Transfeksiyona Giriş
Transfeksiyon, DNA ve çift sarmallı RNA gibi genetik materyallerin memeli hücrelerine yerleştirilmesi işlemidir. Hücreye DNA yerleştirilmesi, hücrenin…
Transfeksiyon, DNA ve çift zincirli RNA gibi genetik materyallerin memeli hücrelerine aktarılması işlemidir. DNA aktarımı, hücrenin kendi mekanizması kullanılarak proteinlerin ekspresyonuna veya üretimine olanak tanır. Çift zincirli RNA aktarımı ise translasyonu durdurarak belirli bir proteinin üretimini kapatmak için kullanılır. Bu güçlü araç, araştırmacıların gen fonksiyonu ve ekspresyonunu, protein fonksiyonunu ve genetik mutasyonları daha iyi incelemesine imkan sağlamıştır.
Tek bir transfeksiyon reaktifi veya yöntemi tüm hücre tipleri için uygun değildir. Neyse ki, son birkaç on yılda çok çeşitli hücrelerin transfeksiyonunu kolaylaştırmak için birçok yöntem ve reaktif geliştirilmiştir. Bu yöntemler iki ana gruba ayrılabilir: kimyasal ve fiziksel transfeksiyonlar.
Bu videoda, son yıllarda giderek daha yaygın hale geldikleri için farklı kimyasal iletim sistemlerine odaklanacağız. Bu yöntemler arasında birkaç örnek olarak lipid tabanlı yaklaşımlar, kalsiyum fosfat aracılı transfeksiyon ve katyonik polimerlerin kullanımı yer almaktadır.
Tüm kimyasal transfeksiyon yöntemlerinin temel prensibi benzerdir. Hepsi, nükleik asitleri hücresel iletim için paketlemek amacıyla onlarla kompleks oluşturan pozitif yüklü taşıyıcı molekülleri kullanır. Bu taşıyıcı moleküller, hücre zarı bariyerinin negatif yükünü aşarak içeriğini iletmek için zardan geçmelerine olanak tanır.
Lipit transfeksiyonunda, katyonik lipitler bir lipozom oluşturur ve bu lipozom daha sonra nükleik asitlerle birleşerek bir “transfeksiyon kompleksi” meydana getirir. Kalsiyum fosfat ise DNA'yı basitçe yoğunlaştırır ve ona net bir pozitif yük kazandırır. Ek olarak, polietilenimin gibi katyonik polimerler DNA'yı pozitif yüklü partiküller halinde yoğunlaştırır.
Kimyasal aracılı transfeksiyondaki bir sonraki adım, pozitif yüklü komplekslerin basit elektrostatik çekim yoluyla negatif yüklü hücre zarına tutunmasıdır.
Ardından kompleks, moleküllerin endozom adı verilen membranla çevrili veziküller aracılığıyla hücreye girdiği bir süreç olan endositoz yoluyla hücreye girer.
Hücre içine girdikten sonra nükleik asitler, henüz bilinmeyen bir süreçle endozomdan kaçmalıdır. Endozomun dışına çıkan nükleik asitler, hücrenin sitoplazmasında ve nihayetinde hücrenin mekanizmasının ondan mRNA ve ardından protein üretebildiği çekirdekte yer alır. Sitoplazma, küçük interferans RNA'nın veya siRNA'nın, hücrenin protein üretim mekanizmasının bir parçasına müdahale ederek protein üretimini azalttığı etki bölgesidir.
Transfekte edilen DNA, stabil veya geçici olarak bulunabilir. Stabil transfeksiyonlar, transfekte edilen DNA'nın genoma entegre olduğu ve bu nedenle hücre bölündükçe kalıcı olduğu durumlarda gerçekleşir. Geçici transfeksiyonlar ise DNA'nın genoma dahil olmadığı ve kodlanan proteinin ekspresyonunun yaklaşık 24-96 saatlik bir süre içinde kaybolduğu durumlarda meydana gelir.
DNA transfeksiyonunun verimliliği tipik olarak, eklenen gene bağlı raporlayıcı sistemler aracılığıyla ölçülür. Bunlar, yeşil floresan protein örneğinde olduğu gibi raporlayıcı proteinin kendisinin doğrudan gözlemlenmesiyle veya lusiferaz enzim raporlayıcısı örneğinde olduğu gibi kolorimetrik bir analiz kullanılarak enzimatik aktivitesinin ölçülmesiyle kolayca tespit edilebilen sistemlerdir. Stabil DNA transfeksiyonu, en iyi RT-PCR gibi genomik analizlerle ölçülür.
siRNA susturma başarısını ölçmek için, her örnekteki hedef protein seviyeleri İmmünoblot ile belirlenebilir. Başarılı bir siRNA transfeksiyonu, hücrelerdeki hedef proteinin ekspresyonunu azaltmalı, bu sırada housekeeping gen olan GAPDH seviyeleri stabil kalmalıdır.
