Name: İnsan Progeroid WRN Eksonükleazının Ortologu DmWRNexoyu Karakterize Etmek için Floresan Bazlı Bir Eksonükleaz Testi ve Diğer Nükleazlara Uygulanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Öğrenin, floresan bazlı eksonükleaz testi ile WRN eksonükleaz aktivitesini ölçme ve substrat tercihlerini analiz etme yöntemini. Bu teknik, genom stabilitesi araştırmalarında güvenli ve tekrarlanabilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmayı finanse ettiği için konseyler arası Yeni Yaşlanma Dinamikleri Programı'na [ES/G037086/1] ve Fuji FLA-3000'e erişim için Prof. Dave Sherratt'a (Oxford Üniversitesi Biyokimya Bölümü) teşekkür ederiz.

<ol><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).</li>
<li>Payne, M., Hickson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+instability+and+cancer%3A+lessons+from+analysis+of+Bloom%27s+syndrome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome).</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).</li>
<li>Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+Werner%27s+syndrome+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the Werner's syndrome gene.</a> Science. 272, 258-262 (1996).</li>
<li>Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+premature+ageing+syndrome+protein%2C+WRN%2C+is+a+3%27--%3E5%27+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease.</a> Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).</li>
<li>Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndrome-causing+mutations+in+Werner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Trends%22%5BJournal%5D)">Syndrome-causing mutations in Werner syndrome.</a> Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).</li>
<li>Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+exonuclease+structure+and+molecular+mechanism+imply+an+editing+role+in+DNA+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).</li>
<li>Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+action+of+the+helicase+and+3%27+to+5%27+exonuclease+of+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).</li>
<li>Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+an+exonuclease+from+Arabidopsis+thaliana+reveals+similarities+to+the+DNA+exonuclease+of+the+human+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).</li>
<li>Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterisation+of+RecQ+homologues+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).</li>
<li>Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Drosophila+ortholog+of+WRN+exonuclease+that+is+required+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity.</a> Aging Cell. 7, 418-425 (2008).</li>
<li>Cox, L. S., Boubriak, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Instability+in+Premature+Aging%2C+in+DNA+Damage+Repair%2C+Repair+Mechanisms+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Thomas%2C+A.E.%2C+Eds.+Nova+Science+Publishers%22%5BJournal%5D)">DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging.</a> Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).</li>
<li>Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Werner+Syndrome+in+Drosophila+melanogaster%3A+hyper-recombination+in+flies+lacking+WRN-like+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).</li>
<li>Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DmWRNexo+is+a+3%27-5%27+exonuclease%3A+phenotypic+and+biochemical+characterization+of+mutants+of+the+Drosophila+orthologue+of+human+WRN+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease.</a> Biogerontology. 10, 267-277 (2009).</li>
<li>Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+orthologue+of+progeroid+human+WRN+exonuclease%2C+DmWRNexo%2C+cleaves+replication+substrates+but+is+inhibited+by+uracil+or+abasic+sites+%3A+Analysis+of+DmWRNexo+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro.</a> Age (Dordr). , (2012).</li>
<li>Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-dependent+degradation+of+single-stranded+3%27+ends+by+the+Werner+syndrome+protein+%28WRN%29%3A+implications+for+spatial+orientation+and+coordinated+3%27+to+5%27+movement+of+its+ATPase%2Fhelicase+and+exonuclease+domains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains.</a> BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).</li>
<li>Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+WRN+exonuclease+activity+by+isotope+dilution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry.</a> Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+exonuclease+domain+of+WRN+forms+a+hexamer+on+DNA+and+possesses+both+3%27-+5%27+exonuclease+and+5%27-protruding+strand+endonuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities.</a> Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).</li>
<li>Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockage+of+the+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+WRN+protein+by+certain+oxidative+modifications+and+bulky+lesions+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Saflaştırılmış proteinlerin eksonükleaz aktivitesinin belirlenmesi, DNA bölünme ürünlerinin analizini gerektirir. DNA'nın eksonükleazlar tarafından sıralı bölünmesi, akrilamid jeller üzerinde etiketli bölünme ürünlerinin ayrılmasıyla görselleştirilebilir. Tarihsel olarak bu, DNA substratının bir radyoetiketle (örneğin 32P veya 35S) son etiketlenmesini içeriyordu, ancak radyoetiket kullanımının doğasında var olan dezavantajlar (maliyet, güvenlik sorunları ve zaman içinde istikrarsızlık) vard...

