Name: Bir In-vitro hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Keşfedin, yetişkin fare miyenterik pleksusundan fonksiyonel nöron ve glia hücrelerinin izolasyonu için hücre kültürü protokolü. Bu yöntem, enterik sinir sistemi bileşenlerinin ayrıntılı incelenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sağlık Hibe DA024009 Ulusal Enstitüsü, DK046367 &amp; T32DA007027.

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürlere uygun olarak ve Virginia Commonwealth Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. 24-yuvalı plakalar içinde steril Poli-D-lizin ve laminin kaplı cam lameller hazırlanması <ol><li> Adım 1 için tüm işlemler steril koşullarda yapılmaktadır, bir başlık altında ve steril reaktifler ile. Cam lamelleri ve çift deiyonize su (GKD 2 O) önceden sterilize edilmelidir. Tabak hazırlanması nöron izolasyonu önce iki hafta kadar yapılabilir. </li><li> Kaputun altında, bir 24 plaka 12 kuyu otoklava cam lamelleri yerleştirmek için steril forseps kullanabilir. </li><li> Vaktinden poli-D-lizin stok hazırlayın. 5 mg poli-D-lisin ile steril ddH2O 50 ml ilave edilir. -20 ° C&#39;de vorteks ve 3 ml alikotları mağaza Kullanmadan önce alikotları çözülme. </li><li> Pipet 80 ul: 25 cm2 başına 1 ml poli-D-lizin hazır bir son konsantrasyon için,Her bir cam lamel üzerine (2 cm 2) üstüne poli-D-lisin stoklar. Çözüm 10 dakika dinlendiriniz. </li><li> Poli-D-lizin kullanarak vakum çıkarın ve steril GKD 2 O. ile 3x lamelleri yıkayın </li><li> Plakaları başlık altında en az 2 saat kurumasını bekleyin. </li><li> Plakalar 4 ° C veya saklanabilir - 20 ° C laminin kaplama geçmeden önce. </li><li> Vaktinden laminin stok hazırlayın. Buz üzerinde laminin çözülme ve kullanım sırasında buz üzerinde tutmak. 50 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar seyreltilir; konsantrasyonu çok dikkat edin; her biri çok farklı olacaktır. Çok konsantrasyonuna bağlı olarak, yaklaşık 20 ml GKD 2 O laminin her flakon eklenecektir. -80 Alikot (5 mi) ve mağaza ° C Kullanmadan önce buz üzerinde hacimde çözülme. </li><li> 5 mg / cm 2 laminin ile kaplayın lamelleri, her lamel laminin stok pipet 200 ul. </li><li> 1 saat boyunca lamelleri, laminin çözelti inkübe edin. </li><li> Kalan laminin çözüm aspire ve bir kez lamelleri yıkayınGKD 2 O. Lamelleri yüzey kazıma kaçının. </li><li> Kadar iki hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın plakalar. </li></ol> 2. Nöron İzolasyon Çözümleri önceden hazırlanması <ol><li> (: 118 NaCl, 4.6 KCl, 1.3 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 25 NaHCO3, 11 glikoz ve 2.5 CaCl 2 NaH mM) Krebs çözeltisi hazırlayın. Yeri 13.79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), 0,289 g MgSO 4 (FW 120.4), 4.20 g NaHCO3 (FW 84.01), 3.96 g glukoz (FW 180.2), ve 2 L GKD 2 0 içinde 0.555 g CaCI2 (FW 111). 4 ° C&#39;ye soğutun </li><li> Ortamı (% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotik / antimikotik ile F12 ortamı) durulama hazırlayın: F12 ortamı 500 ml&#39;lik bir şişe için 50 ml FBS ve antibiyotik / antimikotik 100x sıvı (Gibco) ve 5 ml ekleyin. </li><li> Enterik nöron ortamı (Neurobasal B-27 içeren bir ortam, 2 mM L-glutamin,% 1 FBS, 10 ng / ml, gliyalden türevlenmiş Neurotr hazırlanmasıophic faktör (GDNF) ve antibiyotik / antimikotik 100x sıvı). GDNF stok yapmak için, -80 ° C de 10 mg GDNF için 1 ml GKD 2 O ekleyin ve 50 ul alikotları, mağaza geri dondurma Tam nöron bir ortam 50 ml&#39;lik bir şişe için, 47.5 mi Neurobasal bir ortam, 1 mi B-27 (50x), 500 ul FBS, 500 ul 200 mM L-glutamin (Gibco) ve 50 ul stok GDNF ve 500 ul / antibiyotik kombine antimikotik 100x Sıvı. Medya GDNF tazelik sağlamak ve bu pahalı cep medya karışımı büyük miktarda kirlenmesini önlemek için küçük 50 ml gruplar halinde yapılır. </li></ol> 3. Fareler ile hasat boyuna kas / myenterik Pleksus (LMMP) hazırlanması <ol><li> Hayvan deneylerinde gerçekleştirmeden önce uygun ulusal ve kurumsal etik yerinde olmalıdır. 