Transfeksiyon verimliliğini maksimize etmek için hücreler logaritmik büyüme fazında tutulmalı ve transfeksiyon anında %40 ile %80 arasında konfluens değerine sahip olmalıdır. Bunu başarmak için kültürdeki hücreler bir gün önce hasat edilmeli… sayılmalı… ve transfeksiyon anında doğru konfluens seviyesini sağlayacak bir konsantrasyonda çok kuyucuklu plakaya ekilmelidir.
Ardından, kimyasal reaktifler ve nükleik asitler karıştırılır ve nükleik asit-reaktif komplekslerinin oluşması için süre tanınır. Her bir kimyasal iletim sistemi için her bileşenin spesifik konsantrasyonları optimize edilmelidir.
Daha sonra nükleik asit-reaktif kompleksleri plakadaki hücrelere eklenir ve komplekslerin hücrelere tutunup transfeksiyona aracılık etmesi için genellikle gece boyunca inkübe edilir. 24 saat sonra besiyeri uzaklaştırılmalı ve taze kültür besiyeri ile değiştirilmelidir.
Transfeksiyonun birçok varyasyonu ve uygulaması mevcuttur. Ko-transfeksiyon, bir araştırmacının yanlış anlamalı (missense) mutasyonların hücresel proteinlerin fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemesine olanak tanır. Burada, endojen BRCA1 proteinini aşağı regüle etmek için HeLa hücrelerine RNAi transfekte edilmiştir ve bu durum GFP pozitif hücre sayısında bir azalmaya neden olur. Aynı zamanda, hücre tarafından mutant bir BRCA1 proteini de transfekte edilmiş ve üretilmiştir. Eğer mutasyona uğramış protein tam fonksiyonel ise GFP pozitif hücre sayısında bir toparlanmaya neden olmuş, ancak mutasyon fonksiyonu olumsuz etkilemişse GFP pozitif hücre sayısı düşük kalmıştır.
Kimyasal transfeksiyon yöntemlerine alternatif olarak, burada gösterilen bir araştırmacı, kültürdeki hücrelere DNA kaplı altın partikülleri fırlatmak için bir gen tabancası kullanmaktadır. Sitoplazmalarında DNA kaplı küçük mermilerle sonuçlanan hücrelerin transfekte olma şansı yüksektir.
Transfeksiyon için bir başka alternatif yöntem elektroporasyondur. Elektroporasyon, hücrelerin onarma süresinden önce DNA veya RNA'nın hücreye girmesine izin vermek için hücre membranına zarar vermek amacıyla elektrik akımının kullanılmasıdır. Burada, bir fare beyninin etrafına cımbız elektrotlar yerleştirilmiş ve mavi solüsyon içindeki enjekte edilmiş RNAi moleküllerinin ex-vivo transfeksiyonunu başlatmak için beyinden kısa elektrik darbeleri geçirilmiştir. Ardından, gen susturmanın gelişmekte olan korteksin yapısı üzerindeki etkileri gözlemlenir.
JoVE'nin transfeksiyona dair videosunu izlediniz. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Transfeksiyon, DNA ve çift zincirli RNA gibi genetik materyallerin memeli hücrelerine aktarılması işlemidir. DNA aktarımı, hücrenin kendi mekanizması kullanılarak proteinlerin ekspresyonuna veya üretimine olanak tanır. Çift zincirli RNA aktarımı ise translasyonu durdurarak belirli bir proteinin üretimini kapatmak için kullanılır. Bu güçlü araç, araştırmacıların gen fonksiyonu ve ekspresyonunu, protein fonksiyonunu ve genetik mutasyonları daha iyi incelemesine imkan sağlamıştır.
Tek bir transfeksiyon reaktifi veya yöntemi tüm hücre tipleri için uygun değildir. Neyse ki, son birkaç on yılda çok çeşitli hücrelerin transfeksiyonunu kolaylaştırmak için birçok yöntem ve reaktif geliştirilmiştir. Bu yöntemler iki ana gruba ayrılabilir: kimyasal ve fiziksel transfeksiyonlar.
Bu videoda, son yıllarda giderek daha yaygın hale geldikleri için farklı kimyasal iletim sistemlerine odaklanacağız. Bu yöntemler arasında birkaç örnek olarak lipid tabanlı yaklaşımlar, kalsiyum fosfat aracılı transfeksiyon ve katyonik polimerlerin kullanımı yer almaktadır.