Nukleazlar, hücrelerde hasarlı DNA'nın uzaklaştırılmasında, Holliday bağlantıları gibi çift yönlü olmayan yapıların çözülmesinde ve DNA replikasyonu sırasında hem DNA polimerazların içinde içsel hem de onlara dışsal olarak prova okuma kapasitesi sağlamada hayati bir rol oynar1. Nükleazlar, DNA'yı serbest uçlardan (eksonükleazlar) sırayla parçalayarak veya daha uzun bir DNA molekülü (endonükleazlar) içindeki iç fosfodiester bağlarını parçalayarak etki edebilir. Nükleaz aktivitesinin kaybı, oldukça spesifik genom kararsızlık fenotiplerine neden olabilir. RecQ helikaz ailesi üyesi BLM'nin mutasyonu, aşırı yüksek kardeş kromatid değişim oranlarına ve küresel olarak yüksek kanser oranlarına neden olurken (Payne ve Hickson2 tarafından gözden geçirilmiştir), yüksek oranda ilişkili WRN proteininin mutasyonu erken yaşlanmaya yol açar3; Bu iki aile üyesi arasındaki en önemli fark, WRN4'te bulunan 3'-5' eksonükleaz alanının varlığıdır. WRN eksonükleazın genom stabilitesinin korunmasında kritik bir rolüne dair kanıtlar, WS hastalarında5 genotiplerin analizinden, izole eksonükleaz alanının6 kristalografik çalışmaları ile desteklenen insan hücrelerindeki nokta mutasyonu ve delesyon çalışmaları ile birlikte birikmiştir. Bununla birlikte, WRN'nin eksonükleaz aktivitesi ile merkezi helikaz aktivitesi7 arasındaki işbirliği ve çapraz konuşma, her birinin işlevselliğini ve genom stabilitesine göreceli katkılarını ayırmayı zorlaştırır. Bitkilerde ve düşük metazoan hayvanlarda, WRN eksonükleaz aktivitesi,helikaz aktivitesi 8-10'dan yoksun tek bir polipeptit üzerinde bulunur (Cox ve Boubriak11'de gözden geçirilmiştir); Arabidopsis'te biyokimyasal olarak, bu eksonükleazın, omurgalı WRN9'da gözlenen birleşik enzim aktivitelerini etkili bir şekilde yeniden oluşturarak, aynı kökenli WRN helikazı ile koordineli olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Mükemmel genetik araçlar, eksonükleaz mutasyonunun etkisinin (varsayımsal akraba helikazını etkilemeden) tüm organizma düzeyinde ve gelişim yoluyla analizine izin verdiği için Drosophila'da WRN eksonükleazını inceledik10,12. Ayrıca, enzim özelliklerinin13,14 tam biyokimyasal analizine izin veren rekombinant Drosophila WRN eksonükleazı (DmWRNexo) klonladık, eksprese ettik ve saflaştırdık.
 İn vitro nükleaz analizi, geleneksel olarak radyoaktif işaretli oligonükleotidler kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve akrilamid jeller4,8,15 üzerindeki ürünlerin merdivenlenmesini arayarak bozunmayı değerlendirmiştir. Hassas olsa da, bu tür tahliller, etiketli substratların radyoaktif bozunması nedeniyle günlük olarak kantitatif olarak tekrarlanabilir değildir. Ek olarak, radyoaktif reaktiflerin kullanılması ve bertaraf edilmesi önemli çevre ve sağlık sorunları doğurur; Radyolabel tedariği de giderek daha sorunlu hale geliyor. Alternatif bir yeni yöntem, nihai bozunma ürününün miktarını kütle spektrometresi16 ile değerlendirir. Bununla birlikte, zaman alıcıdır (birkaç gün sürer), özel ekipman gerektirir ve okuma, son ürün miktarıdır (tek nükleotid), bu nedenle enzim işlenmişliği gibi yönlerin hassas ölçümü veya bazı nükleotidlerin, dizilerin veya modifikasyonların nükleaz duraklamasına veya durmasına yol açıp açmadığını belirlemek için uygun değildir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, geleneksel jel bazlı tahlilleri floresan oligonükleotid substratlarla kullanım için uyarladık, uzun süreler boyunca tekrarlanabilir şekilde kullanılabilen ve böylece farklı koşullar altında nükleaz aktivitelerinin doğrudan karşılaştırılmasına izin veren kararlı bir şekilde etiketlenmiş substratlar ürettik.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>Custom oligonükleotidler</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Bunların PAGE saflaştırması ile yüksek saflıkta örn. elde edilmesi gerekir.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5'FLO</td><td>fluoresescein-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'kabarcık</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40</td></tr><tr><td>% 19:1 Akrilamid çözeltisi</td><td>Severn Biotech</td><td>20-2400-05</td><td>DİKKAT: güçlü nörotoksin bu nedenle her zaman</td></tr> <tr><td>eldiven giyilmelidirHis-Trap sütunları (1 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Diğer tüm reaktifler</td><td>herhangi bir saygın tedarikçi</td><td></td><td>Moleküler biyoloji sınıfı gereklidir (DNaz içermez); mikrofüj tüpleri benzer şekilde DNaz ve RNaz içermemelidir</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Hoefer SE400 jel aparatı</td><td>Hoefer</td><td>SE400-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>FLA-3000 (fosfor ve floresan görüntüleyici)</td><td>Fuji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntü Okuyucu V2.02</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntü Göstergesi V3.3</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan progeroid wrn eksonükleazının ortologu dmwrnexo'yu karakterize etmek için floresan bazlı bir eksonükleaz testi ve diğer nükleazlara uygulanması

