Bir In-vitro hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, işlevsel olarak canlı nöronları ve CLIA'yı yetişkin fare myenteric pleksusundan izole etmektir. Bu, önce steril hücre kültürü yüzeyinin polilisin ve laminin ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, myenterik pleksus izolasyonu için solüsyonların ve cerrahi alanın hazırlanmasıdır.

Daha sonra, gastrointestinal sistemi çıkarın ve uzunlamasına kas myenterik pleksus hazırlığı oluşturmak için istenen bölümü izole edin. Son adım, LMMP'yi kollajenaz ve tripsin içinde sırayla sindirmek ve ardından hücreleri önceden kodlanmış hücre kültürü yüzeyleri üzerine kaplamaktır. Sonuç olarak, elektrofizyoloji, immünosito kimyası ve tek hücreli PCR, enterik nöronların, glia'nın veya bu iki hücre tipi arasındaki etkileşimin etkilerini incelemek için kullanılabilir.

Prosedürü göstermek, tüm laboratuvarlarda doktora sonrası bir araştırmacı olan Dr.Trisha Har Smith olacak ve ona tüm laboratuvarlarda doktora adayı olan Joy Gombe yardımcı olacak. Bu tekniğin mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, nöronların ve glia'nın yetişkin fareden gelmesidir. Bu, potansiyel olarak genetiği değiştirilmiş hayvanlardan gelebilecek tamamen işlevsel nöronlara ve glialara izin verir.

Bu yöntem, nöronların elektriksel özellikleri hakkında fikir verebilir. İmmünosito kimyası, tek hücreli PCR ve gerçek zamanlı kalsiyum görüntüleme gibi diğer metodolojilere de uygulanabilir. Bu prosedüre, ötenazi uygulanmış bir fareyi cerrahi yüzeye dorsal yaslanmış olarak yerleştirerek başlayın.

Daha sonra karın derisini% 70 etanol ile temizleyin. Daha sonra bir çift forseps ile kaldırın ve iç sindirim organlarını ortaya çıkarmak için karın boşluğunu makasla açın. Bundan sonra, mezentary'yi ortaya çıkarmak için ileumun bir bölümünü kaldırın.

Gastrointestinal sistemi çıkarın ve makasla mezenteri kesin. Ardından ileum ve kolonu nazikçe çıkarın ve çözün. Tam uzunluktaki bağırsak çözüldükten sonra mezenteri ileum ve kolondan çekmemeye dikkat edin.

Midenin distalinde ve çekumun proksimalinde bağırsaktan keserek ileumu çıkarın. Bu işlem aynı zamanda distalden çekuma, proksimal ve anüse kadar kolonun çıkarılmasıyla bir kolon dokusu ile de gerçekleştirilebilir. Sonraki bölüm, ileumu üç veya daha fazla büyük parçaya bölün

Tüm dışkı maddeleri ayrı bir atık kabına çıkarılana kadar kreb solüsyonunu bağırsak bölümünden nazikçe ovalayın. Temiz bölümü temiz etiketli Krebs kabına yerleştirin ve tüm ileum temizlenene kadar prosedürleri tekrarlayın. LMMP'yi çıkarmak için, ileumu iki ila dört santimetre küçük parçalara ayırın.

Daha sonra, plastik veya cam bir çubuğa bir ileum segmenti yerleştirin. İleum sıkıca oturmalı, ancak gevşek veya gergin olmamalıdır. Tüpü başparmağınızla çubuğa hafifçe sabitleyerek GI yolunun çubuk etrafında dönmesini önleyin.

Ardından, forseps ile GI yoluna hala bağlı olan mezenter parçalarını nazikçe çıkarın. Bundan sonra, LMMP'yi alttaki dairesel kastan ayırın. İlk önce forsepsin kenarını, mezenterin segmentin yukarıdan aşağıya tutturulduğu tüm çizgi boyunca hafifçe ovalayarak.

Daha sonra, uzunlamasına kasta yavaşça bir boşluk oluşturun. Ardından, uzunlamasına kas dairesel kastan ayrılmaya başlayana kadar çok hafif bir basınç uygularken en hafif yatay vuruşu kullanarak, boşluğun üstünden başlayan kreplerle birleştirilmiş bir pamuklu çubuk kullanarak uzunlamasına kası nazikçe uzaklaştırın. Bunu, mezsentary bağlantı noktası boyunca tüm şerit boyunca yapın.

Ardından, yukarıdan aşağıya ve arkaya doğru hareket ederek GI tüpünün etrafında nazikçe çalışın. Uzunlamasına kas, tüpün etrafındaki dairesel kastan yavaşça ayrılır. Tamamlandığında, LMMP doğal olarak kalan GI tüpünden çıkacaktır.

Daha sonra elde edilen ince uzunlamasına kas şeridini LMMP etiketli behere yerleştirin ve bu prosedürdeki tüm segmentler için prosedürleri tekrarlayın. Durulamayı LMMP segmentlerine sindirim solüsyonuna yerleştirin. Ardından LMMP'yi makasla küçük parçalara ayırın.

Sonra, 60 dakika boyunca sindirin. 37 santigrat derece su banyosunda, karbojen ile hafifçe köpürtülürken bir çalkalayıcı. Sindirim tamamlandıktan sonra, hücreleri bir santrifüjde 356 Gs'de sekiz dakika santrifüjleme ile toplayın, dört santigrat dereceye kadar soğutun.

