Bağırsak Epitel Hücreleri Of Enterik Bakteriyel Invasion

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bağırsak epitel hücrelerinin istilasındaki bakteriyel etkileşimleri araştırmak için dikey difüzyon odası veya VDC modelini kullanmaktır. Bu, öncelikle VDC içinde ayrı apikal ve bazolateral kompartmanlar oluşturmak için polarize bir Caco 2 bağırsak epitel hücresi tek tabakasının yerleştirildiği özel bir filtre kullanılarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, ilgili bakteriyel inokülüm apikal kompartmana eklenir.

Mikro aerobik koşullar ve hücre kültürü altında, aerobik koşullarda bazolateral bölmeye besiyeri eklenir, ardından ko-kültür sırasında istenen zaman noktalarında filtre çıkarılır ve etkileşime giren veya hücre içi bakterilerin sayıları sayılır. Sonuç olarak, standart aerobik kültür koşullarıyla karşılaştırıldığında, VDC modeli kullanılarak etkileşime giren ve hücre içi bakteri sayısında bir artış gözlemlenebilir. Bu tekniğin, standart doku kültürü adezyon ve invazyon analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bakteriler ve intestinal epitel hücrelerin ko-kültürünün, insan bağırsağının in vivo koşullarını daha yakından taklit eden in vitro koşullar altında gerçekleştirilmesidir.

Prosedürü, laboratuvarımdan doktora öğrencisi N Vida nas ve laboratuvarımda doktorasının bir parçası olarak dikey difüzyon odası modelini geliştiren doktora sonrası araştırmacı Dominic Mills uygulamalı olarak gösterecektir. İşleme, kültür ortamındaki 0,4 mikron filtre başına 4 × 10⁵ Caco-2 intestinal epitel hücresi ekerek başlayın, ardından monotabanın polarizasyon durumunu doğrulamak için medyayı her iki ila üç günde bir değiştirerek hücreleri 21 gün boyunca polarizasyona kadar büyütün. Transepitelyal elektriksel direnci ölçmek için bir volt-ohm direnç ölçer kullanın.

VDC ko-kültür testi başlamadan 24 saat önce, jejuni'yi değişken atmosferli bir inkübatörde, mikro aerobik koşullar altında taze kanlı agar plaklarında inkübe edin. Aynı zamanda, 30 mililitre Bruce besiyerini aynı koşullar altında ön inkübasyona tabi tutun; deney gününde, VDC yarım bölmeleri ile O-ringleri ve tapaları sterilizasyon solüsyonuna daldırın. Ardından, her iki yarım bölmedeki gaz girişlerinden solüsyonu geçirmek için steril 20 mililitre bir şırınga kullanın. Bir saat sonra, gaz girişlerini durulamak için başka bir steril 20 mililitre şırınga kullanarak VDC bileşenlerini taze steril su ile durulayın.

Ardından, mililitrede yaklaşık 10¹⁰ CFU elde etmek için CJ jui kanlı agar plak kültürünün yarısını bir mililitre önceden inkübe edilmiş barella broth içerisine aktararak hasat edin. Bakteriyel koloni oluşturan birimleri veya CFU'ları yarı kantitatif olarak belirlemek için bakteriyel süspansiyonun optik yoğunluğunu 600 nanometrede ölçün ve ardından bakteriyel süspansiyonu, toplam dört mililitre önceden inkübe edilmiş Bruce broth içerisinde istenen inokülasyon seviyesine ayarlayın. Bu nihai bakteriyel süspansiyondan seri dilüsyon gerçekleştirin, ardından uygun dilüsyonu kanlı agar plaklarına üç paralel şeklinde ekim yapın ve plakları değişken atmosferli inkübatörde 48 saat boyunca inkübe edin.

Şimdi, VDC'nin alt yarı haznesini tezgaha düz bir şekilde yerleştirin ve üzerine bir O-ring takın. Ardından, bağırsak epitel hücrelerini taşıyan filtrelerden birini taşıyıcıdan ayırın ve 400 µL steril PBS ile üç kez yıkayın. O-ring'in yerinde kaldığından emin olarak filtreyi alt yarı hazneye yerleştirin ve ardından üst yarı hazneyi nazikçe yerine indirin.

İki yarım hazne monte edildikten sonra, halka klempler kullanarak bunları birbirine sabitleyin ve VDC'yi iki açıklığı yukarı bakacak şekilde tezgah üzerine yatay olarak yerleştirin. Apikal yarım hazneye bakteriyel inokülümü ekleyin ve ardından bazal lateral yarım hazneye dört mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin. Her iki yarım hazne üzerindeki açıklıklara uç parçalarını yerleştirin ve ardından VDC'yi değişken atmosferli inkübatöre yerleştirin.

