Çift Etiketleme Ardından Pseudorabies&#39;e Virüs ile Periferik Hedefler gelen İzleme

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

Bu prosedürün genel amacı, belirli bir periferik hedefi etkileyen dağıtılmış hücrelerin merkezi premotor ağını keşfetmek ve ardından beyindeki bu hücreler arasındaki spesifik bağlantıları doğrulamaktır. Bu işlem, öncelikle premotor devrelerin kas yoluyla periferik olarak iletilen trans-sinaptik bir viral vektör ile retrograd şekilde enfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise enfekte olan hücrelerin ışık floresan mikroskobu ile görüntülenmesidir.Üçüncü adım, bir pre-motor devrede önceden belirlenmiş düğümleri hedefleyen monosinaptik izleyiciler enjekte ederek beyindeki spesifik bağlantıları doğrulamaktır. Nihayetinde sonuçlar, dağıtılmış bir pre-motor ağdaki hücrelerin, transsinaptik viral izleme ve geleneksel monosinaptik nöroanatomik tekniklerin kombinasyonu aracılığıyla birbirlerine nasıl bağlandığını gösterebilir. Bu tekniğin, geleneksel monosinaptik nöro-izleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, dağıtılmış bir nöral ağın düğümlerinin belirlenebilmesi ve bu ağdaki hücreler arasındaki spesifik bağlantıların anestezi altındaki bir fare üzerinde çözümlenebilmesidir.Tüyleri kısaltarak ve cildi en az üç kez dönüşümlü olarak Betadine ve %70 alkol ile temizleyerek cerrahi alanı hazırlayın. Şimdi boğaz bölgesinde bir cilt insizyonu yapın ve ilgili kası ortaya çıkarın. Örneğin, krikotiroid laringeal kasa erişmek için öncelikle üzerini örten Sterno hyoid kas kısmının kaldırılması ve kesilen tüm kasların vet bond doku yapıştırıcısı ile kapatılması gerekir.Ardından, 10 µL nano fill mikro şırınga sistemini yeni çözünmüş PR RV solüsyonu ile doldurun. Ölü alanı yavaşça temizleyin ve solüsyonun mikro şırınga ucundan çıktığını doğrulayın. Sıvıyı biyotehlikeli atık olarak atın ve sistemi dikkatlice stereotaksik cihaza monte edin.Mikro konumlandırma cihazını kullanarak, iğne ucunu dikkatlice ilgili kasın içine yerleştirin. Ardından, hafif bir şişme görünene kadar kası yavaşça doldurun. Şimdi şırıngayı bir sonraki ilgili kasa, bu durumda lateral krikotiroid kasa taşıyın ve işlemi tekrarlayın.Enjeksiyon prosedürü her bir kası sadece bir kez deler. Enjeksiyon hızı, kasın boyutuna ve enjekte edilecek hacme bağlı olarak değişecektir. Örneğin, krikotiroid kasını doldurmak için aynı bölgeye saniyede 4 nanolitre hızla 200 nanolitre şeklinde, birer dakika arayla beş enjeksiyon yapılmalıdır.Mikro şırıngayı geri çektikten sonra, fasyadaki yırtığı vet bond doku yapıştırıcısı kullanarak kapatın. Tüm enjeksiyonlar tamamlandığında, yarayı vet bond doku yapıştırıcısı ile kapatın. Hayvan sternal recumbence (göğüs üstü yatış) pozisyonuna gelene kadar izleyin.Ardından, kurumsal hayvan kullanım kılavuzlarınızın gerektirdiği şekilde analjezi, gıda, su ve bakım sağlayın. EGFP ekspresyonunun ve PRV enfekte nöronların analiz edilmesine yönelik prosedür, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.Doku işlemleri, bu videonun ilerleyen kısımlarında ele alınan işlemlere çok benzerdir. Gözlerini koruyarak ve başının pozisyonunu sabitleyerek yetişkin bir fareyi anestezi altına alarak başlayın. Ardından, daha önce belirtildiği gibi cerrahi alanı Betadine ve %70 alkol ile sırayla temizleyerek hazırlayın.