Tüm kimyasal transfeksiyon yöntemlerinin temel prensibi benzerdir. Hepsi, nükleik asitleri hücresel iletim için paketlemek amacıyla onlarla kompleks oluşturan pozitif yüklü taşıyıcı molekülleri kullanır. Bu taşıyıcı moleküller, hücre zarı bariyerinin negatif yükünü aşarak içeriğini iletmek için zardan geçmelerine olanak tanır.
Lipit transfeksiyonunda, katyonik lipitler bir lipozom oluşturur ve bu lipozom daha sonra nükleik asitlerle birleşerek bir “transfeksiyon kompleksi” meydana getirir. Kalsiyum fosfat ise DNA'yı basitçe yoğunlaştırır ve ona net bir pozitif yük kazandırır. Ek olarak, polietilenimin gibi katyonik polimerler DNA'yı pozitif yüklü partiküller halinde yoğunlaştırır.
Kimyasal aracılı transfeksiyondaki bir sonraki adım, pozitif yüklü komplekslerin basit elektrostatik çekim yoluyla negatif yüklü hücre zarına tutunmasıdır.
Ardından kompleks, moleküllerin endozom adı verilen membranla çevrili veziküller aracılığıyla hücreye girdiği bir süreç olan endositoz yoluyla hücreye girer.
Hücre içine girdikten sonra nükleik asitler, henüz bilinmeyen bir süreçle endozomdan kaçmalıdır. Endozomun dışına çıkan nükleik asitler, hücrenin sitoplazmasında ve nihayetinde hücrenin mekanizmasının ondan mRNA ve ardından protein üretebildiği çekirdekte yer alır. Sitoplazma, küçük interferans RNA'nın veya siRNA'nın, hücrenin protein üretim mekanizmasının bir parçasına müdahale ederek protein üretimini azalttığı etki bölgesidir.
Transfekte edilen DNA, stabil veya geçici olarak bulunabilir. Stabil transfeksiyonlar, transfekte edilen DNA'nın genoma entegre olduğu ve bu nedenle hücre bölündükçe kalıcı olduğu durumlarda gerçekleşir. Geçici transfeksiyonlar ise DNA'nın genoma dahil olmadığı ve kodlanan proteinin ekspresyonunun yaklaşık 24-96 saatlik bir süre içinde kaybolduğu durumlarda meydana gelir.
DNA transfeksiyonunun verimliliği tipik olarak, eklenen gene bağlı raporlayıcı sistemler aracılığıyla ölçülür. Bunlar, yeşil floresan protein örneğinde olduğu gibi raporlayıcı proteinin kendisinin doğrudan gözlemlenmesiyle veya lusiferaz enzim raporlayıcısı örneğinde olduğu gibi kolorimetrik bir analiz kullanılarak enzimatik aktivitesinin ölçülmesiyle kolayca tespit edilebilen sistemlerdir. Stabil DNA transfeksiyonu, en iyi RT-PCR gibi genomik analizlerle ölçülür.
siRNA susturma başarısını ölçmek için, her örnekteki hedef protein seviyeleri İmmünoblot ile belirlenebilir. Başarılı bir siRNA transfeksiyonu, hücrelerdeki hedef proteinin ekspresyonunu azaltmalı, bu sırada housekeeping gen olan GAPDH seviyeleri stabil kalmalıdır.
Transfeksiyon verimliliğini maksimize etmek için hücreler logaritmik büyüme fazında tutulmalı ve transfeksiyon anında %40 ile %80 arasında konfluens değerine sahip olmalıdır. Bunu başarmak için kültürdeki hücreler bir gün önce hasat edilmeli… sayılmalı… ve transfeksiyon anında doğru konfluens seviyesini sağlayacak bir konsantrasyonda çok kuyucuklu plakaya ekilmelidir.
Ardından, kimyasal reaktifler ve nükleik asitler karıştırılır ve nükleik asit-reaktif komplekslerinin oluşması için süre tanınır. Her bir kimyasal iletim sistemi için her bileşenin spesifik konsantrasyonları optimize edilmelidir.
Daha sonra nükleik asit-reaktif kompleksleri plakadaki hücrelere eklenir ve komplekslerin hücrelere tutunup transfeksiyona aracılık etmesi için genellikle gece boyunca inkübe edilir. 24 saat sonra besiyeri uzaklaştırılmalı ve taze kültür besiyeri ile değiştirilmelidir.
