Restriksiyon Enzimi Kesimleri
Restriksiyona enzimler veya restriksiyon endonükleazlar, moleküler biyolojide çok çeşitli uygulamalarda kullanılırlar. Bu enzimler, restriksiyon bölgesi olarak adlandırılan belirli bir DNA dizisini tanır ve keserler. İzlemek üzere olduğunuz video, bu mucizevi moleküller hakkında bazı temel bilgiler sunmakta ve bir restriksiyon enzimi sindirimi işleminin nasıl kurulacağını göstermektedir.
Peki, restriksiyon enzimleri nereden gelir? Bu enzimler, bakterilerin bakteriyofaj olarak bilinen virüslere karşı geliştirdiği bir savunma mekanizması olan bir adaptasyondur. Bakteriyel DNA üzerindeki restriksiyon enzimi bölgelerine metil gruplarının eklenmesi sayesinde, restriksiyon enzimleri yalnızca fage DNA'sını tanır ve keser, böylece enfeksiyonu önler.
Restriksiyon enzimlerinin oldukça garip isimleri vardır. Örneğin HindIII, NotI, EcoRI ve BamHI. Bir restriksiyon enzimi isminin ilk üç harfi, enzimin izole edildiği organizmayı belirtir. Örneğin, EcoRI restriksiyon enzimi E. coli'den izole edilmiştir. Gerektiğinde dördüncü harf, enzimin izole edildiği bakteriyel suşu belirtir. Roma rakamı ise, o belirli organizmadan izole edilen birinci, ikinci veya üçüncü enzim olduğunu gösterir.
Restriksiyon enzimleri, genellikle dört ila sekiz baz çifti uzunluğunda olan ve tanıma bölgesi olarak adlandırılan bir nükleotid dizisini tanırlar. Enzim, dizideki belirli nükleotidlerde DNA omurgasındaki fosfodiester bağlarını koparır. Tanıma bölgeleri genellikle palindromiktir, yani dizi ileri ve geri okunduğunda aynıdır. Palindrom, DNA molekülünün tamamlayıcı zincirlerinde bulunduğunda buna ters tekrarlı palindrom denir.
Restriksiyon enzimleri, DNA kesildiğinde farklı uç tipleri bırakabilir: yapışkan uçlar ve küt uçlar. Yapışkan uçlar 3’ ve 5’ çıkıntıları bırakırken, küt uçlar herhangi bir çıkıntı bırakmaz. Uç tipi, restriksiyon enzimi sindirimi ile izole edilen DNA fragmanının, ligasyon olarak bilinen işlemle diğer DNA fragmanlarıyla nasıl yeniden birleştirileceğini belirler.
Bir restriksiyons enzim sindirimi dikkatle planlanmalıdır. Bir sindirim reaksiyonu tipik olarak şunlardan oluşur: deiyonize su, kesilecek olan DNA, kullanacağınız enzime özgü tampon ve bazen bovine serum albumin veya BSA adlı bir protein. BSA, enzimin sindirimin gerçekleştirildiği kabın kenarlarına yapışmasını önleyerek reaksiyonu stabilize eder. Her restriksiyons enziminin potansiyel olarak farklı tampon koşulları, inkübasyon sıcaklıkları ve BSA gereksinimleri olabilir. Restriksiyons enzimi tedarikçileri, gerekli tüm bilgileri elde etmek için kontrol edilebilecek kaynaklar sunmaktadır.
Sindirimi hazırlamaya başlamak için restriksiyons enzimini dondurucudan veya buzdolabından çıkarın. Gelecekteki reaksiyonlar için optimal aktiviteyi sağlamak amacıyla restriksiyons enzimini buz üzerinde veya ısıya dayanıklı bir kapta tutun. Bir mikrosantrifüj tüpüne reaksiyon bileşenleri şu sırayla eklenmelidir. İlk olarak, final reaksiyon hacmi 20μL olacak şekilde steril, nükleaz içermeyen suyun ilgili hacmi eklenir. Ardından 10x Restriksiyons Enzim Tamponu, gerekliyse BSA, 1μg'a kadar DNA ve 2-10 ünite enzim eklenir. Üniteler, 50μL reaksiyon hacminde, 37°C'de 60 dakikada 1μg kontrol DNA'sının tam sindirimini gerçekleştirmek için gereken enzim miktarı olarak tanımlanır. Ardından, vorteksleyerek karıştırın ve içeriği tüpün dibinde toplamak için bir mikrosantrifüjde 12,000xg'de kısa süreli olarak santrifüjleyin. Sonrasında, restriksiyons enziminiz için optimal sıcaklıkta, genellikle bir ısıtma bloğunda 37°C'de 1 ila 4 saat boyunca inkübe edin.