Şimdi bir saçlı deri kesisi yapın ve saçlı deriyi beynin üzerinden geri çekin. İlgi bölgesi. Uygun stereotaksik koordinatlarda matkapla küçük bir kraniyotomi gerçekleştirin.Örneğin, erişkin bir farede PRV izleme yöntemiyle belirlenen laringeal bağlantılı motor korteks koordinatları, bgma'nın 1.2 milimetre laterali ve 0.2 milimetre rostralidir. Ardından, steril su içerisinde %7.5'lik biotinylated dextran amines çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, nano jet iki mikro pipet sistemini planlanan enjeksiyonlar için yeterli miktarda BDA çözeltisiyle doldurun.Ölü boşluğu yavaşça boşaltın ve solüsyonun mikro pipet ucundan çıktığını doğrulayın. Mikro konumlandırma cihazını kullanarak, mikro pipet ucunu dikkatlice ilgilenilen beyin bölgesine indirin ve BDA solüsyonunu yavaşça enjekte edin. Enjeksiyon hızını, işaretlenecek bölgenin boyutuna göre ayarlayın.Örneğin, yetişkin bir farede laringeal bağlantılı motor korteksi kapsayacak şekilde, dört farklı konuma 0,2 milimetre aralıklarla 4,6 nanolitre hacminde 12 enjeksiyon yapılmalıdır.Son enjeksiyon hacmi, ilgi bölgesinin boyutuna göre ayarlanmalıdır. İşaretleyicinin enjeksiyon merkezinden beyin dokusuna ve işaretli nöronların uzantıları boyunca yay kılabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. Kraniyotomi bölgesini steril salin ile temizleyip ıslatın ve kafa derisindeki yarayı vet bond doku yapıştırıcısı kullanarak kapatın.Hayvan sternal recumbency (sternal yatış) belirtisi gösterene kadar izleyin. Ardından, kurumunuzun hayvan kullanım kılavuzlarının gerektirdiği şekilde analjezi, gıda, su ve bakım sağlayın.Altı gün sonra, kolera toksini B alt birimi hayvanın kasına enjekte edilebilir. Ardından üç gün içinde, hayvan analiz için sakrifiye edilmelidir. Kriyostatta 40 mikron kalınlığında kesitler alın ve yüzen kesitleri 0,1 molar PBS içinde saklayın; kesitleri, çalkalayarak ve ışıktan koruyarak 30 dakika boyunca PBS içindeki %0,3 hidrojen peroksit ile sönümleyin.Kesişimleri, her yıkama beş dakika sürecek şekilde PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, oda sıcaklığında, taze hazırlanmış A b, C çözeltisi içerisinde bir saat boyunca inkübe edin. Şimdi kesişimleri, her yıkama 10 dakika sürecek şekilde fosfat tamponu ile üç kez yıkayın.Ardından, DAB, hidrojen peroksit ve nikel klorür içeren pH 7.4 fosfat tamponunda, ajitasyon altında sekiz dakika boyunca bölümleri geliştirin. Hücrelerin içindeki DAB reaksiyon ürünü siyah görünmelidir.Ardından, Vector Stain Elite kitinden gelen normal tavşan serumu içeren ve %0,3 tween 20 içeren PBS içerisinde kesitleri 30 dakika boyunca çalkalayarak bloke edin. Daha sonra, bloke edilmiş kesitleri oda sıcaklığında iki saat boyunca çalkalayarak keçi anti CTB ile inkübe edin. Son olarak kesitleri, her yıkama beş dakika sürecek şekilde PBS ile üç kez daha yıkayın.VE kitinden gelen tavşan anti-GO ikincil antikoru uygulayın ve kesitleri oda sıcaklığında, çalkalayarak bir saat boyunca inkübe edin. Kesitleri PBS ile her yıkama beş dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın ve ardından oda sıcaklığında, taze hazırlanmış A, b, C çözeltisi içerisinde 30 dakika boyunca reaksiyona