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN eksonükleaz, DNA replikasyonu sırasında veya endojen veya eksojen genotoksinlere maruz kaldıktan sonra meydana gelen DNA hasarının çözülmesinde rol oynar. Aksi takdirde, WRN'den yoksun hiper-rekombinant bir hücre fenotipi ile tutarlı olarak, geçici olarak durmuş replikasyon çatallarında birikecek olan recombinojenik ara ürünlerin birikimini önlemede bir rol oynaması muhtemeldir. İnsanlarda, eksonükleaz alanı, DNA ve protein etkileşimi için önemli olan ek bölgelerle birlikte, aynı zamanda helikaz aktivitesine sahip olan çok daha büyük bir proteinin N-terminal bölümünü içerir. Buna karşılık, Drosophila'da, WRN'nin (DmWRNexo) eksonükleaz aktivitesi, varsayımsal helikazdan farklı bir genetik lokus tarafından kodlanır ve genom stabilite mekanizmalarında eksonükleaz aktivitesinin rolünün biyokimyasal (ve genetik) diseksiyonuna izin verir. Burada, saflaştırılmış rekombinant DmWRNexo ve uç etiketli floresan oligonükleotidler kullanarak WRN eksonükleaz aktivitesini belirlemek için bir floresan yöntemi gösteriyoruz. Bu sistem, substrat oligonükleotidleri aylarca stabil kaldığından radyoaktif tahlillerden daha fazla tekrarlanabilirliğe izin verir ve nükleaz polaritesinin, işlenmişliğinin ve substrat tercihlerinin belirlenmesine izin vererek nükleaz aktivitesinin ayrıntılı analizi için daha güvenli ve nispeten hızlı bir yöntem sağlar.

Ekzonükleaz aktivitesinin in vitro analizinin gerçekleştirilmesi, asıl analize ek olarak bir dizi hazırlık adımı gerektirir. Prosedürlerin genel bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.
Floresans tabanlı ekzonükleaz analizleri yürütülmeden önce, uygun bir floresans görüntüleme sistemi kullanılarak üre-akrilamid jellerinde ayrıştırma sonrası floresan işaretli oligonükleotid substratın saptamasını optimize etmek kritik öneme sahiptir. Filtre seçimi, analizin genel hassasiye...

