Name: Bağırsak Epitel Hücreleri Of Enterik Bakteriyel Invasion In Vitro Dramatik bir Dikey Difüzyon Odası Modeli Geliştirilmiş mı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Keşfedin dikey difüzyon odası modelini kullanarak bağırsak epitel hücrelerinde bakteri etkileşimlerini ve istilasını incelemeyi. Bu yöntem, fizyolojik oksijen koşullarında Campylobacter jejuni davranışını değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dominic Mills Bloomsbury Kolejler Doktora Bursu (2007-2010) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar VDC modeli gelişmekte olan onların yardım için Ozan Gündoğdu ve Abdi Elmi de teşekkür etmek istiyorum.

1. Özel 0.4 mikron Filtreler IEC Tek katmanlar Büyüme <ol><li> Dulbecco&#39;nun modifiye temel ortam, kültür, Caco-2 hücreleri (DMEM)% 10 (v / v) fetal dana serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve% 1 (v / v) ile gerekli olmayan amino asitler ile desteklenmiş 37 standart bir doku kültürü kuluçka °% 5 CO2 ve% 95 hava C &#39;dir. Tohum 4 x 10 5 Caco-2 0.4 mikron başına IECS filtre ve 21 gün içinde kutuplaşma büyümeye, medya 2-3 günde değişiyor. </li><li> Bir Volt-Ohm direnç metre kullanarak tek tabaka polarizasyon durumunu onaylamak için TEER ölçün. Çalışmalarda, 21 günün TEER Caco-2 bu 0.4 mikron filtre yetiştirilen hücreler 700-800 Ωcm 2&#39;dir. </li></ol> 2. C. hazırlanması jejuni ve Coculturing tahlil için Bakteriyel Orta <ol><li> VDC coculturing testinin istenen başlangıç ​​noktası önce 24 saat, C taze bir kan agar plaka hazırlamak. 37 jejuni ve inkübe ° C değişken atmosfer inkübatör mikroaerobik koşulları (% 85 N 2, 5% O 2, ve% 10 CO 2) altında. </li><li> Aynı zamanda, değişken ortam inkübatör mikroaerobik koşullar altında 37 ° C &#39;de Brucella et suyu 30 ml Preincubate. </li></ol> 3. Hazırlık ve Test öncesinde VDC Yarım Odaları Sterilizasyon <ol><li> Batırmayın VDC yarısı odaları yanı sıra O-ring ve sterilizasyon çözüm fişleri. </li><li> , Steril bir 20 ml&#39;lik şırınga kullanarak, yarı odaları hem de gaz girişleri aracılığıyla sterilizasyon çözeltisi yıkayın. Aksi takdirde, coculturing sırasında numunelerin kirlenmesine neden olabilir. </li><li> &gt; 1 saat için sterilizasyon solüsyonuna daldırılır tüm bileşenleri bırakın. </li><li> Gaz girişleri temizlemek için başka bir steril 20 ml şırınga kullanarak, temiz steril su ile durulayın. </li></ol> 4. HazırlıkBakteriyel inokulum <ol><li> C. yarım tabak hasat kan agar plağından jejuni büyüme kuluçkaya yatırılmış brusella suyu 1 ml içine önceki gün hazırladı. Bu ~ 10 10 kob / ml boyun eğmek zorundadır. </li><li> Bakteriyel koloni oluşturan birim (CFU) semiquantify ile 600 nm de bakteriyel süspansiyonun optik yoğunluğunun ölçülmesi. </li><li> Kuluçkaya yatırılmış Brucella brot 4 ml inokulum istenen seviyeye bakteri süspansiyonu ayarlayın. </li><li> Daha sonra, inokulum mevcut bakteriyel CFU sayısını ölçmek için, 48 saat boyunca, değişken bir atmosfer inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe üç tekrarlı olarak kan agar plakaları üzerine uygun dilüsyonları, kaplama, ardından, bu nihai bakteriyel süspansiyon bir seri seyreltme gerçekleştirin. </li></ol> 5. VDC ayarlama <ol><li> Tezgah üzerine VDC düz alt yarısında odasına yerleştirin. Alt yarısında odasının üzerine bir O-ring takın. </li><li> T IECS taşıyan bir filtre ayırıno bir taşıyıcı ve steril PBS 400 ul ile üç kez yıkayın. O-ring yerinde kalır emin, alt yarısı odasının üzerine filtre yerleştirin. </li><li> Yavaşça üst yarısında odasına yerine indirin. Iki yarı-odaları monte edildikten sonra, halka kelepçelerle birbirine kenetlenmiştir. Yukarı bakacak şekilde iki açıklık ile, tezgah üstüne yatay olarak VDC yerleştirin. </li><li> Apikal yarısı odasına bakteriyel inokulum 4 ml ekleyin. </li><li> Yarı bazolateral bölmeye hücre kültürü ortamı 4 ml ilave edilir. </li><li> Yarım odaları hem deliklerine sonunda parçaları yerleştirin. </li></ol> 6. Değişken Atmosfer İnkübatör içinde Gaz Manifold için VDC takılması <ol><li> Gaz manifoldu yakın değişken atmosfer kuvöz içine VDC yerleştirin. </li><li> Gaz manifoldu bağlı gaz regülatörü açın. VDC bazolateral yarısı odasına üzerindeki gaz girişine manifoldundan tüp takın. Ga takıns çıkış borusu bazolateral yarım odası üzerinde son-parça satış birine değişken atmosfer inkübatör dışında lider. </li><li> Bazolateral yarım odası üzerinde son parçalı diğer çıkış kapalı kapatın. Bu bazolateral ortamın sınırdışı yol açabilir gibi, aşırı gaz basıncı önlemek için çok yavaş açmak için bakımı, gaz manifoldu üzerinde gaz akışını açın. </li><li> Amaç 1 kabarcık her 2-5 saniye bir gaz akışı. Periyodik olarak, deney sırasında gaz akışını kontrol etmek ve gerektiğinde ayarlayın. </li></ol> 7. Kokültürü sonra VDC sökülmesi <ol><li> Uygun kokültürü süre sonra, gaz manifolduna bağlı gaz regülatörü kapatın. Manifoldunda VDC içine gaz akışını kapatın. Gaz girişi, gaz çıkışı ve VDC gelen stoper çıkarın. </li><li> Bir değişken atmosfer inkübatör VDC çıkarın. Subsequen için -80 apikal ve bazolateral süpernatanlar ve mağaza ° C çıkarınT analizi. </li><li> Halka kelepçeleri çıkarın ve yavaşça VDC parçalara ayırmak. Yarı odası ve steril bir 6-kuyulu hücre kültürü çanak transfer filtre çıkarın. Steril PBS ile 400 ul IECS üç kez yıkayın. </li><li> Etkileşim bakteri sayısının sayılması için, Triton X-100 IECS için% 0.1 içeren steril PBS içinde 400 ul (v / v) ekleyin ve IEC eritmek için, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Daha sonra bakteriyel CFU etkileşim sayısını ölçmek için, 48 saat boyunca, değişken bir atmosfer inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe üç tekrarlı olarak kan agar plakaları üzerine uygun dilüsyonları, kaplama, ardından, bu hücre lizatından bir seri seyreltme gerçekleştirin. </li><li> Istilacı bakteri sayısının sayılması için,% 5 CO2 ve% 95 37 ° C&#39;de standart bir doku kültürü inkübatörü içinde, 2 saat boyunca inkübe IECS ve 150 ug / ml gentamisin ihtiva eden DMEM hücre kültür aracı maddesi ° C arasında 400 ul dışı bakterileri öldürmek için hava,daha sonra yukarıda adım 7.4 için olarak izleyin. </li></ol> 8. Kokültürü sonra VDC temizleme Deneylerin bir sonraki tur için steril su ve mağaza ile VDC yıkayın.

