DNA Ligasyon Reaksiyonları

Ligasyon, birleştirme eylemi olarak tanımlanabilir ve biyolojide bu terim, iki biyomolekülü kovalent bir bağ ile birleştiren enzimatik bir reaksiyonu ifade eder. Bu video, moleküler biyoloji araştırmalarında DNA ligasyonunun uygulanmasını açıklamaktadır.

Hücrede DNA ligazları, DNA omurgasının 3’-hidroksil ve 5’-fosfat grupları arasında fosfodiester bağlarının oluşumunu katalize ederek DNA'daki kırılmaları tespit eden ve kapatan enzimlerdir. Ligasyon, tek ve çift zincirli DNA kırılmalarını onarmak için DNA replikasyonu gibi normal hücresel süreçlerin bir parçası olarak gerçekleşir.

Laboratuvarda DNA ligazları, moleküler klonlamada rutin olarak kullanılır; bu süreç, endonükleaz ile sindirilmiş DNA fragmanlarını veya insertleri, plazmit gibi endonükleaz ile sindirilmiş bir vektörle birleştirerek fragmanın konak hücrelere aktarılmasını ve ardından replike edilmesini sağlar.

Endonükleaz sindirimleri, DNA'nın belirli bölgelerinde çentikler oluşturan restriksiyon endonükleazlarının veya restriksiyon enzimlerinin kullanımını içerir.

Bu çentikler, yapışkan uçlar olarak adlandırılan 3’ ve 5’ çıkıntılar üreten tek zincirli kırılmalara veya küt uçlar olarak adlandırılan çıkıntısız çift zincirli kırılmalara benzeyebilir. Yapışkan uçların ligasyonu avantajlıdır çünkü tamamlayıcı çıkıntılı baz çiftleri reaksiyonu stabilize eder. Küt uç ligasyonlarında herhangi bir tamamlayıcı baz eşleşmesi olmadığı için ligasyon daha az verimlidir ve enzimin uçları birleştirmesi daha zordur. Normal koşullar altında, yapışkan ve küt uçlar birbirleriyle ligasyon yapılamaz.

Ancak, DNA polimeraz 1 ürünü olan ve subtilisin ile sindirilmiş Klenow fragmanı, yapışkan uçları küt uçlara dönüştürebilir. Klenow, 3’ çıkıntılarını parçalayan 3’den 5’e ekzonükleaz aktivitesine ve tamamlayıcı zincirin 3’ ucunu uzatarak 5’ çıkıntılarını kütleştiren polimeraz aktivitesine sahiptir.

Amaç bir geni bir plazmide yerleştirmek olduğunda, vektör DNA'sının yeniden kapanması olan kendi kendine ligasyon (self-ligation), bir ligasyon reaksiyonu için yaygın ve istenmeyen bir sonuçtur. Sindirim sonrası vektör DNA'sının alkali fosfataz ile işleme tabi tutulması, her iki uçtaki 5’ fosfatları uzaklaştırır ve bu istenmeyen sonucu önler.

Daha önce belirttiğimiz gibi, ligasyon işlemine başlamadan önce vektör ve insert DNA'ları endonükleazlar ile sindirilir. Sindirilmiş vektör ve insertin jel saflaştırmasının ardından, saflaştırılmış vektör ve insertin konsantrasyonunu belirlemek için DNA konsantrasyonları bir spektrofotometre ile ölçülür.

Bu konsantrasyondan yola çıkarak, 1 µl içindeki insert veya vektör molekül sayısı, bir DNA baz çiftinin ortalama moleküler ağırlığı ve her fragmandaki baz çifti sayısı baz alınarak belirlenebilir. Vektör ve insertin hesaplanan moleküler konsantrasyonuna dayanarak, reaksiyonda kullanılacak vektör ve insert hacmini belirlemek için 3'e 1 oranında insert/vektör oranı hesaplanır. DNA insertinin vektöre oranının 3'e 1 olması istenir, çünkü bu durum insertin vektöre ligasyon olasılığını, vektörün kendi kendine ligasyon olasılığına göre artırır.

Reaksiyonda kullanılacak vektör ve insert DNA miktarlarını belirlediğimize göre, ligasyon reaksiyonunu buz üzerinde hazırlamaya geçiyoruz. Reaksiyon bileşenlerinin mikrosantrifüj tüpüne eklenme sırası şöyledir: 10 µl nihai hacme ulaşmaya yetecek kadar steril su (bizim örneğimizde 4 µl kullanacağız), 1 µl 10X ligasyon tamponu, 1 µl 10mM ATP, hesaplandığı şekilde 1 µl vektör ve 3 µl insert DNA ve son olarak 1 µl DNA Ligaz. Reaksiyon iyice karıştırılır, santrifüj edilir ve uygun sıcaklıkta inkübe edilir.

Yapışkan uçlu (sticky end) veya küt uçlu (blunt end) ligasyon yapmanız, ligasyon reaksiyonunun sıcaklığını ve süresini etkiler. Örneğin, altı baz çiftlik bir çıkıntıya (overhang) sahip yapışkan uçlu bir ligasyon, tamamlayıcı uçlar fragmanların birleşmesini stabilize ettiği için oda sıcaklığına yakın bir değerde yaklaşık 1 saat boyunca gerçekleştirilebilir. Kısa çıkıntılı veya küt uçlu ligasyonlar ise 14-20˚C arasında gece boyunca gerçekleştirilmelidir.

Bir ligasyon reaksiyonunun nasıl kurulacağını öğrendiğimize göre, artık bu prosedürün bazı uygulamalarına göz atalım.

Ligasyonlar, PCR ile amplifiye edilmiş fragmanların doğrudan lineerize plazmidlere yerleştirilmesi için kullanılabilir. Burada, dondurulmuş fare beyninden örnek alan, buradan genomik DNA izole eden ve ardından metillenmiş DNA'yı tespit etmeye yarayan PCR tabanlı bir yöntem olan bisülfit PCR'a tabi tutan bir araştırmacı görüyorsunuz. PCR ürünleri daha sonra, söz konusu beyin bölgesinde metillenmiş genlerden oluşan bir kütüphane oluşturmak amacıyla doğrudan plazmide ligasyona tabi tutulur.

Ligasyonlar, DNA fragmanlarını saflaştırmak için PCR primerleri için bağlanma bölgeleri içeren oligonükleotid linkerlerin eklenmesinde kullanılabilir. Tümör örnekleriyle çalışırken bilim insanları, tümöre neden olan mutasyonları belirleme umuduyla tümör genomik DNA'sını dizilemek için bu yaklaşımı kullanabilirler.

Bu videoda ligasyon, formaldehit ile fikse edilmiş hücrelerden izole edilen ve ardından biyotin varlığında bir restriksiyon enzimi ve klenow ile işlem görmüş DNA üzerinde gerçekleştirilmektedir; biyotin daha sonra ligasyona uğramış DNA'yı çöktürmek (pull down) için kullanılır. Bu DNA ardından PCR kullanılarak amplifiye edilir ve ürünler, gösterildiği gibi çeşitli ölçeklerdeki kromatin etkileşimlerini tanımlamak için dizilenir.

Artık DNA ligazı, laboratuvarda ligasyon kurulumunda yer alan çeşitli prensipler, karşılaşılabilecek potansiyel sorunlar ve çözümleri ile ligasyonun moleküler biyoloji araştırmalarındaki çeşitli uygulamaları hakkında bilgi edindiniz. İzlediğiniz için teşekkürler.