25 g (genellikle yaş 8 hafta boyunca) üzerinden ağırlığında Yetişkin Swiss Webster fareler önce deneylere 6 gruplar halinde yerleştirilmiştir. İki farelerden alınan dokular İleal enterik nöronlar ve glia izolasyonu için kullanılır ve üç farenin için kullanılırkolon hücrelerin izolasyonu. </li><li> Cerrahi alan hazırlayın. Küçük cerrahi makas, açılı forseps, pamuklu, üç 200 ml cam bardak ve cam / plastik çubuk (fırça) toplayın. Tüm malzemeleri iyice yıkanmış ve kontaminasyonu en aza indirmek için kullanmadan önce durulanır olun. Bu adım, deney bir gün önce gerçekleştirilebilir. </li><li> PH stabilize etmek için, en az 30 dakika karbojen (% 95 oksijen,% 5 CO2) buz ve kabarcık Krebs çözeltisi yerleştirin. </li><li> Istenen sıcaklıklarda stabilize etmek için çeşitli ekipman ve sıcak kimyasal açmak; 37 ile sıcak su banyosu (ler) ° 4 ° C&#39;de, bir yer Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ve su banyosu içinde% 0.5 tripsin (37 ° C-C, serin santrifüj .) Komple nöron medya ve durulama medya buzdolabında kalmalıdır. </li><li> Yeri 150 ml buz gibi &#39;kirli&#39;, &#39;temiz&#39; ve &#39;LMMP&#39; etiketli üç 200 ml cam bardak içinde Krebs kabarmış. Kabarcık beher carbogen ile &#39;LMMP&#39; etiketli. </li><li> Etik kurul, euthanize m onayından sonraservikal dislokasyon veya CO 2 boğulma ouse. </li><li> % 70 EtOH ile cerrahi yüzey, temiz cilde dorsal recumbence fare yerleştirin ve forseps kullanarak karın cilt kaldırın. Makas, açık karın boşluğu ve iç sindirim organları ortaya kullanma. </li><li> Ileum bir bölüm kaldırma ve mezenteri ortaya çıkararak, gastrointestinal yolun uzunluğu çıkarın. Makasla mezenter ile Snip yavaşça çıkarın ve ileum / kolondan mezenter çekmek için dikkatli olmak, ileum ve kolon çözülmeye. </li><li> Bağırsak tam uzunlukta sökülmüş sonra, bağırsak yoluyla çekum için mide distalinde ve proksimal keserek ileum çıkarın Not:. Bu prosedür de proksimalinde için çekum için distalinden kolon kaldırarak kolon doku ile yapılabilir anüs. </li><li> Dokular daha proksimal ve distal kolon ve jejenum ve ileum arasında bölünebilir. Bu işlemi geri kalanı ileum izolasyonu sevk edecektir; to işlem kolon LMMP en izolasyonu için aynıdır. Buz Krebs &#39;kirli&#39; olarak işaretlenmiş bir cam kapta tüm ileum yerleştirin. </li><li> Ileum temizlemek için bir araç oluşturmak ve bir dosyalama taş kullanarak künt büyük 20 G iğne buz soğuk Krebs içeren büyük bir şırınga (10 ml) ekleyin. </li><li> Üç ya da daha fazla büyük parçalar halinde ileum kesit tarafından ilumundan dışkı temizleyin. Beher bir ileal kısmını çıkarın ve bir ileal parçasının ucunu Kör İğne yerleştirin. </li><li> Tüm dışkı ayrı bir atık kabı içine kaldırılır kadar yavaşça bağırsak bölümü üzerinden Krebs çalıştırın. &#39;Temiz&#39; olarak işaretlenmiş Krebs kaba temizlenmiş bölümüne yerleştirin. Tüm ileum temizlenir kadar tekrarlayın. </li><li> LMMP kaldırmak için, yaklaşık 2, küçük bölümler halinde ileum kesmek - 4 cm. Bir plastik veya cam çubuk üzerinde ileum bir segment yerleştirin; ileum kuytu uygun ama (~ 2 mm) gevşek veya gergin olmamalıdır. Yavaşça mezenter parçaları kaldırarak LMMP çıkarılması başlayın hala eklemekBir forseps kullanarak gastrointestinal (Gİ) sistem için ed. Yavaşça başparmak kullanarak çubuk için tüp iğneleyerek çubuk etrafında dönmesini gastrointestinal önleyin. </li><li> Temel dairesel kas LMMP ayırın, önce hafifçe hafifçe uzunlamasına kas bir boşluk yaratarak, üst segment altına, mezenter bağlı olduğu tüm hat boyunca forseps kenarına sürün. Sonra yavaşça Krebs ile ıslatılmış bir pamuklu çubuk kullanarak uzunlamasına kas uzak kızdırmak. </li><li> Uzunlamasına kas boşluğu üst başlar ve uzunlamasına kas sadece dairesel kas ayrı başlayana kadar çok hafif bir basınç uygularken hafif yatay vuruş kullanarak uzak kızdırmak; mezenter bağlantı noktası birlikte tüm şerit aşağı yapıyoruz. </li><li> Sonra yavaşça GI