<ol><li>Mills, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+Campylobacter+jejuni+invasion+of+intestinal+epithelial+cells+under+low-oxygen+coculture+conditions+that+reflect+the+in+vivo+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment.</a> Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).</li>
<li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465, 355-358 (2010).</li>
<li>Dorrell, N., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+century+of+Campylobacter+research%3A+recent+advances%2C+new+opportunities+and+old+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).</li>
<li>Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni%3A+molecular+biology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).</li>
<li>Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+L+%22Campylobacter%22">Campylobacter</a>. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).</li>
<li>Everest, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Caco-2+cells+as+a+model+for+enteric+invasion+by+Campylobacter+jejuni+and+C.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli.</a> J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).</li>
<li>Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+internalization+and+intracellular+survival+of+Campylobacter+jejuni+in+human+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures.</a> Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).</li>
<li>Monteville, M. R., Konkel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-facilitated+invasion+of+T84+eukaryotic+cells+by+Campylobacter+jejuni+occurs+preferentially+at+the+basolateral+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface.</a> Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).</li>
<li>Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+culture+methods+for+investigating+Campylobacter+invasion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms.</a> J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).</li>
<li>Schuller, S., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microaerobic+conditions+enhance+type+III+secretion+and+adherence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+to+polarized+human+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells.</a> Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).</li>
<li>Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microaerophilic+conditions+permit+to+mimic+in+vitro+events+occurring+during+in+vivo+Helicobacter+pylori+infection+and+to+identify+Rho%2FRas-associated+proteins+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling.</a> J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenlerin etkileşimleri incelemek için in vitro hücre kültürü yöntemleri içinde kullanımı yaygın olarak pek çok araştırma laboratuarlarında kullanılan bir tekniktir. Bu hücre kültürü deneyleri aerobik şartlar altında gerçekleştirilir Ancak, bu in vitro modellerde doğru konak-patojen yer aldığı in vivo ortamda temsil olmayabilir. Yaygın olarak in vitro enfeksiyon modellerinde kullanılan mikroaerofilik C. çalışmak için özelli...

Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenler etkileşimleri, in vitro hücre kültürü yöntemleri kullanılarak yoğun bir şekilde araştırılmıştır. Bu hücre kültürü deneyleri, ev sahibi hücrelere bakteriyel yapışma, konak hücre reseptörleri, yollar ve ev sahibi hücrelerin bakteri istilası sinyal konak hücrenin kimlik kullanan tüm birçok önemli gözlemler sonucu, ayrıntılı olarak incelenmiştir. Ancak bu hücre kültürü deneyleri in vivo ortamda temsil olmayabilir aerobik koşullar altında yapılmaktadır. Gastrointestinal enfeksiyonlar incelemek için kullanılan in vitro modellerinde önemli bir sınırlama yüksek oksijen seviyesi de dahil olmak üzere kültür koşulları genellikle ökaryot hücre sağkalım lehine olmasıdır. Bununla birlikte, bağırsak lümeninden koşulların hemen hemen anaerobik olacaktır. Çok düşük bir oksijen ortamında enterik patojenlerin olan ekspresyon değişikliği aerobik şartlar altında 2 enfeksiyon genlerini ifade eder. Bu nedenle, veri standart hücre kültürü modelleri m kullanılarak eldeay konak hücreleri ile bakteriyel etkileşimlerin bir yanlış göstergesidir. Campylobacter jejuni hafif ishal şiddetli enflamatuar enterit değişir bu belirtiler, dünya çapında bakteriyel akut gastroenterit önde gelen etken olduğunu. C çoğunluğu basit gastroenterit jejuni enfeksiyonları sonucu, ancak C. jejuni da Guillain-Barre sendromu (GBS) dahil olmak üzere çevresel nöropatiler, en yaygın olarak tespit bulaşıcı bir ajandır. İngiltere&#39;de, bu C&#39;nin neden enterit 500.000 &#39;den fazla vaka olduğu tahmin edilmektedir 580.000.000 £ Birleşik Krallık&#39;ın ekonomisine tahmin maliyeti jejuni enfeksiyonu her yıl. Gelişmekte olan ülkelerde, C. jejuni çocuklar arasında ölüm önde gelen nedenidir. Şüphesiz Campylobacter enfeksiyon önemi ve kapsamlı genomik-tabanlı analiz, C dahil olmak üzere araştırma yıllardır rağmen, jejuni patogenezi hala tam underst olduğunuood, Salmonella, Escherichia coli, Shigella, ve Vibrio cholerae gibi diğer enterik patojenler aksine. Uygun bir küçük hayvan modeli eksikliği bu 3 için önemli bir nedenidir. Ayrıca yaygın olarak in vitro enfeksiyon modellerinde kullanılan mikroaerofilik C çalışmak için daha uygun değildir fakültatif anaeroblar diğer enterik patojenler için daha jejuni. Iken C. jejuni istilacı patojen, C. mekanizmaları olarak kabul edilmektedir bağırsak epitel hücrelerinin jejuni işgali (IECS) hala 4,5 belirsiz. C. jejuni işgal ya mikrofilamanlar, mikrotübüller, her ikisi de bir arada ya da ikisinin de 5 bağımlı olduğu gösterilmiştir. Bu alanda karışıklık muhtemelen in vitro test koşullarında uygunsuz kullanım kaynaklanmaktadır. Farklı hücre kültürü analizlerinden bir dizi C etkileşimi araştırmak için kullanılmıştır jejuniev sahibi hücrelerle. Caco-2 6, INT 407 7, 8 ve T84 hücre hatları tüm farklı C. adhezyon ve invazyon yetenekleri incelemek için kullanılmıştır jejuni suşları. Ancak, C. için bakteriyel yapışma ve invazyon seviyeleri IECS ile jejuni diğer enterik patojenler 9 daha önemli ölçüde düşüktür. C. coculturing IECS ile jejuni, normal IECS hayatta kalması için gerekli atmosferik oksijen seviyeleri yakın koşullar altında bir CO2 inkübatör içinde gerçekleştirilir. ° C. jejuni gen ekspresyon atmosferik oksijen koşullarına göre bağırsak lümen düşük oksijen ortamda çok farklı olacaktır. Dikey bir difüzyon hücresinde (VDC) sistemi kullanımı, farklı orta ve gazı koşulları altında 1,10,11 bakteri ve konak hücrelerin kokültürü izin veren geliştirilmiştir. Bu sistem bakteri un olacak insan bağırsak koşullarını taklitçok düşük oksijen iken doku der koşulları kan akışından oksijen