Eksonükleazlar, genom stabilitesinin sağlanmasında kritik roller oynar. WRN eksonükleaz fonksiyonunun kaybı erken yaşlanmaya neden olur. Nükleazın substratlarını ve diğer gereksinimlerini in vitro olarak incelemek, in vivo rolünü aydınlatmaya yardımcı olabilir. Burada, nükleaz aktivitesini ölçmek için hızlı ve tekrarlanabilir floresan bazlı bir test gösteriyoruz.

İnsan Progeroid WRN Eksonükleazının Ortologu DmWRNexo'yu Karakterize Etmek için Floresan Bazlı Bir Eksonükleaz Testi ve Diğer Nükleazlara Uygulanması

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Bu deney, ekzonükleaz aktivitesini belirlemek için sağlam ve tekrarlanabilir, floresan tabanlı bir analiz kullanır. Enzimin DNA'yı ardışık olarak degrade etmesini sağlamak için saflaştırılmış enzimi floresan DNA substratı ile inkübe edin. Ardından, degradasyon ürünlerini boyutlarına göre ayırmak için DNA'yı bir akrilamid üre jelinde çözünürlüğe kavuşturun.Ardından, eksonükleaz aktivitesinin kapsamını belirlemek ve miktarını saptamak için floresan görüntüleme kullanın. Analiz edilen sonuçlar, tercih edilen substrat reaksiyon koşullarını, enzimin prosesif ve genel aktivitesini belirleyebilir. Bu tekniğin mevcut radyoaktivite tabanlı tekniklere göre temel avantajı, DNA substratlarının uzun süre stabil kalması sayesinde mükemmel tekrarlanabilirlik sağlaması, maliyeti düşürmesi ve güvenliği artırmasıdır.Öncelikle, iki molar emit ole stok çözeltisinin uygun bir hacmini kullanarak bakteriyel lizatı 20 millimolar ole konsantrasyonuna ayarlayın. Ardından, hacmi 20 millimolar ole yıkama tamponu kullanarak en az bir mililitreye tamamlayın. Bir mililitrelik hist trap kolonunu 10 mililitre milli Q su ile yıkayın. Daha sonra kolonu 10 mililitre 20 millimolar ole ile dengeleyin.Ardından, lizatı kolona yükleyin; lizat kolona yüklenirken belirgin bir karşı basınç oluşabilir. Bu tamamen normaldir. Şırıngaya çok fazla kuvvet uygulamaya çalışmayın ve sabit, düzenli bir basıncı koruyun.Lizat kolona girerken hafif bir renk değişimi görülmesi olağandır. Akış sıvısını yedi mililitre kapasiteli steril bir biju şişeye toplayın ve buz üzerinde saklayın. Ardından kolonu 10 mililitre 20 milimolar emit ole ile yıkayın.Şimdi, kolondan beş mililitre 40 milimolar iole geçirin. Her bir mikro santrifüj tüpüne toplanan bir mililitrelik fraksiyonları ölçmek için şırınganın pistonunu dikkatle izleyin. Benzer şekilde sırayla, her bir iole konsantrasyonundan beş mililitre geçirin ve her seferinde beş adet bir mililitrelik fraksiyon toplayın.Fraksiyonları, HRP konjuge anti-hiss antikoru ile dot blotting ve problama yöntemini kullanarak analiz edin. Pik fraksiyonları belirleyin. Tüm reaktifleri dört santigrat derecede saklayın; master mix'i steril, DNA içermeyen 0,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine paylaştırın ve başlangıç substratını gözlemlemek için bir enzim içermeyen kontrol grubu da ekleyin.Şimdi bir ısı bloğunu enzim aktivitesi için uygun sıcaklığa ayarlayın. Durdurma solüsyonu içeren bir IDE hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın. Reaksiyona eklenecek son reaktifler de dahil olmak üzere, ısı bloğunun yakınındaki çalışma alanını düzenleyin.Bir ila 10 µL pipetleyici ve uçlar, bir zamanlayıcı, bir kriyojenik raf veya buz kovası ve durdurma çözeltisini hazırlayın. Enzim ilk tüpe eklendiğinde zamanlayıcıyı başlatın ve tübü ısıtma bloğuna yerleştirin. Enzimi diğer tüplere 15 saniyelik aralıklarla eklemeye devam edin ve zamanlayıcı uygun süreye ulaştığında tüpleri ısıtma bloğuna yerleştirin.