tüp etrafında çalışmaya başlar, boyuna kas yavaş yavaş tüp etrafında dairesel kas tüm yol ayrılır gibi yukarıdan aşağıya ve geriye hareket. Tamamlandığında,LMMP doğal olarak GI borusunun kalanı kapalı gelecektir. </li><li> &#39;LMMP&#39; işaretli beher uzunlamasına kas elde edilen ince bir şerit yerleştirin. Tüm kesimleri için tekrarlayın. </li><li> LMMP tüm şeritler tek bir fare elde edildikten sonra, kullanılan diğer fareler için işlemi tekrarlayın. Iyice Tekrar kullanmadan önce &#39;kirli&#39; ve &#39;temiz&#39; bardak durulayın. </li><li> Biyolojik kirlenme kaldırmak için 3x LMMP durulayın. Buz Krebs ile üç 2 ml Eppendorf tüpleri doldurun. Bir santrifüj içinde 356 x g&#39;de 30 saniye boyunca ilk tüp ve spin LMMP şeritleri yerleştirmek 4 ° C&#39;ye kadar soğutuldu Dikkatli bir pipet ile süpernatant kaldırmak ve sonraki temiz Krebs dolu tüpe LMMP şeritler hareket ettirin. Kalan her tüp için bu işlemi tekrarlayın. </li></ol> 4. Digest LMMP <ol><li> 10 ml carbogen-kabarmış Krebs solüsyonu 13 mg kollajenaz tip 2 ve 3 mg BSA koyarak sindirim çözeltisi hazırlayın. </li><li> Sindirim çözüm ve kullanım SCIS içine durulanır LMMP Yeri segmentlerisors küçük parçalar halinde LMMP snip için. </li><li> ° C su banyosunda çalkalayıcı ile 37 60 dakika hafifçe carbogen ile kabarmış olan süre Digest LMMP. </li><li> Sindirim tamamlandıktan sonra, 356 x g&#39;de santrifüj az 8 dakika boyunca santrifüj hücreleri toplamak için 4 ° C&#39;de soğutuldu </li><li> Bu noktadan itibaren tüm işlemler bir hücre kültürü kaputu steril koşullar altında yapılmalıdır! Tüm reaktifler ve kaplar kullanımdan önce sterilize edilmelidir. </li><li> Santrifüj sırasında, 1 mi yerleştirerek% 0.05 tripsin solüsyonu hazırlamak% 0.25 tripsin ısıtıldı ve 4 ml steril bir 50 ml hücre kültür tüpüne HBSS ısıtıldı. </li><li> Santrifüj sonra, kaldırmak ve supernatant atın. Bir vakum kullanmayın, bu olasılığı düşük santrifüj hızı nedeniyle hücre pelet emmek olacaktır. Dikkatlice% 0.05 tripsin solüsyonu 5 ml temiz bir tüp içine hücre pelet ve yer çıkarın. </li><li> 37 7 dakika boyunca çalkalanarak ° C su banyosu içinde% 0.05 tripsin solüsyonu hücreleri Digest. 7 mi aşmayınn toplam tripsin tedavi ya da nöronların yok olacak. </li><li> Tripsin muamelesi 7 dakika sonra soğuk durulama ortam 10 ml tripsin nötralize edilir. </li><li> 356 x g 8 dakika hücreler santrifüj. Çıkarın ve medya atın. </li><li> Santrifüj sırasında, steril bir 15 ml&#39;lik hücre kültürünün tüpün üstüne sterilize Nitex örgü bir bölümü dengesi. </li><li> Santrifüj sonra, kaldırmak ve supernatant atın. 3 ml tam ortam nöron içinde öğütülerek yavaşça tekrar süspansiyon hücre karışımı. Bu adımı ve hücre karışımı toz haline olduğu gelecekteki tüm adımları sırasında hava kabarcıkları oluşmasını önleyin. Tüm triturations çok nazikçe yapılmalıdır. Temiz 15 ml hücre kültürü tüp içine Nitex örgü süzülür hücre çözümü. </li><li> İsteğe bağlı: Cap hücre kültürü tüp ve 30 dakika için hafif haddeleme ve devirme ile soğutmalı Hula mikser yer (veya dönme sağlayan herhangi bir mikser). Bu adım isteğe bağlıdır, ancak önerilen olduğunu. </li><li> İsteğe bağlı: Hula mikser sonra hücreler yıkamak için 2 ml soğuk durulama medya ekleyin. </li><li> Santrifüj hücreleri (8 dk, 356 x g) toplayın. Çıkarın ve supernatant atın. </li><li> 1.200 ul tam nöron medya hücreleri tekrar süspansiyon. Yavaşça 1 ml plastik pipet kullanarak hücreleri Karışım. Hava kabarcıkları oluşturmaz. En parçalar kırık ve hücrelere sıvı içine askıya kadar yavaş ve nazikçe pipetle. </li><li> Bir ön-kaplamalı cam lamel içeren 12 gözeneği için tam ortam 750 ul ilave edilerek ezildi hücre çözeltisinden 100 ul ilave edin. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de hücre kültürü inkübatöründe inkübe nöronlar. </li><li> Hücre ortamı her 2 günde bir yarısı değiştirin. </li><li> Nöronlar 1 sonra elektrofizyolojik kayıtlar için hazır - kültüründe 2 gün. </li></ol>