ile tedarik edilecektir. Özel bir 0.4 mikron filtre yetiştirilen Polarize IEC mono tabakaları bireysel bakteriyel suyu ve sırasıyla, hücre kültürü ortamı (Şekil 1) ile doldurulmuş bir apikal ve bazolateral bölmesi, oluşturma VDC içine yerleştirildi. VDC değişken bir atmosfer inkübatöründe 37% 85 N2,% 5 O2 ve% 10 CO2 içeren ° C, C için en uygun koşulların temsil yerleştirildi jejuni. Apikal bölmesi açık bıraktı ve değişken atmosfer inkübatör içinde mikroaerobik atmosfere maruz kalmış, kapalı bazolateral bölmesi iken% 5 CO 2 / basınç birikimi engelleyen bir çıkış borusu ile% 95 O 2 gaz karışımı sürekli yönetimi tarafından oksijen ile sağlanan . Bu koşullar altında, Caco-2 hücre hayatta kalması ve tek tabaka bütünlüğü transepitelyal ele izlenmesi ile doğrulanmıştır24 saat boyunca tek tabaka üzerinde ctrical direnci (TEER), apikal bölmeye düşük oksijen koşullarında apikal ve bazolateral bölmelerinin Caco-2 hücre tek ve fiziksel olarak ayrılması hayatta göstermek için. Değişken atmosfer inkübatör (Mikroaerobik koşulları) ve bir standart hücre kültürü CO 2 inkübatör (aerobik koşullarda) muhafaza VDCs içinde mono tabakaları TEER farklı atmosferik koşullar 1 altında hücre tek tabaka bütünlüğünü gösteren, anlamlı farklılık gösterdi. Mikroaerobik koşullar altında, sıkı bağlantıları mevcut ve eşit aerobik koşullarda 1 altında muhafaza hücreleri benzer bir occludin boyama deseni ile hücre sınırları arasında dağıtılır kaldı. C. etkileşimleri VDC Caco-2 ve T84 hücreleri ile jejuni bakteriyel etkileşim (yapışma ve işgali) ve işgali değerlendirerek incelenmiştir. Iki farklı ° C. jejuni yabani tip strains 1 kullanıldı. C. jejuni 11168H orijinal dizisi gerginlik NCTC11168 bir hypermotile türevidir. 11168H gerginlik bir civciv kolonizasyon modelinde çok daha yüksek kolonizasyon düzeyi gösterir ve bu nedenle konak-patojen etkileşim çalışmaları için kullanılacak uygun bir gerginlik olarak kabul edilir. 81-176 bir insan izole etmek ve en invaziv yaygın olarak incelenmiştir laboratuar suşları biridir. ° C. jejuni suşları mikroaerobik veya aerobik şartlar altında bir ya da VDC apikal bölmesine ilave edildi. Biz etkileşim ve işgali hem de yüksek oranda C için kaydedildi gözlenen mikroaerobik koşullar 1. altında jejuni. Artan ° C. jejuni etkileşimleri mikroaerobik koşullar 1 altında bakteri sayısındaki artış nedeniyle değildi. Bu veri VDC apikal bölmesinde düşük oksijen ortamında bakteri-konak ilişkileri geliştirir ve gösterir bizim hipotezi desteklediği C invaziv özellikleri jejuni incr olanBu koşullar altında hafifletti. Bu invaziv bakteriyel patojen incelemek için VDC modelinin kullanımının ilk rapor ve daha yakından in vivo durumda taklit koşullarda in vitro enfeksiyon tayinlerde performans önemini vurgulamaktadır. VDC modeli çok farklı bakteri türleri için konak-patojen etkileşimleri çalışmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Snapwell kesici uçlarla kullanım için özel dikey difüzyon sistemi</td><td>Harvard Aparatı</td><td>66-0001</td><td>Manifold ve altı Snapwell haznesi</td></tr><tr><td>Kapaklar</td><td>Harvard Aparatı</td><td>66-0020</td><td></td></tr><tr><td>O-ringler</td><td>Harvard Aparatı</td><td>66-0007</td><td></td></tr><tr><td>Kelepçeler</td><td>Harvard Aparatı</td><td>66-0012</td><td></td></tr><tr><td>Snapwell filtreleri (gözenek boyutu 0.4 & mu; m)</td> <td>Corning Costar</td><td>3407</td><td></td></tr><tr><td>Millicell ERS-2 Volt-Ohm direnç ölçer</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>WPA Lightwave II spektrofotometre</td><td>Biochrom</td><td>80-3003-72</td><td></td></tr></tbody></table>