Gaz manifolduna yakın bir noktada, gaz manifolduna bağlı olan gaz besleme regülatörünü açın. Manifolddan gelen tüpü, VDC'nin bazal lateral yarım haznesindeki gaz girişine takın ve ardından değişken atmosferli inkübatörden çıkan gaz çıkış borusunu, bazal lateral yarım haznesindeki uç parçada bulunan çıkışlardan birine bağlayın. Bazal lateral yarım haznesindeki uç parçada yer alan diğer çıkışı kapatın.

Ardlyşında, aşırı gaz basıncını önlemek ve uygun ko-kültür süresi sonunda her iki ila beş saniyede bir kabarcık oluşacak şekilde bir gaz akış hızı elde etmek için gaz manifoldundaki gaz akışını çok yavaşça açın. Gaz manifolduna bağlı olan gaz besleme regülatörünü kapatın. Daha sonra manifolddaki VDC'ye giden gaz akışını tahliye edin ve gaz girişini, gaz çıkışını ve tıpayı VDC'den ayırın.

Ardından, VDC'yi değişken atmosferli inkübatörden çıkarın. Daha sonra apikal ve bazal lateral süpernatantları alın ve sonraki analizler için -80 °C'de saklayın. Halka kelepçeleri sökün ve VDC'yi nazikçe parçalarına ayırın.

Filtreyi yarı hazneden çıkarın ve steril altı kuyucuklu bir hücre kültürü plağına aktarın. Ardından VDC'yi steril su ile yıkayın ve etkileşime giren toplam bakteri sayısının belirlenmesi için bir sonraki deney aşamasına kadar saklayın. Bağırsak epitel hücrelerini 400 µL steril PBS ile üç kez yıkayın ve ardından Triton X 100 içeren 400 µL steril PBS içerisinde oda sıcaklığında 20 dakika boyunca lizleyn; hücre lizatından seri dilüsyonlar hazırlayın ve uygun dilüsyonları kanlı agar plaklarına üç tekrar şeklinde ekimleyin.

Ardından, toplam istilacı bakteri sayısını belirlemek için plakları 48 saat boyunca 37 °C'de değişken atmosferli inkübatörde inkübe edin. Hücre dışı bakterileri öldürmek için intestinal epitel hücrelerini, 150 µg/mL Gentamycin içeren 400 µL hücre kültür ortamı ile standart bir doku kültürü inkübatöründe iki saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, hücre lizisi, seri dilüsyon ve kültürleme işlemlerinin ardından, az önce gösterildiği gibi koloni oluşturan birim miktarını belirleyin.

Aşağıdaki veriler, standart hücre kültürü analiz koşulları altında ile VDC modeli kullanılarak yapılan karşılaştırmada, üç, altı veya 24 saatlik ko-kültür sonrası C. jui'nin Caco-2 hücreleriyle etkileşime giren veya hücreleri istila eden sayısını göstermektedir. Örneğin, 24 saatlik ko-kültür sonrası, standart hücre kültürü koşulları altında Caco-2 hücreleriyle etkileşime giren 10⁷ CFU'dan daha az C. jui gözlemlenebilmektedir. Bununla birlikte, VDC modelinde 24 saatlik ko-kültür sonrası, Caco-2 hücreleriyle etkileşime giren yaklaşık 10⁸ CFU C. jui gözlemlenmiş olup, bu durum C. jui ile IEC etkileşimlerinde neredeyse on katlık bir artışa karşılık gelmektedir.

Standart ve VDC kültür koşulları altında istilacı CJ jui sayısı karşılaştırıldığında, standart hücre kültürü koşulları altında 24 saat sonra CACO iki hücrelerinden yaklaşık 10⁵ hücre içi CFU CGE jui izole edilebilir. Buna karşın, VDC modelinde 24 saatlik ko-kültür sonrası CACO iki hücrelerinden yaklaşık 10⁷ hücre içi CFU izole edilebilmekte ve hücre içi CGE'de neredeyse 100 katlık bir artış görülmektedir. Bu prosedür uygulanırken, bazolateral bölmede gaz akışının gelişimi sonrası izlenmesi önemlidir.

Bu teknik, abuc patogenezi alanındaki araştırmacıların, hem bakterilerin intestinal epitelyal hücrelerle etkileşiminin genetik temelini hem de konakçının bakteriyel enfeksiyona karşı verdiği doğal bağışıklık yanıtını incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, diğer enterik bakterilerin intestinal epitelyal hücrelerle etkileşimlerini çalışmak için dikey difüzyon odası modelinin nasıl kullanılacağını ve insan bağırsağındakilere daha yakın olan koşulları nasıl temsil edeceğinizi iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.