İlk örneğe 10 µL stop solüsyonu ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Hemen buz üzerine yerleştirin. Her reaksiyonun tam olarak aynı inkübasyon süresine sahip olması için, reaksiyonları uygun zaman aralıklarında ve kuruldukları sırayla durdurmaya devam edin. Her örneğin yarısını veya tamamını bir akrilamid jeline yükleyin. Jelin nasıl ilerlediğini belirlemek için bir veya daha fazla şeride boya içeren bir x stop solüsyonu yükleyin.Elektroforez sonrası, ara parçaları ve bir jel plakasını çıkarın. Çökmüş üre kalıntılarını gidermek için jel plakasını dikkatlice durulayın ve iyice silin. Plakayı jel kısmı aşağı bakacak şekilde jel tutucunun cam alanına yerleştirin ve gerekirse görüntüleme cihazına yerleştirin.Cam üzerindeki jelin koordinatlarını not edin. Uygun yazılımı açın ve metin protokolünde detaylandırılan koşulları kullanarak tarama alanının not edilen bölgesini tarayın. Görüntüyü kırpın ve verileri sıkıştırın.Gerektiğinde, analiz için kaydedin ve ardından dosya olarak dışa aktarın. Ekzonükleaz aktivitesinin in vitro analizinin gerçekleştirilmesi bir dizi hazırlık adımı gerektirir. Bu floresan tabanlı ekzonükleaz assayleri için gerçekleştirilecek asıl analizin yanı sıra, floresan görüntüleme sisteminin deteksiyonunun optimize edilmesi kritik önem taşır.Örneğin, floresein ile işaretlenmiş bir oligonükleotid substrat, 470 nanometre uyarılmaya ve 520 nanometre emisyona izin veren bir filtre gerektirir. Bu filtre kullanılarak, görüntüleyici sistemin hem hassasiyeti hem de çözünürlüğü ayarlanarak düşük substrat veya ürün konsantrasyonlarını saptama kapasitesini artırmak mümkündür. Filtre bant genişliği açısından belirli bir tolerans olduğunu unutmayın.Optimal olmayan bir filtre seçimi, duyarlılık çok daha düşük olsa da substratın kısmi olarak tespit edilmesine hala olanak tanır. Etiketli oligonükleotid konsantrasyonu ve görüntüleme cihazı ayarlarının uygun bir kombinasyonu, substratın güçlü bir şekilde tespit edilmesini sağlayabilir. Bu durum önemlidir çünkü substrat ardışık olarak fragmanlara ayrıldığı için, aktif bir ekzonükleaz ile inkübasyon sonrası ortaya çıkan degradasyon ürünleri her bantta daha düşük miktarlarda bulunacaktır.Başarılı bir ekzonükleaz deneyi, substratın ardışık olarak uçlara doğru degradasyonuna neden olacaktır. Sonuç olarak, jel üzerinde ekzonükleaz degradasyonunu temsil eden, DNA'nın karakteristik merdiven benzeri bir patern oluşturması sağlanır. Tespit için optimize edildiğinde, bu deney hem kalitatif hem de kantitatif olarak farklı aktivitelerin belirlenmesinde kullanılabilir.Örneğin, nükleaz mutantları için aktivitenin varlığı veya yokluğu, yabani tip protein ile karşılaştırılarak belirlenebilir. Farklı substratların nükleaz tarafından degrade edilme yetenekleri de test edilebilir. İnceleme aşamasındadır.Bu in vitro analiz, ilgilenilen bir nükleazın substrat özgünlüğünü ve işlemini test etmek için kullanılabilir.

a-fluorescence-based-exonuclease-assay-to-characterize-dmwrnexo

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İnsan Projeroid WRN Eksonükleazinin Homoloğu olan DmWRNexo'yu Karakterize Etmek ve Diğer Nükleazlara Uygulamak İçin Floresan Tabanlı Bir Eksonükleaz Testi

Maya genetik çalışmalar, hücresel DNA metabolizması insan genlerinin moleküler ve hücresel fonksiyonları araştırmak için istihdam edilebilir. Yöntem, insan genetik karakterizasyonu için...

