Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

Bu prosedürün genel amacı, tüm bir fare beynini mikron ölçekli çözünürlükte yeniden yapılandırmak ve görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle fikse edilmiş ve tetrahedran serisiyle entegre edilmiş bir fare beynininyelemesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise numunenin Benzyl Ether ile şeffaflaştırılmasıdır.

Ardından, beyin bir konfokal ışık sayfası mikroskobu ile görüntülenir. Son adım, elde edilen görüntü yığınlarını hizalamak ve birleştirmek için bir yazılım kullanmaktır. Nihayetinde, yeniden oluşturulan görüntü hacminde gezinmek için çok çözünürlüklü bir görselleştirme aracı kullanılabilir.

Bu tekniğin konfokal veya iki fotonlu mikroskopi gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, bir fare beyninin tüm hacminin sadece birkaç gün içinde görüntülenebilmesidir. Bu yöntem, tüm beyin boyunca farklı nöronal tiplerin dağılımı gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, beyindeki ince anatomi hakkında bilgi sağlar mı?

Bu yöntem, prosedürün yeniden başlatılacağını kanıtlayacak şekilde fare embriyolarına veya meyve sineklerine de uygulanabilir. Laboratuvarımdan bir lisansüstü öğrenci tarafından gerçekleştirilmiştir. Bu protokole başlamak için, fare beyinlerini transkardiyak perfüzyon yoluyla standart şekilde sabitleyin ve dehidrasyon ile şeffaflaştırma işlemlerini gerçekleştirmeden önce gece boyunca sabitlemeye (post-fix) bırakın.

Ardından, bir dehidrasyon solventi olan THF'nin XFP floresansını güçlü bir şekilde söndürdüğü için, kromatografi kolonu kullanarak bazik aktive alüminyum oksit ile peroksitleri uzaklaştırmak amacıyla filtrasyon gerçekleştirin; peroksit giderimini azaltabilecek kolon çatlamalarından kaçının ve final çözeltiye bir stabilizatör ekleyin. THF filtrasyon öncesinde zaten stabilize edilmiş olsa bile, stabilizatör alüminyum oksit tarafından tutulacaktır. Stabilizatör içermeyen THF'nin yüksek miktarda peroksit geliştirebileceğini, patlayıcı ve tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Ardından, fare beyninin bütünleşik serisini saf suda THF ileyeleterekydehidre edin. Daha sonra, ışığa maruz kalmasını önlemek için örneğin bulunduğu şişeyi döner bir tekerlek üzerine yerleştirin. Şişeyi alüminyum folyo ile sarın.

Son olarak, temizleme çözücüsünü bir süzme hunisi kullanarak alüminyum oksit ile filtreleyin. Ardından, beyin şeffaf görünene kadar çözeltiyi üç ve altı saat sonra değiştirerek örneği %100 DBE içerisinde temizleyin. Genellikle ikinci DBE değişiminden bir saat sonra, örneği burada gösterilen yöntemlerden biriyle eğimli bir görüntüleme plakasına monte edin.

Agros disk veya agro hoparlör aracılığıyla doğrudan montaj; doğrudan montaj için örneği, aros disk daldırmayı kullanmak üzere uçlardan birine nazikçe daldırın. Uçların üzerine %6'lık aros jelden yapılmış bir disk yerleştirin. Ardından örneği akrilik yapıştırıcı ile agros disk üzerine nazikçe sabitleyin ve montajın kürlenmesi için yaklaşık bir dakika bekleyin.

Agros beher daldırma yöntemini kullanarak, uçlara %3'lük agros jelden yapılmış bir beher yerleştirin. Ardından örneği nazikçe beherin tabanına yerleştirin. Numuneyi bu yöntemlerden biriyle sabitledikten sonra, görüntüleme plakasını cımbız yardımıyla numune haznesinin içine konumlandırın.

Ardından hazneyi berraklaştırma solüsyonu ile doldurun. Sonra, tomografi için hazırlık yapın. Öncelikle, mümkün olduğunca fazla floresans toplamak için yarığı çıkarın ve ardından örneği düşük lazer gücüyle aydınlatın.

Fotobeyazlamayı önlemek için, yazılım kontrollü mikro konumlandırma sistemini kullanarak örneği x, y ve Z yönlerinde hareket ettirin. Her bir yön için, örneğin kamera görüş alanı içerisindeyken aydınlatıldığı minimum ve maksimum koordinatları belirleyin. Ardından, belirlenen bu koordinatları pre-tomografi alt programı için parametre olarak girin.

Ayrıca, tomografide ve tomografi öncesi örnekleme adımında Z yönünde kullanılacak olan komşu yığınlar arasındaki mesafeyi belirtin. Sonra, önceki adımda belirtilen Z örnekleme parametreleriyle her yığında görüntüleri toplayacak olan tomografi öncesi işlemi başlatın. Veri toplama işlemine başlamak için, öncelikle mikro konumlandırma sistemini kullanarak örneği ışık tabakasının dışına taşıyın.

Ardından, görüş alanının merkezindeki tek bir sabit hattı aydınlatmak için lazer gücünü artırın ve tüm tarama sistemlerinin hareketini durdurun. Sonrasında, yarığı yerleştirin ve berraklaştırma solüsyonundan gelen otofloresan sinyali kullanarak hizalayın. Artık görüş alanının merkezindeki yarık hattını net bir şekilde görmelisiniz.