<ol><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system%3A+A+second+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Hosp.+Pract.+%28Minneap%29%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system: A second brain.</a> Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).</li>
<li>Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+lytic%2C+latent%2C+and+reactivating+varicella-zoster+virus+infections+in+isolated+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons.</a> J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies%2C+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).</li>
<li>Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+neurones+in+the+myenteric+plexus+of+duodenum+in+the+guinea-pig%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig.</a> J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).</li>
<li>Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+myenteric+neurons+of+the+duodenum+in+the+guinea-pig%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig.</a> Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).</li>
<li>Rugiero, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+whole-cell+currents+by+patch+clamp+of+guinea-pig+myenteric+neurones+in+intact+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia.</a> J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).</li>
<li>Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+in+tissue+culture.+III.+studies+on+neuronal+survival+and+the+retention+of+biochemical+and+morphological+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation.</a> Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).</li>
<li>Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+decreases+enteric+neuron+excitability+via+inhibition+of+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels.</a> PLoS One. 7 (9), e45251(2012).</li>
<li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).</li>
<li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55 (5), 630-637 (2006).</li>
<li>Bassotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+and+their+role+in+gastrointestinal+motor+abnormalities%3A+Introducing+the+neuro-gliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies.</a> World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).</li>
<li>Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+genetics%2C+anatomy+and+function+of+enteric+neural+serotonergic+pathways+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice.</a> J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).</li>
<li>Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+vagal+afferents+innervating+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Auton.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract.</a> Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Auton.+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).</li>
<li>Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest-derived+cells+isolated+from+the+gut+by+immunoselection+develop+neuronal+and+glial+phenotypes+when+cultured+on+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin.</a> Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).</li>
</ol>