bırakın. Kesitleri fosfat tamponu ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve kesitleri sekiz dakika boyunca inkübe edin.Geliştirme solüsyonunda, hücrelerin içindeki DAB reaksiyon ürünü kahverengi görünmelidir. Şimdi kesitleri super frosts plus lamlara monte edin, dokuyu dereceli alkol serisiyle dehydrate edin ve ardından ksilen ile iki kez şeffaflaştırma yıkaması yapın. Daha sonra lamları paramount ile kapatın ve görüntülemeye geçin.EGFP boyaması, P RV 1 52 enjeksiyonundan 72 saat sonra primer motor nöronlarda zayıf sinyaller göstermeye başlamalı ve 90 saat sonra boyama belirgin hale gelmelidir. Laringeal motor nöronların bulunduğu nucleus ambiguus, yedi laringeal kastan ikisine P RV 1 52 enjekte edildikten 94 saat sonra görülür. Çünkü virüs, beyne enfekte kasları innerve eden nöronlar aracılığıyla girmiştir.Hipoglossal nukleus gibi diğer motor nöron havuzları 90 saat sonra EGFP eksprese etmezler. EGFP, ikinci derece hücrelerde görülebilir. Bu beyin sapı nöronları, nukleus ambiguus'taki primer enfeksiyonun ardından boyanmıştır.Enjeksiyon tek taraflı yapılmıştır ve beyin sapındaki ortaya çıkan etiketleme paterni, ipsilateral çekirdeğin enfekte olduğunu göstermektedir. Ambiguus ve soliter nükleus retiküler internöronları da enfekte olmuş olup EGFP için güçlü şekilde boyanmaktadır. Bu internöronlar, motor nöron havuzları ve kontralateral nucleus ambiguus dahil olmak üzere çeşitli yapıları birbirine bağlar.Buna karşın, virüs yalnızca retrograd yönde yayıldığı için efferent hedefleri işaretlenmeden kalır. PRV ile sağkalım süresi sınırlıdır, ancak üçüncü ve daha yüksek dereceli hücrelerde EGFP boyanması görülebilir; motor korteksteki premotor nöronlar, periferik enjeksiyon bölgesinin kontralateral tarafında EGFP eksprese etmiştir. Muhtemelen yalnızca laringeal kas yapısının motor kortikal temsilini oluşturan hücre popülasyonu enfekte olmuştur.Ok uçlarıyla işaretlenen nucleus ambiguus seviyesindeki BDA etiketli aksonlar, laringeal kaslara yapılan enjeksiyonlarla retrograd olarak etiketlenen ve kahverengi olarak görülen CTB pozitif motor nöronlarla temas kurar; aksonlar, laringeal motor nöronların dendritleri ve soma bölgeleri yakınında varikositeler ve muhtemel terminal batonlar oluşturur. Bu varikositelerin sinaptik olup olmadığını belirlemek için elektron mikroskopi veya elektrofizyoloji kullanılarak daha fazla deney yapılması gerekmektedir. Laringeal bağlantılı motor kortekse yerleştirilen bilateral BDA enjeksiyonu siyah renkte görünür; BDA yönsel olarak spesifik olmadığı için hem aferent hem de efferent bağlantılar etiketlenmiş olabilir.Örneğin, talamusta hem anterograd markalamanın projeksiyon alanı hem de retrograd ile markalanmış hücre gövdeleri görülmektedir. Talamik hücreler ok başı ile tanımlanmıştır ve oryantasyon için capsula interna markalanmıştır. Psödo kuduz virüsü ve DAB ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve sterilizasyon gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.%10'luk çamaşır suyu çözeltisi kullanılarak, PRV veya DAB ile temas eden tüm malzemeler temizlenmelidir. Bu prosedür gerçekleştirilirken, biyotehlikeli katı ve sıvı atıkların kurumunuzun yönetmeliklerine uygun şekilde bertaraf edilmesi her zaman sağlanmalıdır.