Bu arada, steril 50 mililitrelik bir hücre kültürü tüpüne bir mililitre ısıtılmış %0.25 tripsin ve dört mililitre ısıtılmış HBSS ekleyerek bir hücre kültürü davlumbazında% 0.05 tripsin çözeltisi hazırlayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın, hücre peletini dikkatlice çıkarın ve beş mililitre% 0.05 tryin çözeltisi ile temiz bir tüpe yerleştirin. Daha sonra, hücreleri 37 santigrat derece su banyosunda yedi dakika çalkalanarak% 0.05 tryin çözeltisinde sindirin, tryin'i 10 mililitre soğuk durulama ortamı ile nötralize edin.

Yedi dakikalık tripsin tedavisinden sonra, hücreleri 356 gs'de sekiz dakika santrifüjleyin. Bu arada, sterilize edilmiş TX ağının denge bölümü, steril 15 mililitrelik bir hücre kültürü tüpünün üzerine yerleştirilir. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın, hücre karışımını üç mililitrede tetikleyerek nazikçe yeniden süspanse edin.

Komple nöron ortamı. Tüm değişiklikler çok nazikçe yapılmalıdır: Hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için, hücre çözeltisini NYX ağından 15 mililitrelik temiz bir hücre kültürü tüpüne süzün. Hücreleri 356 g'da sekiz dakika santrifüjleme ile toplayın.

Bundan sonra, süpernatanı çıkarın ve atın. Hücreleri 1200 mikrolitre tam nöron ortamında yeniden askıya alın. Ardından, bir mililitrelik plastik pipet ucu kullanarak hücreleri nazikçe tleyin.

Hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin, çoğu parça parçalanana ve hücreler sıvıya asılana kadar yavaş ve nazikçe pipetleyin. Şimdi, önceden kodlanmış bir cam kapak fişi içeren 12 kuyucuğun her birine 750 mikrolitre komple ortam ekleyin. Daha sonra 100 mikrolitre nominal hücre çözeltisi ekleyin.

Nöronları% 5 karbondioksit değişimi ile 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Her iki günde bir hücre ortamının yarısı. Nöronlar, kültürde bir ila iki gün geçirdikten sonra elektrofizyolojik kayıtlar için hazırdır.

Burada enterik nöronların immünohistokimyasal karakterizasyonu gösterilmektedir. Lea fareden izole edildi. Uzunlamasına kas konfokal mikroskobu, fareden alınan tüm Mount ileal longitudinal kas preparasyonunda nöronal spesifik beta üç tübülin boyamasını ortaya çıkardı.

Ve bunlar, kal bağlanması için pozitif olarak boyanan nöronları içeren LMMP preparatlarından izole edilen hücrelerdir ve burada gösterilen Retin glia hücreleri, gliaya özgü belirteç GFAP ile görselleştirilmiştir. Bununla birlikte, primer antikor atlandığında lekelenme görülmedi. İşte fare uzunlamasına kasından izole edilen nöronlar ve glia, birbirine yakın olarak büyüyor.

Konfokal mikroskopi görüntüleri, yeşil nöronların ve kırmızı ggl'nin birbirine bitişik olarak kolayca büyüdüğünü ve in vitro olarak etkileşime girdiğini gösterir. Bu şekil, mevcut klemp modunda kültürlenmiş enterik nöronların ve CLIA'nın elektrofizyolojisini göstermektedir. Tüm nöronlar, akım enjeksiyonu üzerine aksiyon potansiyelleri gösterdi.

CLIA'nın aksiyon potansiyelleri yoktur, ancak akım enjeksiyonuna yanıt olarak büyük elektrotonik potansiyeller gösterir. Fare ileumundan kültürlenen nöronlar elektrofizyolojik heterojen bir popülasyondur. Akım kelepçe modunda, nöronlara 0.09 nano amperlik bir akım enjeksiyonu, aksiyon potansiyelleri ile sonuçlanır.

A HP negatif nöronlar, stimülasyonu takiben hemen dinlenme zarı potansiyeline geri döner. Bir HP pozitif nöronlar, dinlenme zarı potansiyelinin yavaş yavaş başlangıç değerine dönmeden önce taban çizgisinin altına düştüğü stimülasyonu takiben bir A HP gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, cam eşyaları ve cerrahi aletleri mümkün olduğunca temiz tutmayı unutmamak önemlidir. Ayrıca hücreleri nazikçe yineleyin ve köpürtün ve bu prosedürü takip eden her iki günde bir hücre kültürü ortamının yarısını değiştirin. Bağırsaktaki iyon kanallarının ilaç tedavisine nasıl yanıt verdiği gibi ek soruları yanıtlamak, nöronlarda ve lia'da proteinlerin ekspresyonu hakkında bilgi edinmek ve bu iki hücre tipinin etkileşiminin geliştirildikten sonra çeşitli tedavilerle nasıl değiştirildiği hakkında bilgi edinmek için elektrofizyoloji ve immünosito kimyası gibi yöntemler uygulanabilir.

Bu teknik, nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların, genetiği değiştirilmiş hayvanlarda enterik sinir sisteminin nöropatilerinin ve g nöropatilerinin temel işlevlerini keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, yetişkin fare enterik sinir sisteminin TER pleksusundan nöronları ve glia'yı nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.