Sindirimin tamamlanmasının ardından, restriksiyons enzimlerini ısı ile inaktive etmek için reaksiyon karışımını 65˚C'de inkübe etmek iyi bir yaklaşımdır. Restriksiyons enzimleri çoğu zaman bölgeye özgü kesim yapsa da, uzun inkübasyon süreleri, tipik sindirim bölgelerine benzer ancak onlardan farklı olan bölgelerde kesim yapılmasına neden olan yıldız aktivitesine (star activity) yol açabilir.
İnaktivasyonun ardından, sindirimin başarılı olduğundan emin olmak için DNA bir agaroz jelde yürütülmelidir.
Sindirme işlemlerini gerçekleştirirken ve başarıyı sağlamak için size yardımcı olacak birkaç ipucu aşağıdadır.
Bazen, belirli bir DNA fragmanı oluşturmak için birden fazla enzimin kullanılması gereken bir durumla karşılaşabilirsiniz. Bu durumda, iki enzim arasındaki tampon koşullarının ve inkübasyon sıcaklıklarının uyumlu olup olmadığını kontrol etmeniz gerekir; eğer uyumluysalar, çift sindirme gerçekleştirebilir ve her iki enzimin aynı reaksiyon içerisinde kesim yapmasını sağlayabilirsiniz. Ancak bazen, iki enzim arasındaki reaksiyon koşullarında uyumsuzluklar olabilir; bu durumda çözüm, enzimleri ardışık olarak kullanmaktır. Örneğin, sindirme işlemi önce bir enzimle gerçekleştirilebilir ve ardından tampon bileşimi, ikinci enzim için uygun hale gelecek şekilde değiştirilebilir. Tampon uyumsuzluğunu aşmanın ve ardışık sindirme gerçekleştirmenin bir başka yolu da, ilk sindirmenin ardından DNA'yı saflaştırmak ve ardından ikinci sindirme işlemini yapmaktır.
Kontroller kullanmak, bir sindirme işleminin neden başarısız olabileceğini anlamak için iyi bir yoldur. Örneğin, enzim içermeyen bir kontrol, DNA örneğinin bütünlüğünü kontrol etmenize ve eksonükleaz aktivitesinin mevcut olup olmadığını belirlemenize olanak tanır. Bilinen restriksiyon bölgelerine sahip kontrol DNA'sı kullanımı ise enzimin aktivitesinin test edilmesini sağlar.
Sindirim işlemlerinin nasıl gerçekleştirildiğini gördüğümüze göre, restriksiyon enzimlerinin kullanılabileceği çeşitli yöntemlere göz atalım.
Restriksiyon enzimleri, belirli örnekleri tanımlamak amacıyla diagnostik olarak kullanılabilir. Bir sindirim ürünü özelleşmiş bir çipe yüklendikten sonra bu çip, biyofiziksel analizör (bioanalyzer) adı verilen bir cihaza yerleştirilir. Araştırmacılar, balık örneklerinin orijinalliğini belirlemek için sindirim sonucu oluşan DNA fragman boyutlarını inceleyebilirler. Belirli bir türe ait aynı genin veya bu örnekteki gibi farklı türlerin oluşturduğu farklı bant desenlerine, restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmleri denir.
Restriksiyon enzimleri ayrıca, bir plazmitten bir DNA fragmanını izole edip başka bir plazmide aktarmak için alt klonlamada (subcloning) kullanılabilir; böylece istenen fragman bakteriler kullanılarak çoğaltılabilir.
Genlerin çok spesifik bölgelerine restriksiyon bölgeleri eklemek için polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR kullanılarak, aynı genin alternatif formlarında, yani allellerde, tek nükleotid farklılıklarının varlığı restriksiyon enzimleri ile belirlenebilir. Bu tek nükleotid polimorfizmleri veya SNP'ler, yalnızca PCR ve jel elektroforezi ile tespit edilmesi zor olan yapılardır. SNP bölgesine bir restriksiyon bölgesi yerleştirildiğinde, basit bir sindirim işlemi allelleri birbirinden ayırt edebilir.