Yazarlar önemli bir çıkar çatışması var olduğunu beyan ederim.

Kullanılan hayvanların Bu protokol İsviçre Webster fareler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, sıçan gibi diğer küçük ölçekli memelilere ve farenin diğer suşları için de uyarlanabilir. Biz başarıyla C57 fare ve μ-opioid reseptör knock-çıkışları ile ön izolasyonları gerçekleştirdik. Ancak, bu farelerin diğer suşları GI morfolojik farklılıklar nedeniyle sorunlu olabilir olması da mümkündür. Ayrıca, nihai izolasyon nöronların çıkan karışım etkileyebilir LMMP hazırlanması 13...

Enterik sinir sistemi (ENS) sinir ve gastrointestinal (Gİ) sistem ve tüm uzunluğu çalışır glia geniş bir ağdır. ENS işlevsel peristaltizm, sıvı emme / salgılanması, uyaranların hissi, vb (yorum için 1) da dahil olmak üzere sindirim tüm yönleriyle, kontrol eder. Bu omurilik bulunan fazla 500 milyon nöron içerir ve beyinde bulunan her nörotransmitter sınıf içerir. Ayrıca, ENS bu merkezi sinir sistemi 2 girişi olmadan refleks olarak işlev görebilir benzersizdir. ENS anlaşılması normal fizyolojik rolünü anlamak için, ama (en Hirschsprung hastalığı), satın alınan (Chagas), hastalık durumları (diyabetik gastroparezi) bağlı, ilaç doğumsal olabilir nöropati çeşitli katılımının anlamak için değil sadece, çok önemlidir bağlı (opioid bağırsak sendromu) ya da yaralanma (postoperatif ileus) 1. nedeniyle. Buna ek olarak, enterik nöronlar yeniden olabilirviral enfeksiyon (varisella zoster) 3 servoir. Çünkü beyin ve bağırsak serotonin yüksek düzeyde olan benzerlikler, merkezi sinir sistemi kusurları tedavi edilmesini amaçlayan ilaçlar genellikle ENS 2 istenmeyen yan etkileri vardır. Bu tür Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi birçok nöropatiler ENS bu hastalıkların 4 patogenezinde incelemek için bir kolay kullanılabilir hale, merkezi nöronlarda kendi görünümünü çok önce enterik nöronların benzer hücresel değişiklikler gösteriyor olması da dikkat çekicidir. Bu nedenle, ENS tam bir anlayış hastalık durumları anlama ve farmakolojik yan etkileri önlemede / tahmin bir zorunluluktur. ENS olan nöronlar geleneksel olarak 8. 5-7 veya kültür nöronlar wholemount hazırlıkları kullanarak kobay olarak incelenmiştir. Nöronların bu büyük hayvan okudu olabilir hangi kolaylığı rağmen, bu model de dahil olmak üzere birçok sınırlamalar vardırgenetiği değiştirilmiş suşları, bu türe özgü reaktifler eksikliği ve bu konularda sipariş ve konut ile ilgili yüksek maliyetli olmaması. Bir kemirgen enterik sinir sistemi modeli geliştirme sistemleri, hücre kültürü tekniği ile birlikte kullanılabilecek diğer yöntemler arasında kurulan geniş bir dizi ve kobay modeli için bir doğrulama sağlama yeteneği üzerinden vuruş çeşitli en önemli avantajı vardır . Bağırsak peristaltik eylemleri için esas sorumlu olan dış myenterik pleksus (uzunlamasına ve dairesel kas arasında), hem de submukozal ve mukozal pleksi, (: ENS gastrointestinal sistem uzunluğu çalışan üç pleksi oluşur büyük ölçüde sıvı emilimi / salgılanmasını uyaran ve 1 algılama kontrol mukoza, sırasıyla) altında ve içinde bulunan. Bu yöntem, soyma ile uzunlamasına kas / myenterik pleksus (LMMP) hazırlık izolasyonu ile başlargastrointestinal dış kas tabakası kapalı. Bu dramatik mukoza tabakası izolasyon söz konusu olduğunda ortaya çıkan kirlenme sorunları azalır. Sonuç olarak, bu işlem oldukça ENS salgı işlemleri daha motilite sinirsel kontrolü çalışma için idealdir. Yöntemi burada enterik nöronlar ve glia karışık bir kültür sonuçlarını sundu. Nöronların en az iki farklı türde önceki mevcut elektrofizyolojik ve immünositokimyasal gözlemler 9 dayanmaktadır. Glia varlığı kendi başlarına çalışmak için önemli bir hücre tipi sadece gibi, son derece avantajlıdır, ancak enterik nöronlar 10 hayatta kalma katkıda bulunmak ve nöronal hücre yüzeyinde 11 yerli reseptör ifade korumak. Ayrıca, enterik glia eksiklikleri &#39;nöro-gliopathies&#39; 12 icat anormal gastrointestinal motilite hastalık durumları, yol açabilir. Bu nedenle, ENS kültür Burada yer RSoruşturma için olgunlaşmış birkaç hücre tiplerinde onu ç lar. Bu yöntem için avantajları izolasyon, ucuz araç gereksinimleri ve deneyimli laboratuvar personeli tarafından teknik ana kısa bir süre kolaylığı vardır. Metodoloji sınırlamaları düşük genel hücreli yüksek doku birimleri verim ve mukozal ve submukozal pleksi gelen ENS nöronların dışlama içerir. Bu işlem elektrofizyoloji, immünhistokimya, tek hücreli PCR ve diğer yöntemler konusunda uzmanlaşmış bilim adamları için son derece avantajlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Fisherbrand Büyüme Kapak Camları için