Şimdi tarama sistemini yeniden aktif hale getirin. Lazer gücünü azaltın ve mikro konumlandırma sistemini kullanarak örneği ışık tabakasının içine taşıyın. Yarık ile kullanılan lazer gücünün, yarık olmadan kullanılan güce göre daha yüksek olacağını unutmayın.

Uzaysal filtre ışığın önemli bir kısmını engellediğinden, görüntüler net ve parlak görünene kadar kontrol yazılımı ile tarama ve d tarama sistemlerinin genliğini ve ofsetini ayarlayın. Ardından deney için uygun Z adımını belirleyin ve tomografi görüntüleme yazılımını çalıştırın. Hacim, birçok paralel ve kısmen örtüşen yığın halinde görüntülenecek ve görüntüler hiyerarşik bir klasör yapısında kaydedilecektir.

Birleştirme yazılımının tam bir kübik hacimle çalışabilmesi için, elde edilen hacmi sentetik siyah görüntülerle, yani toplananlarla aynı tip ve boyutlarda ancak sıfır yoğunluğa sahip görüntülerle otomatik bir yazılım kullanarak tamamlayın. Ardından, Terra, Stitcher ve tarly eklentileri yüklü olan VA A 3D yazılımını başlatın ve Terra Stitcher eklentisini yükleyin. Görüntülenen hacmi içeren dizini seçin ve eksenlerin referans bir sağ el koordinat sistemine göre göreli yönelimlerini ve voksel boyutunu belirtin.

Şimdi dikme işleminin ilk kısmını başlatın. Yazılım, yığın çiftleri arasındaki bağıl yer değiştirmeyi hesaplayacak ve tüm yığınlar için birlikte genel bir optimum yerleşim bulacaktır; dikilmiş hacmi tek çözünürlükte veya çoklu çözünürlük formatında kaydetmeyi seçin. Çoklu çözünürlük formatı, tarly eklentisi ile çoklu çözünürlük görselleştirmesine olanak tanır.

Her iki durumda da, eğer yüksek çözünürlüklü görüntü birkaç gigabayttan daha büyükse, çoklu yığın (multi-stack) kaydetme modunu da seçin ve her bir alt yığının boyutunu belirleyin. Bu, depolanan verilere verimli bir şekilde erişilmesini sağlayacaktır. Şimdi dikme (stitching) işleminin ikinci bölümünü başlatın.

Yazılım, hizalanmış yığınları birleştirecek ve bunları tekli veya çoklu yığın modunda kaydedecektir. İşlem tamamlandığında, Terra Stitcher eklentisini kapatın. Ardından, terra fly eklentisini yükleyin.

Çoklu yığınlı çok çözünürlüklü hacmin bulunduğu klasörü seçin ve foxhole boyutunu ile eksen yönelimlerini belirtin. Hacim, minimum çözünürlükte yüklenecektir. Daha yüksek bir çözünürlüğe yakınlaştırmak için fare tekerleğini kullanmanız yeterlidir.

Alternatif olarak, görüntüdeki belirli bir noktaya çift tıklanabilir veya mevcut bir işaretçinin etrafında yakınlaştırma seçilebilir ya da ilgilenilen hacmin koordinatları doğrudan belirtilebilir. Daha düşük çözünürlüğe geri dönmek için fare tekerleği kullanılması yeterlidir. Açıklanan protokol, fiziksel kesit alma ihtiyacı olmaksızın, tüm fare beyinlerini veya çıkarılmış parçaları mikron ölçekli çözünürlükte yeniden yapılandırmak için kullanılabilir.

Temsili bir sonuç olarak, postnatal 10. gündeki bir L7 GFP faresinin tüm serebellumu burada bu hayvanda gösterilmiştir. Tüm Purkinje hücre nöronları EGFP ile işaretlenmiştir. Yakınlaştırma yapıldığında, serebellar korteksin tipik lameller yapısı görülebilir; daha fazla yakınlaştırma ise her bir Purkinje hücresi somasının net bir şekilde ayırt edilmesini sağlar.

Tanımlanan protokol, böylece çeşitli nörogelişim çalışmalarında nöronal uzamsal organizasyonun taranması için kullanılabilir. İkinci bir temsili sonuç olarak, burada yetişkin bir GFPM faresinin dilimlenmiş beyninden alınan görüntüleri görebiliriz. Bu transgenik hayvanda, EGFP rastgele seçilmiş seyrek bir nöronal alt kümede eksprese edilir.

Beynin sağ yarısı burada gösterilmiştir. Daha fazla yakınlaştırdığımızda nöronal çıkıntılar ayırt edilebilir hale gelir. Bu sonuç, açıklanan protokolün tüm yetişkin fare beyinlerinde mikron ölçeğinde çözünürlükte görüntülemeye olanak tanıdığını ve böylece tüm beyin anatomisinin hücresel çözünürlükte incelenmesi olasılığını ortaya koymaktadır.

Nörodejeneratif hastalıkların fare modellerinde, bu teknik bir kez kavrandığında ve doğru şekilde uygulandığında üç ila dört gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, GFP floresansını korumak içindehidratasyon ve temizleme solüsyonunun uygun şekilde filtrelenmesinin hatırlanması önemlidir. Burada sunulan çok çözünürlüklü görselleştirme aracı, mikro optik kesit tomografisi gibi diğer tekniklerle elde edilen çok büyük veri setlerini incelemek için de kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, fikse edilmiş fare beyninin nasıl tarihlendirileceği, değerlendirileceği ve temizleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bunları konfokal tabaka mikroskobu ile görüntüleyebilir ve Tely eklentisini kullanarak yeniden oluşturulan hacmi VR 3D ile görselleştirebilirsiniz.