JoVE'nin restriksiyon enzimleri hakkındaki videosunu izlediniz. Bu enzimlerin nereden geldiğini öğrendiniz, nasıl çalıştıklarına dair bazı temel bilgilere hakim oldunuz, bir sindirim işleminin nasıl kurulacağını gördünüz ve restriksiyon enzimlerinin moleküler biyolojide nasıl kullanılabileceğini öğrendiniz. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Restriksiyon enzimleri veya endonükleazlar, DNA'yı spesifik bir diziden tanır ve keser. Bu enzimler, bakterilerde bakteriyofajlara -bakterileri enfekt…
Restriksiyona enzimler veya restriksiyon endonükleazlar, moleküler biyolojide çok çeşitli uygulamalarda kullanılırlar. Bu enzimler, restriksiyon bölgesi olarak adlandırılan belirli bir DNA dizisini tanır ve keserler. İzlemek üzere olduğunuz video, bu mucizevi moleküller hakkında bazı temel bilgiler sunmakta ve bir restriksiyon enzimi sindirimi işleminin nasıl kurulacağını göstermektedir.
Peki, restriksiyon enzimleri nereden gelir? Bu enzimler, bakterilerin bakteriyofaj olarak bilinen virüslere karşı geliştirdiği bir savunma mekanizması olan bir adaptasyondur. Bakteriyel DNA üzerindeki restriksiyon enzimi bölgelerine metil gruplarının eklenmesi sayesinde, restriksiyon enzimleri yalnızca fage DNA'sını tanır ve keser, böylece enfeksiyonu önler.
Restriksiyon enzimlerinin oldukça garip isimleri vardır. Örneğin HindIII, NotI, EcoRI ve BamHI. Bir restriksiyon enzimi isminin ilk üç harfi, enzimin izole edildiği organizmayı belirtir. Örneğin, EcoRI restriksiyon enzimi E. coli'den izole edilmiştir. Gerektiğinde dördüncü harf, enzimin izole edildiği bakteriyel suşu belirtir. Roma rakamı ise, o belirli organizmadan izole edilen birinci, ikinci veya üçüncü enzim olduğunu gösterir.
Restriksiyon enzimleri, genellikle dört ila sekiz baz çifti uzunluğunda olan ve tanıma bölgesi olarak adlandırılan bir nükleotid dizisini tanırlar. Enzim, dizideki belirli nükleotidlerde DNA omurgasındaki fosfodiester bağlarını koparır. Tanıma bölgeleri genellikle palindromiktir, yani dizi ileri ve geri okunduğunda aynıdır. Palindrom, DNA molekülünün tamamlayıcı zincirlerinde bulunduğunda buna ters tekrarlı palindrom denir.
Restriksiyon enzimleri, DNA kesildiğinde farklı uç tipleri bırakabilir: yapışkan uçlar ve küt uçlar. Yapışkan uçlar 3’ ve 5’ çıkıntıları bırakırken, küt uçlar herhangi bir çıkıntı bırakmaz. Uç tipi, restriksiyon enzimi sindirimi ile izole edilen DNA fragmanının, ligasyon olarak bilinen işlemle diğer DNA fragmanlarıyla nasıl yeniden birleştirileceğini belirler.
Bir restriksiyons enzim sindirimi dikkatle planlanmalıdır. Bir sindirim reaksiyonu tipik olarak şunlardan oluşur: deiyonize su, kesilecek olan DNA, kullanacağınız enzime özgü tampon ve bazen bovine serum albumin veya BSA adlı bir protein. BSA, enzimin sindirimin gerçekleştirildiği kabın kenarlarına yapışmasını önleyerek reaksiyonu stabilize eder. Her restriksiyons enziminin potansiyel olarak farklı tampon koşulları, inkübasyon sıcaklıkları ve BSA gereksinimleri olabilir. Restriksiyons enzimi tedarikçileri, gerekli tüm bilgileri elde etmek için kontrol edilebilecek kaynaklar sunmaktadır.