Transfeksiyonun birçok varyasyonu ve uygulaması mevcuttur. Ko-transfeksiyon, bir araştırmacının yanlış anlamalı (missense) mutasyonların hücresel proteinlerin fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemesine olanak tanır. Burada, endojen BRCA1 proteinini aşağı regüle etmek için HeLa hücrelerine RNAi transfekte edilmiştir ve bu durum GFP pozitif hücre sayısında bir azalmaya neden olur. Aynı zamanda, hücre tarafından mutant bir BRCA1 proteini de transfekte edilmiş ve üretilmiştir. Eğer mutasyona uğramış protein tam fonksiyonel ise GFP pozitif hücre sayısında bir toparlanmaya neden olmuş, ancak mutasyon fonksiyonu olumsuz etkilemişse GFP pozitif hücre sayısı düşük kalmıştır.
Kimyasal transfeksiyon yöntemlerine alternatif olarak, burada gösterilen bir araştırmacı, kültürdeki hücrelere DNA kaplı altın partikülleri fırlatmak için bir gen tabancası kullanmaktadır. Sitoplazmalarında DNA kaplı küçük mermilerle sonuçlanan hücrelerin transfekte olma şansı yüksektir.
Transfeksiyon için bir başka alternatif yöntem elektroporasyondur. Elektroporasyon, hücrelerin onarma süresinden önce DNA veya RNA'nın hücreye girmesine izin vermek için hücre membranına zarar vermek amacıyla elektrik akımının kullanılmasıdır. Burada, bir fare beyninin etrafına cımbız elektrotlar yerleştirilmiş ve mavi solüsyon içindeki enjekte edilmiş RNAi moleküllerinin ex-vivo transfeksiyonunu başlatmak için beyinden kısa elektrik darbeleri geçirilmiştir. Ardından, gen susturmanın gelişmekte olan korteksin yapısı üzerindeki etkileri gözlemlenir.
JoVE'nin transfeksiyona dair videosunu izlediniz. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between transfecting DNA and RNA into cells?
DNA transfection enables protein expression using the cell's machinery, while RNA transfection, particularly double-stranded RNA or siRNA, shuts down specific protein production by stopping translation. DNA must reach the nucleus for effective expression, whereas RNA acts in the cytoplasm. DNA can be stably incorporated into the genome or transiently expressed, while RNA effects are temporary.
Q2: How do chemical transfection methods deliver genetic material into cells?
Chemical transfection uses positively charged carrier molecules—such as cationic lipids, calcium phosphate, or polymers—that complex with negatively charged nucleic acids. These complexes attach to the negatively charged cell membrane through electrostatic attraction, then enter via endocytosis in membrane-bound vesicles called endosomes. The nucleic acids escape the endosome and reach their destination in the cytoplasm or nucleus.
Q3: What cell conditions optimize transfection efficiency?
Cells should be in log phase growth and between 40 and 80% confluent at transfection time. Prepare cells by harvesting them the day before, counting them, and seeding at appropriate concentration. After adding nucleic acid-reagent complexes, incubate overnight to allow attachment and transfection. Replace media with fresh culture after 24 hours to support cell recovery and gene expression.
Q4: How is transfection efficiency measured in cells?
Reporter systems tethered to inserted genes measure DNA transfection efficiency. Green fluorescent protein can be directly observed, while luciferase enzyme activity is measured using colorimetric assays. Stable transfection is verified by genomic analysis such as RT-PCR. For siRNA silencing success, immunoblot analysis determines target protein levels; successful transfection decreases target protein while housekeeping genes like GAPDH remain stable.
Q5: What is the difference between stable and transient transfection?
Stable transfection occurs when transfected DNA integrates into the genome and persists through cell division, creating permanent genetic changes. Transient transfection involves DNA that remains outside the genome, resulting in temporary protein expression lasting 24 to 96 hours before being lost. Stable transfection is measured by genomic analysis, while transient effects are detected through reporter systems.
Q6: What are alternative physical methods for transfecting cells?
Electroporation uses electrical current to temporarily damage the cell membrane, allowing DNA or RNA entry before cells repair. A gene gun fires gold particles coated with DNA directly into cells; particles reaching the cytoplasm enable transfection. These physical methods complement chemical approaches and are useful for cell types resistant to chemical reagents or for in vivo applications like brain tissue transfection.
Q7: How can co-transfection be used to study protein mutations?
Co-transfection simultaneously introduces interfering RNA and mutant DNA into the same cell. RNAi down-regulates the endogenous protein while the transfected mutant version is produced. Comparing functional outcomes—such as recovery of fluorescent reporter signals—reveals whether the mutation preserves or impairs protein function. This approach enables direct assessment of mutation effects on cellular processes.