bağırsak epitel hücreleri of enterik bakteriyel invasion<em&gt; in vitro</em&gt; dramatik bir dikey difüzyon odası modeli geliştirilmiş mı

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenler etkileşimleri, in vitro hücre kültürü yöntemleri kullanılarak yoğun bir şekilde araştırılmıştır. Bu hücre kültürü deneyleri aerobik şartlar altında gerçekleştirilir Ancak, bu in vitro modellerde doğru konak-patojen yer aldığı in vivo ortamda temsil olmayabilir. Farklı orta ve gaz koşullarında bir bakteri ve konak hücrelerin kokültürü izin enfeksiyonun bir in vitro modeli geliştirdik. Dikey difüzyon hücresinde (VDC) modeli bakteriler çok düşük oksijen iken doku koşulları altında olacak insan bağırsak koşulların kan akışından oksijen ile tedarik edilecek taklit eder. Bir VDC içine Snapwell ekler yetiştirilen polarize bağırsak epitel hücre (IEC) mono tabakaları yerleştirilmesi ayrı apikal ve bazolateral bölmeleri oluşturur. Bazolateral bölmesi, hücre kültür ortamı ile doldurulmuş ve kapatılmış oksijen w ile perfüzeApikal bölmesi Hilst suyu ile doldurulur, açık tutulur ve mikroaerobik koşullar altında inkübe edildi. Caco-2 ve T84 Hem IECS hücre yaşamını ya da tek tabaka bütünlüğü üzerinde belirgin bir zararlı etki olmaksızın, bu koşullar altında VDC korunabilir. Coculturing deneyler değişik C ile gerçekleştirilir apikal bölmeye mikroaerobik koşullara jejuni, vahşi tip suş ile VDC model içinde farklı IEC hattı tekrarlanabilir aerobik kültür koşulları ile karşılaştırıldığında bir etkileşim sayısı (yaklaşık 10 kat) artış ve hücre içi (hemen hemen 100 kat) bakterilerin neden 1. VDC modeli oluşturulan ortamı daha yakından C. karşılaştığı çevre taklit eder ve insan bağırsak jejuni daha yakından in vivo gerçekte taklit eden şartlar altında in vitro enfeksiyon deneyleri gerçekleştirmek önemini vurgulamaktadır. Biz VDC modelinin kullanımının etkileşim yeni yorumlar bahis sağlayacak teklifbakteriyel patojenler ve konak hücreleri da muhtemelen bir.