Sindirimi hazırlamaya başlamak için restriksiyons enzimini dondurucudan veya buzdolabından çıkarın. Gelecekteki reaksiyonlar için optimal aktiviteyi sağlamak amacıyla restriksiyons enzimini buz üzerinde veya ısıya dayanıklı bir kapta tutun. Bir mikrosantrifüj tüpüne reaksiyon bileşenleri şu sırayla eklenmelidir. İlk olarak, final reaksiyon hacmi 20μL olacak şekilde steril, nükleaz içermeyen suyun ilgili hacmi eklenir. Ardından 10x Restriksiyons Enzim Tamponu, gerekliyse BSA, 1μg'a kadar DNA ve 2-10 ünite enzim eklenir. Üniteler, 50μL reaksiyon hacminde, 37°C'de 60 dakikada 1μg kontrol DNA'sının tam sindirimini gerçekleştirmek için gereken enzim miktarı olarak tanımlanır. Ardından, vorteksleyerek karıştırın ve içeriği tüpün dibinde toplamak için bir mikrosantrifüjde 12,000xg'de kısa süreli olarak santrifüjleyin. Sonrasında, restriksiyons enziminiz için optimal sıcaklıkta, genellikle bir ısıtma bloğunda 37°C'de 1 ila 4 saat boyunca inkübe edin.
Sindirimin tamamlanmasının ardından, restriksiyons enzimlerini ısı ile inaktive etmek için reaksiyon karışımını 65˚C'de inkübe etmek iyi bir yaklaşımdır. Restriksiyons enzimleri çoğu zaman bölgeye özgü kesim yapsa da, uzun inkübasyon süreleri, tipik sindirim bölgelerine benzer ancak onlardan farklı olan bölgelerde kesim yapılmasına neden olan yıldız aktivitesine (star activity) yol açabilir.
İnaktivasyonun ardından, sindirimin başarılı olduğundan emin olmak için DNA bir agaroz jelde yürütülmelidir.
Sindirme işlemlerini gerçekleştirirken ve başarıyı sağlamak için size yardımcı olacak birkaç ipucu aşağıdadır.
Bazen, belirli bir DNA fragmanı oluşturmak için birden fazla enzimin kullanılması gereken bir durumla karşılaşabilirsiniz. Bu durumda, iki enzim arasındaki tampon koşullarının ve inkübasyon sıcaklıklarının uyumlu olup olmadığını kontrol etmeniz gerekir; eğer uyumluysalar, çift sindirme gerçekleştirebilir ve her iki enzimin aynı reaksiyon içerisinde kesim yapmasını sağlayabilirsiniz. Ancak bazen, iki enzim arasındaki reaksiyon koşullarında uyumsuzluklar olabilir; bu durumda çözüm, enzimleri ardışık olarak kullanmaktır. Örneğin, sindirme işlemi önce bir enzimle gerçekleştirilebilir ve ardından tampon bileşimi, ikinci enzim için uygun hale gelecek şekilde değiştirilebilir. Tampon uyumsuzluğunu aşmanın ve ardışık sindirme gerçekleştirmenin bir başka yolu da, ilk sindirmenin ardından DNA'yı saflaştırmak ve ardından ikinci sindirme işlemini yapmaktır.
Kontroller kullanmak, bir sindirme işleminin neden başarısız olabileceğini anlamak için iyi bir yoldur. Örneğin, enzim içermeyen bir kontrol, DNA örneğinin bütünlüğünü kontrol etmenize ve eksonükleaz aktivitesinin mevcut olup olmadığını belirlemenize olanak tanır. Bilinen restriksiyon bölgelerine sahip kontrol DNA'sı kullanımı ise enzimin aktivitesinin test edilmesini sağlar.
Sindirim işlemlerinin nasıl gerçekleştirildiğini gördüğümüze göre, restriksiyon enzimlerinin kullanılabileceği çeşitli yöntemlere göz atalım.
Restriksiyon enzimleri, belirli örnekleri tanımlamak amacıyla diagnostik olarak kullanılabilir. Bir sindirim ürünü özelleşmiş bir çipe yüklendikten sonra bu çip, biyofiziksel analizör (bioanalyzer) adı verilen bir cihaza yerleştirilir. Araştırmacılar, balık örneklerinin orijinalliğini belirlemek için sindirim sonucu oluşan DNA fragman boyutlarını inceleyebilirler. Belirli bir türe ait aynı genin veya bu örnekteki gibi farklı türlerin oluşturduğu farklı bant desenlerine, restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmleri denir.