Kapak Camı (12 mm çap)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Sigma</td><td>P6407- 5 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td>Herhangi bir marka</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences</td><td>354 232</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Laboratuvarda hazırlayabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml Steril Santrifüj Tüpü</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Herhangi bir marka</td></tr><tr><td>50 ml Steril Santrifüj Tüpü</td><td>kullanabilir Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>Herhangi bir marka</td></tr><tr><td>kullanabilir NaCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-212</td><td>MW 58.44</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>MW 74.55</td></tr><tr><td>NaH2PO4 .2H2O</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S369-3</td><td>MW137.99</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>MW 120.4</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-5KG</td><td>MW 84.01</td></tr><tr><td>glikoz</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td>MW 180.16</td></tr><tr><td>CaCl22H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>MW 147.02</td></tr><tr><td>F12 medya</td><td>Gibco</td><td>11330</td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Kalite Biyolojik A.Ş.</td><td>110-001-101HI</td><td>Herhangi bir marka</td></tr><tr><td>Antibiyotik / antimikotik 100x sıvı</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td> <td>& nbsp</td></tr> kullanabilirsiniz;<tr><td>Nörobazal A ortamı</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glial Kaynaklı Nörotrofik Faktör (GDNF)</td><td>Nöromik</td><td>PR27022</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Keskin Uçlu Diseksiyon Makası</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Herhangi bir markayı kullanabilir</td></tr><tr><td>Diseksiyon Doku Forsepsleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>Herhangi bir markayı kullanabilir</td></tr><tr><td>Pamuk Uçlu Aplikatörler</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>Herhangi bir markayı kullanabilir</td></tr><tr><td>250 ml Dereceli Cam</td><td>Beher Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td>Herhangi bir markayı kullanabilir</td></tr><tr><td>2 L Cam Erlenmyer şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-500-2000</td><td>Herhangi bir marka</td></tr><tr><td>kullanılabilir Plastik çubuk (çocuk boya fırçası)</td><td>Crayola</td><td>05 3516</td><td>Herhangi bir markayı kullanabilir</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN 3156</td><td>%5 CO2</sub</td></tr><tr><td>>10 ml Leur-lock Şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td>Herhangi bir markayı kullanabilir</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 inç. Hipodermik İğne</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Herhangi bir marka</td></tr><tr><td>Kollajenaz tip 2</td><td>Worthington LS004174</td><td></td><td></td></tr> kullanabilirsiniz;<tr><td>Sığır Serum Albümini</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2 ml Mikrosantrifüj Eppendorf tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-864-252</td><td>Herhangi bir marka</td></tr><tr><td>Nitrex Mesh 500 & micro kullanabilir; M</td><td>Elko Filtering Co</td><td>100560</td><td>Herhangi bir markayı kullanabilir</td></tr><tr><td>Pipet Seti</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-377-328</td><td>Herhangi bir markayı kullanabilir</td></tr><tr><td>Sharpeining Stone</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9681212</td><td>Herhangi bir markayı</td></tr><tr> kullanabilir<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LabGard ES 425 Biyolojik Güvenlik Kabini (hücre kültürü başlığı)</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Herhangi birini kullanabilir marka</td></tr><tr><td>10 L Çalkalama Su Banyosu</td><td>Edvotek</td><td>5027</td><td>Herhangi bir marka</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Boyut adaptörleri ile daha büyük tek bir santrifüj kullanabilir</td></tr><tr><td>Allegra 6 Serisi Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Herhangi bir marka</td></tr><tr><td>kullanabilir HuluMixer Numune Karıştırıcı</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td> <td>& nbsp;</td></tr><tr><td>AutoFlow Su Ceketi CO2 İnkübatörü</td><td>Nuiare</td><td>NU-4750</td><td>Herhangi bir markayı kullanabilir</td></tr><tr><td>Analitik Terazi</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS104</td><td>Herhangi bir markayı kullanabilir</td></tr></tbody></table>