transsynaptic-tracing-from-peripheral-targets-with-pseudorabies-virus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Synaptically bağlı nöronların izleme için bir yöntem tarif edilmektedir. Biz bir ilgi hücre popülasyonu tanımlı genetik hücre tiplerinden sinaptik girdi alıp almadığını soruşturma yönündeki bir hücrenin TVA özgüllüğü kullanın.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

İkili bir genetik stratejiden yararlanarak, Cre aracılı rekombinasyondan sonra tamamlayıcı transsinaptik izleyicileri eksprese eden farelerde nöral devre izleme için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hücreye özgü izleyici üretimi genetik olarak kodlandığından, deneysel yaklaşımımız, murin embriyonik beyin gelişimi sırasında tek hücre çözünürlüğünde nöral devrelerin oluşumunu ve olgunlaşmasını incelemek için uygundur.

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Biz bir in vitro hazırlık kullanarak beyin çekirdekleri içine anterograd veya retrograd tracer enjeksiyonları yoluyla nöronlar ve süreçlerini etiketlemek için bir teknik açıklar. Biz i n markalama doğruluğunu artırmak amacıyla bir avantaj floresan işaretli fare mutantları ve temel optik donanım alarak izleyici elektroporasyon vitro varolan yöntemi değiştirilebilir.

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Bu protokol değiştirilmiş kuduz virüsü floresan işaretlerini ifade ve bağımsız, tarafsız küme farklı nöronal alt sınıfları arasında morfolojik metrik kapsamlı karakterizasyonu olanak analizleri ile retrograd enfeksiyonu takiben etiketli seçici nöronal popülasyonlarının büyük ölçekli rekonstrüksiyon açıklar.

Morfolojik Ölçümler dayanarak büyük ölçekli yeniden düzenlemesi ve Bağımsız, Unbiased Kümelenme Seçici Populasyonlarında Nöronlar Sınıflandıran

Burada, etkili bir floresan yöntemi aracılığıyla karşılıklı bir sinirsel yol boyama ile etiketleme biotinylated dextran Amin (BDA) ortaya çıkarmak için rafine bir iletişim kuralı mevcut. Bu güzel yapı çözümleniyor için uygundur, etiketleme ve confocal bir lazer tarama mikroskop altında sinirsel diğer öğelerinden ayırt BDA.

Yüksek molekül ağırlıklı Biotinylated Dextran Amin uygulama içinde sıçan izleme Thalamocortical projeksiyon için geliştirmek

Biz optik bir tahlil sinaptik vezikül (SV) kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için açıklar. Bu iletişim kuralı bir presynaptic işaret ve protein ilgi ifade etmek için çift transfection ile birleştirerek presynaptic siteleri, onların sinaptik vezikül kapasitesi geri dönüşüm bulun ve faiz protein rolünü belirlemek için bize izin verir.

Sinaptik vezikül Presynaptic protein Overexpressing kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için optik bir tahlil

Mevcut protokol, hipokampusa ventral tegmental alan (VTA) glutamat projeksiyonlarının izlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, VTA glutamat terminallerinin CA1 putatif piramidal ateşleme hızını in vivo olarak nasıl modüle ettiğini göstermek için CA1 kaydı ile birleştirildi.

Hipokampustaki Ventral Tegmental Alan Glutamat Terminallerinin Kombine In Vivo Anatomik ve Fonksiyonel İzlenmesi

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Transgenik floresan fareler kullanılarak, canlı hayvanlarda bozulmamış siyatik sinirin motor ve duyusal aksonları içinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için ayrıntılı protokoller tanımlanmıştır.

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi

Seri iki fotonlu tomografi (STPT) görüntüleme, iki fotonlu görüntülemeyi otomatik evre kontrolü ve mikrotom dilimleme ile birleştirerek bir doku kütlesini üç boyutlu şeklinde görüntülemek için kullanılan bir tekniktir. Burada, marmoset beyinlerinin yapısal özelliklerini daha iyi anlamaları için bunu uygulamak için bir protokol açıklıyoruz.

Nöroanatomik Analizler için Tüm Marmoset Beyninin Seri İki Fotonlu Tomografisi

Keşfedin sinapslar arası izleme yöntemiyle periferik hedefleri düzenleyen santral premotor sinir devrelerini. Pseudorabies virüsü ve klasik izleme teknikleri kullanılarak nöronal bağlantılar haritalanır ve doğrulanır.

Transsinaptik Kolera Toksin ve Biotinlenmiş Dekstran Aminler Çift Etiketleme Ardından Pseudorabiese Virüs ile Periferik Hedefler gelen İzleme (Video) | JoVE Journal

Transsinaptik Kolera Toksin ve Biotinlenmiş Dekstran Aminler Çift Etiketleme Ardından Pseudorabies'e Virüs ile Periferik Hedefler gelen İzleme

Daha fazla video keşfet