Restriksiyon enzimleri ayrıca, bir plazmitten bir DNA fragmanını izole edip başka bir plazmide aktarmak için alt klonlamada (subcloning) kullanılabilir; böylece istenen fragman bakteriler kullanılarak çoğaltılabilir.
Genlerin çok spesifik bölgelerine restriksiyon bölgeleri eklemek için polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR kullanılarak, aynı genin alternatif formlarında, yani allellerde, tek nükleotid farklılıklarının varlığı restriksiyon enzimleri ile belirlenebilir. Bu tek nükleotid polimorfizmleri veya SNP'ler, yalnızca PCR ve jel elektroforezi ile tespit edilmesi zor olan yapılardır. SNP bölgesine bir restriksiyon bölgesi yerleştirildiğinde, basit bir sindirim işlemi allelleri birbirinden ayırt edebilir.
JoVE'nin restriksiyon enzimleri hakkındaki videosunu izlediniz. Bu enzimlerin nereden geldiğini öğrendiniz, nasıl çalıştıklarına dair bazı temel bilgilere hakim oldunuz, bir sindirim işleminin nasıl kurulacağını gördünüz ve restriksiyon enzimlerinin moleküler biyolojide nasıl kullanılabileceğini öğrendiniz. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Restriksiyona enzimler veya restriksiyon endonükleazlar, moleküler biyolojide çok çeşitli uygulamalarda kullanılırlar. Bu enzimler, restriksiyon bölgesi olarak adlandırılan belirli bir DNA dizisini tanır ve keserler. İzlemek üzere olduğunuz video, bu mucizevi moleküller hakkında bazı temel bilgiler sunmakta ve bir restriksiyon enzimi sindirimi işleminin nasıl kurulacağını göstermektedir.
Peki, restriksiyon enzimleri nereden gelir? Bu enzimler, bakterilerin bakteriyofaj olarak bilinen virüslere karşı geliştirdiği bir savunma mekanizması olan bir adaptasyondur. Bakteriyel DNA üzerindeki restriksiyon enzimi bölgelerine metil gruplarının eklenmesi sayesinde, restriksiyon enzimleri yalnızca fage DNA'sını tanır ve keser, böylece enfeksiyonu önler.
Restriksiyon enzimlerinin oldukça garip isimleri vardır. Örneğin HindIII, NotI, EcoRI ve BamHI. Bir restriksiyon enzimi isminin ilk üç harfi, enzimin izole edildiği organizmayı belirtir. Örneğin, EcoRI restriksiyon enzimi E. coli'den izole edilmiştir. Gerektiğinde dördüncü harf, enzimin izole edildiği bakteriyel suşu belirtir. Roma rakamı ise, o belirli organizmadan izole edilen birinci, ikinci veya üçüncü enzim olduğunu gösterir.
Restriksiyon enzimleri, genellikle dört ila sekiz baz çifti uzunluğunda olan ve tanıma bölgesi olarak adlandırılan bir nükleotid dizisini tanırlar. Enzim, dizideki belirli nükleotidlerde DNA omurgasındaki fosfodiester bağlarını koparır. Tanıma bölgeleri genellikle palindromiktir, yani dizi ileri ve geri okunduğunda aynıdır. Palindrom, DNA molekülünün tamamlayıcı zincirlerinde bulunduğunda buna ters tekrarlı palindrom denir.
Restriksiyon enzimleri, DNA kesildiğinde farklı uç tipleri bırakabilir: yapışkan uçlar ve küt uçlar. Yapışkan uçlar 3’ ve 5’ çıkıntıları bırakırken, küt uçlar herhangi bir çıkıntı bırakmaz. Uç tipi, restriksiyon enzimi sindirimi ile izole edilen DNA fragmanının, ligasyon olarak bilinen işlemle diğer DNA fragmanlarıyla nasıl yeniden birleştirileceğini belirler.
Bir restriksiyons enzim sindirimi dikkatle planlanmalıdır. Bir sindirim reaksiyonu tipik olarak şunlardan oluşur: deiyonize su, kesilecek olan DNA, kullanacağınız enzime özgü tampon ve bazen bovine serum albumin veya BSA adlı bir protein. BSA, enzimin sindirimin gerçekleştirildiği kabın kenarlarına yapışmasını önleyerek reaksiyonu stabilize eder. Her restriksiyons enziminin potansiyel olarak farklı tampon koşulları, inkübasyon sıcaklıkları ve BSA gereksinimleri olabilir. Restriksiyons enzimi tedarikçileri, gerekli tüm bilgileri elde etmek için kontrol edilebilecek kaynaklar sunmaktadır.