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Biz DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Tahlil kinetik analiz mükellef DNA Onarım faaliyet oranları verir ve doku ve tümör lizatları veya saflaştırılmış proteinler ile DNA tamir aktivitesinin ölçümü için uyarlanabilir.

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

DNA polimeraz proofreading ve DNA onarım tahlil bir sigara etiketli ve radyo izotopik bir yöntem yüksek çözünürlüklü MALDI-TOF Kütle spektrometresi ve bir tek nükleotid uzantısı strateji kullanarak geliştirilmiştir. Tahlil çok özel, basit, hızlı ve kolay yazım denetleme için gerçekleştirmek ve tamir olmak için 9-nükleotit kısa yamalar kanıtladı.

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

DNA'ın sistemleri tarafından Rad51 aracılı Satım tepki strand floresans rezonans enerji transferi tabanlı gerçek zamanlı gözlem için geliştirilmiştir. Burada sunulan iletişim kurallarını kullanarak, biz tepki ara ürün ve ayrıca reaksiyon enzimatik kinetik analiz ederken onların dönüşüm ürünlerde, oluşumu tespit edebiliyoruz.

Rad51 tarafından aracılı DNA Strand Exchange tepki gerçek zamanlı gözlem

Değiştirilmiş nükleaz aktivitesi farklı insan koşulları ile ilişkili olmuştur, bir biyomarker olarak potansiyelinin altında yatan. Bu makalede sunulan modüler ve kolay tarama metodolojisi, hastalığın biyobelirteci olarak nükleaz aktivitesinden yararlanmak için spesifik nükleik asit problarının seçilmesine olanak sağlar.

Nükleik Asit Probları Kullanılarak Nükleaz Aktivitesinin Kinetik Taraması

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

DNAzyme tabanlı nanomakineler, nükleik asitlerin son derece seçici ve hassas tespiti için kullanılabilir. Bu makale, özgür yazılım kullanılarak 10-23 çekirdekli DNAzyme tabanlı nanomakinelerin tasarımı için ayrıntılı bir protokolü ve örnek olarak bir Epstein-Barr virüs parçasının tespitinde uygulanmasını açıklamaktadır.

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

Bir dizi lüminesans tabanlı ekstrakromozomal raportör substrat kullanarak hücrelerde çift iplikli kopma onarım yolu yeterliliğinin değerlendirilmesi için protokoller sunuyoruz.

Yüksek Verimli ve Kantitatif Lüminesans Tabanlı Raportör Testleri Kullanılarak DNA Çift İplikli Kırılma Onarım Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Bu çalışma, DNaz aktivitesinin tespiti ve kantitatif değerlendirmesi için basit, kullanıcı dostu bir oransal FRET testi sunar ve zayıf bir nükleazın analizinde uygulamasını gösterir.

DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi

Bu protokol, FEN1 (Flap Endonükleaz 1) aktivitesini ve inhibitör gelişimini ölçmek için bir jel kayması biyokimyasal testini tanımlar.

FEN1 Nükleaz Aktivitesinin Floresan Bazlı Tespiti ve Küçük Moleküllü İnhibitörlerin Taranması

Öğrenin, floresan bazlı eksonükleaz testi ile WRN eksonükleaz aktivitesini ölçme ve substrat tercihlerini analiz etme yöntemini. Bu teknik, genom stabilitesi araştırmalarında güvenli ve tekrarlanabilir sonuçlar sunar.

İnsan Progeroid WRN Eksonükleazının Ortologu DmWRNexoyu Karakterize Etmek için Floresan Bazlı Bir Eksonükleaz Testi ve Diğer Nükleazlara Uygulanması (Video) | JoVE Journal

İnsan Progeroid WRN Eksonükleazının Ortologu DmWRNexo'yu Karakterize Etmek için Floresan Bazlı Bir Eksonükleaz Testi ve Diğer Nükleazlara Uygulanması

Daha fazla video keşfet