bir<em&gt; in-vitro</emyetişkin mouse myenterik pleksus izole edilen enterik nöronlar ve glia bir&gt; hazırlanması

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Enterik sinir sistemi fonksiyonel mide-bağırsak hareketliliği kontrol gastrointestinal uzunluğu çalışan nöronlar ve glia geniş bir ağdır. Myenterik pleksustan nöron ve glia karışık bir nüfus izolasyonu ve kültürü için bir prosedür açıklanmıştır. Primer kültürlerinde nöronlar ve glia arasında gelişmekte olan bağlantıları ile, 7 gün boyunca korunabilir. Ekli myenterik pleksus ile uzunlamasına kas şerit fare ileum ya da kolon altında yatan dairesel kas sıyrıldı ve enzimatik sindirim tabi tutulur. Steril koşullar altında, izole edilmiş nöronal ve glial nüfus pelet aşağıdaki santrifüj içinde korunmuş ve lamelleri kaplama. 24-48 saat içinde, akson uzantısı oluşur ve nöronlar pan-nöronal belirteçler ile tespit edilebilir. Kültür içinde iki günden sonra izole nöronların yangın aksiyon potansiyelleri olarak yama kelepçe çalışmalar tarafından gözlenmiştir. Ayrıca, enterik glia da identif olabilirGFAP boyama ile ied. Yakın apozisyon nöronların ve glia bir ağ 5 içinde oluşturur - 7 gün. Enterik nöronların tek tek olması ve doğrudan bu immünhistokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme ve tek hücreli PCR gibi yöntemler kullanılarak incelenmiştir olabilir. Ayrıca, bu prosedür genetik olarak modifiye edilmiş hayvanlarda gerçekleştirilebilir. Bu metodoloji gerçekleştirmek için basit ve ucuzdur. Daha iyi normal ve hastalık durumlarında, ENS özelliğe keşfedebilir, böylece genel olarak, bu protokol, kolayca manipüle şekilde enterik sinir sisteminin bileşenlerini ortaya koyar.

<html> LMMP türetilmiş hücreler, nöronlar ve diğer hücre tipleri arasında hemen takip eden izolasyon kolayca belirgin olmayacaktır. Yaşam, belirsiz fenotip yuvarlak hücreler de tam olarak sindirilir doku parçaları ve bağ dokusu doku döküntü olarak görülebilir. Bu ayaktakımı hiçbir endişe ve büyük ölçüde iki gün içinde ilk medya değişikliği ile kaldırılacak. Sağlıklı, canlı hücreler de silinecektir bu önce slaytlar temizlemek için çalışmayın. Kültüründe bir gün sonra, nöronlar akson uzantısı g...

Bu enterik sinir sisteminin nöronal ve glial bileşenlerin doğrudan çalışma için bir hücre kültür protokolü göstermektedir. Lamelleri bir nöron / glia karışık kültür, immünohistokimyasal elektrofizyoloji, bireysel nöron ve glia fonksiyonu incelemek için yeteneği sağlayan yetişkin fare myenterik pleksustan hazırlanır<em&gt; Vb</em&gt;.

Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin fare miyenterik pleksusundan fonksiyonel olarak canlı nöronlar ve CLIA izole etmektir. Bu işlem, öncelikle steril hücre kültürü yüzeyinin polilizin ve laminin ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise miyenterik pleksus izolasyonu için çözeltilerin ve cerrahi alanın hazırlanmasıdır.Ardından, gastrointestinal kanalı çıkarın ve longitudinal kas miyenterik pleksus (LMMP) preparatı oluşturmak için istenen bölümü izole edin. Son adım, LMMP'nin sırasıyla kollajenaz ve tripsin ile sindirilmesi ve ardından hücrelerin önceden kodlanmış hücre kültürü yüzeylerine ekilmesidir. Nihayetinde, enterik nöronların, glia hücrelerinin veya bu iki hücre tipi arasındaki etkileşimin etkilerini incelemek için elektrofizyoloji, immünositokimya ve tek hücre PCR'ı kullanılabilir.Prosedür, tüm laboratuvarın doktora sonrası araştırmacısı Dr. Trisha Har Smith tarafından uygulamalı olarak gösterilecek ve kendisine tüm laboratuvarın doktora adayı Joy Gombe yardımcı olacaktır. Bu tekniğin mevcut tekniklere göre temel avantajı, nöronların ve gliaların yetişkin fareden elde edilmesidir. Bu durum, potansiyel olarak genetiği değiştirilmiş hayvanlardan elde edilebilen, tam

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Omurilik fare embriyonik motor nöronlar izole alternatif bir yol tarif edilir. Bu yöntem, lektin düşük afinite sinir büyüme faktörü reseptör p75NTR bağlamak için aslında dikkate alır. Bu lektin tabanlı preplating p75NTR karşı spesifik antikor ile benzer bir arınma sağlar.

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Bu videoda, fare bağırsağının submukoza ve lamina propriasından enterik glial hücrelerin izole edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Submukoza ve lamina propria dokusunun çıkarılması, enterik glial hücrelerin bunlardan izole edilmesi ve bir enterik glial hücre kültürü oluşturmak için hücrelerin kaplanmış bir kuyu plakası üzerinde kültürlenmesi ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Bir farenin submukoza ve lamina propriasından enterik glial hücrelerin izole edilmesi

Kas duyusal nöronlar propriyoseptör sinyalizasyon dahil ve aynı zamanda metabolik devlet ve yaralanma ile ilgili olaylar üzerine rapor edilmektedir. Biz streç aktive kas afferentlerde çalışmaları için in vitro kas-sinir hazırlanmasında bir yetişkin fare açıklar.

Bir İn Vitro Yetişkin Fare kas-sinir Hazırlık

Bu video, bir in vitro fare kolorektum sinir preparatı üzerinde tek lifli elektrofizyolojik kayıtların yürütülmesi için bir protokolü göstermektedir.

Fare Kolorektal Afferent Endings in vitro Fonksiyonel Karakterizasyonu içinde

Enterik sinir sistemi (ENS), bağırsak duvarında bulunan ve bağırsak reflekslerini kontrol eden bir nöron ve glia ağıdır. Bu protokol, Ca2+ görüntüleme kullanılarak ENS'nin canlı preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini kaydetme yöntemlerini açıklar.

Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme

Enterik sinir sistemi, bağırsağı çoğaltan, göç eden ve kolonize eden nöral krest hücreleri tarafından oluşturulur. Nöral krest hücreleri, nörotransmitter fenotiplerine özgü belirteçlerle nöronlara farklılaşır. Bu protokol, enterik sinir sistemi nörotransmitter ekspresyonunu görselleştirmek için murin embriyonik gastrointestinal sistemin diseksiyonu, sabitlenmesi ve immün boyanması için bir tekniği tanımlar.

Fare Enterik Sinir Sistemi Geliştirme gözünüzde canlandırın için immün

Burada, bağırsak submukoza divalent katyonlar ve enzimatik olmayan hücre kurtarma çözümü kuluçka şelasyon yapın için sıralı EDTA incubations kullanarak gliyal enterik hücre izolasyon açıklayın. Sonuç hücre süspansiyon poli-D-lizin ve laminin kaplama submucosal Gliyal hücreler fonksiyonel analiz için zenginleştirilmiş bir kültür sonuçlanır.

Submukoza ve Lamina Propria yetişkin fare enterik gliyal hücrelerini izolasyon

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Bu protokol, nöro (immüno) loji araştırması için embriyonik gün 17 fare beyinlerinden merkezi sinir sistemi hücre kültürleri üretmenin benzersiz bir yolunu sunar. Bu model, RT-qPCR, mikroskopi, ELISA ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çeşitli deneysel teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Keşfedin, yetişkin fare miyenterik pleksusundan fonksiyonel nöron ve glia hücrelerinin izolasyonu için hücre kültürü protokolü. Bu yöntem, enterik sinir sistemi bileşenlerinin ayrıntılı incelenmesini sağlar.

Bir

Daha fazla video keşfet