Sindirimi hazırlamaya başlamak için restriksiyons enzimini dondurucudan veya buzdolabından çıkarın. Gelecekteki reaksiyonlar için optimal aktiviteyi sağlamak amacıyla restriksiyons enzimini buz üzerinde veya ısıya dayanıklı bir kapta tutun. Bir mikrosantrifüj tüpüne reaksiyon bileşenleri şu sırayla eklenmelidir. İlk olarak, final reaksiyon hacmi 20μL olacak şekilde steril, nükleaz içermeyen suyun ilgili hacmi eklenir. Ardından 10x Restriksiyons Enzim Tamponu, gerekliyse BSA, 1μg'a kadar DNA ve 2-10 ünite enzim eklenir. Üniteler, 50μL reaksiyon hacminde, 37°C'de 60 dakikada 1μg kontrol DNA'sının tam sindirimini gerçekleştirmek için gereken enzim miktarı olarak tanımlanır. Ardından, vorteksleyerek karıştırın ve içeriği tüpün dibinde toplamak için bir mikrosantrifüjde 12,000xg'de kısa süreli olarak santrifüjleyin. Sonrasında, restriksiyons enziminiz için optimal sıcaklıkta, genellikle bir ısıtma bloğunda 37°C'de 1 ila 4 saat boyunca inkübe edin.
Sindirimin tamamlanmasının ardından, restriksiyons enzimlerini ısı ile inaktive etmek için reaksiyon karışımını 65˚C'de inkübe etmek iyi bir yaklaşımdır. Restriksiyons enzimleri çoğu zaman bölgeye özgü kesim yapsa da, uzun inkübasyon süreleri, tipik sindirim bölgelerine benzer ancak onlardan farklı olan bölgelerde kesim yapılmasına neden olan yıldız aktivitesine (star activity) yol açabilir.
İnaktivasyonun ardından, sindirimin başarılı olduğundan emin olmak için DNA bir agaroz jelde yürütülmelidir.
Sindirme işlemlerini gerçekleştirirken ve başarıyı sağlamak için size yardımcı olacak birkaç ipucu aşağıdadır.
Bazen, belirli bir DNA fragmanı oluşturmak için birden fazla enzimin kullanılması gereken bir durumla karşılaşabilirsiniz. Bu durumda, iki enzim arasındaki tampon koşullarının ve inkübasyon sıcaklıklarının uyumlu olup olmadığını kontrol etmeniz gerekir; eğer uyumluysalar, çift sindirme gerçekleştirebilir ve her iki enzimin aynı reaksiyon içerisinde kesim yapmasını sağlayabilirsiniz. Ancak bazen, iki enzim arasındaki reaksiyon koşullarında uyumsuzluklar olabilir; bu durumda çözüm, enzimleri ardışık olarak kullanmaktır. Örneğin, sindirme işlemi önce bir enzimle gerçekleştirilebilir ve ardından tampon bileşimi, ikinci enzim için uygun hale gelecek şekilde değiştirilebilir. Tampon uyumsuzluğunu aşmanın ve ardışık sindirme gerçekleştirmenin bir başka yolu da, ilk sindirmenin ardından DNA'yı saflaştırmak ve ardından ikinci sindirme işlemini yapmaktır.
Kontroller kullanmak, bir sindirme işleminin neden başarısız olabileceğini anlamak için iyi bir yoldur. Örneğin, enzim içermeyen bir kontrol, DNA örneğinin bütünlüğünü kontrol etmenize ve eksonükleaz aktivitesinin mevcut olup olmadığını belirlemenize olanak tanır. Bilinen restriksiyon bölgelerine sahip kontrol DNA'sı kullanımı ise enzimin aktivitesinin test edilmesini sağlar.
Sindirim işlemlerinin nasıl gerçekleştirildiğini gördüğümüze göre, restriksiyon enzimlerinin kullanılabileceği çeşitli yöntemlere göz atalım.
Restriksiyon enzimleri, belirli örnekleri tanımlamak amacıyla diagnostik olarak kullanılabilir. Bir sindirim ürünü özelleşmiş bir çipe yüklendikten sonra bu çip, biyofiziksel analizör (bioanalyzer) adı verilen bir cihaza yerleştirilir. Araştırmacılar, balık örneklerinin orijinalliğini belirlemek için sindirim sonucu oluşan DNA fragman boyutlarını inceleyebilirler. Belirli bir türe ait aynı genin veya bu örnekteki gibi farklı türlerin oluşturduğu farklı bant desenlerine, restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmleri denir.
Restriksiyon enzimleri ayrıca, bir plazmitten bir DNA fragmanını izole edip başka bir plazmide aktarmak için alt klonlamada (subcloning) kullanılabilir; böylece istenen fragman bakteriler kullanılarak çoğaltılabilir.
Genlerin çok spesifik bölgelerine restriksiyon bölgeleri eklemek için polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR kullanılarak, aynı genin alternatif formlarında, yani allellerde, tek nükleotid farklılıklarının varlığı restriksiyon enzimleri ile belirlenebilir. Bu tek nükleotid polimorfizmleri veya SNP'ler, yalnızca PCR ve jel elektroforezi ile tespit edilmesi zor olan yapılardır. SNP bölgesine bir restriksiyon bölgesi yerleştirildiğinde, basit bir sindirim işlemi allelleri birbirinden ayırt edebilir.
JoVE'nin restriksiyon enzimleri hakkındaki videosunu izlediniz. Bu enzimlerin nereden geldiğini öğrendiniz, nasıl çalıştıklarına dair bazı temel bilgilere hakim oldunuz, bir sindirim işleminin nasıl kurulacağını gördünüz ve restriksiyon enzimlerinin moleküler biyolojide nasıl kullanılabileceğini öğrendiniz. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Where do restriction enzymes come from and why do bacteria produce them?
Restriction enzymes are a bacterial defense mechanism against bacteriophages, viruses that infect bacteria. Bacteria produce these enzymes to recognize and cut invading phage DNA while protecting their own genomic DNA through methylation. This natural adaptation allows bacteria to survive viral infection.
Q2: What do the letters and numbers in restriction enzyme names mean?
Restriction enzyme names encode their origin and discovery order. The first three letters identify the organism source, such as EcoRI from E. coli. The fourth letter, if present, indicates the bacterial strain. Roman numerals denote whether it was the first, second, or third enzyme isolated from that organism.
Q3: What is the difference between sticky ends and blunt ends in restriction digests?
Sticky ends leave 3' and 5' overhangs after enzyme cleavage, while blunt ends produce no overhangs. The type of end determines how DNA fragments can be recombined with other fragments through DNA ligation reactions principle procedure and applications. Sticky ends are generally more useful for cloning applications.
Q4: What components are needed to set up a restriction enzyme digest?
A typical digest requires sterile, nuclease-free water, the DNA to be cut, buffer specific to the enzyme, and sometimes bovine serum albumin (BSA) to stabilize the reaction. BSA prevents the enzyme from sticking to the tube walls. Suppliers provide detailed information about buffer conditions, incubation temperatures, and BSA requirements for each enzyme.
Q5: How should a restriction enzyme digest be incubated and why is heat inactivation important?
Digests are typically incubated at 37°C in a heating block for 1 to 4 hours. After digestion completes, heat inactivation at 65°C stops enzyme activity and prevents star activity, which is unwanted cutting at sites similar to the recognition site. This ensures accurate, specific digestion results.
Q6: What is a double digest and when would you use sequential digestion instead?
A double digest uses two restriction enzymes simultaneously if their buffer conditions and incubation temperatures are compatible. If enzymes are incompatible, sequential digestion is used: perform the first digest, alter buffer conditions for the second enzyme, or purify DNA between digests. This approach ensures both enzymes can cut effectively.
Q7: How can restriction enzymes be used to identify DNA samples or detect genetic variations?
Restriction enzymes produce different banding patterns called restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) that identify samples or species. By introducing restriction sites at specific locations using PCR, enzymes can detect single nucleotide polymorphisms (SNPs) that distinguish between alleles. These applications enable diagnostic identification and genetic analysis.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:38
Background and Nomenclature
1:53
Basic Principles
3:03
Setting up a Restriction Enzyme Digest
5:55
Hints
7:35
Applications
9:17
Summary