Coculturing deneyler C ile gerçekleştirilen jejuni, yabani tip suşu ve apikal bölmeye mikroaerobik koşullara VDC modelinde IECS bir süre içinde aerobik kültür koşulları ile karşılaştırıldığında bir etkileşim sayısındaki artış (yaklaşık 10 kat) ve hücre içi (hemen hemen 100 kat) bakteri göstermiştir bağımlı bir şekilde 1. Bu gözlem, iki farklı C. kullanarak tekrarlanabilir olduğu jejuni yabani tip suşları (11168H ve 81-176) ve iki farklı IEC hatları (Caco-2 ve T84), VDC mode...

Aerobik koşullarda bakteri yapışma ve işgali araştırmak için hücre kültürü deneyleri Sahne genellikle temsil edici olduğu<em&gt; In vivo</em&gt; Ortam. Bir Dikey Difüzyon Odası modeli insan patojen etkileşimleri çalışma sağlar<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Daha altında bağırsak epitel hücreleri ile<em&gt; In vivo</emKoşullar&gt; gibi, gelişmiş bakteri istilası sonucu.

Bağırsak Epitel Hücreleri Of Enterik Bakteriyel Invasion<em&gt; In Vitro</em&gt; Dramatik bir Dikey Difüzyon Odası Modeli Geliştirilmiş mı

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bağırsak epitel hücrelerinin istilasındaki bakteriyel etkileşimleri araştırmak için dikey difüzyon odası veya VDC modelini kullanmaktır. Bu, öncelikle VDC içinde ayrı apikal ve bazolateral kompartmanlar oluşturmak için polarize bir Caco 2 bağırsak epitel hücresi tek tabakasının yerleştirildiği özel bir filtre kullanılarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, ilgili bakteriyel inokülüm apikal kompartmana eklenir.Mikro aerobik koşullar ve hücre kültürü altında, aerobik koşullarda bazolateral bölmeye besiyeri eklenir, ardından ko-kültür sırasında istenen zaman noktalarında filtre çıkarılır ve etkileşime giren veya hücre içi bakterilerin sayıları sayılır. Sonuç olarak, standart aerobik kültür koşullarıyla karşılaştırıldığında, VDC modeli kullanılarak etkileşime giren ve hücre içi bakteri sayısında bir artış gözlemlenebilir. Bu tekniğin, standart doku kültürü adezyon ve invazyon analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bakteriler ve intestinal epitel hücrelerin ko-kültürünün, insan bağırsağının in vivo koşullarını daha yakından taklit eden in vitro koşullar altında gerçekleştirilmesidir.Prosedürü, laboratuvarımdan doktora öğrencisi N Vida nas ve

enteric-bacterial-invasion-intestinal-epithelial-cells-vitro-is

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu protokol, eşzamanlı ve lokalize epitel hücreleri ve bakteri kültürü için bir mikroakışkan ortak kültür modeli açıklamaktadır. Bu model, varsayılan probiyotik bakteri suşlarının etkinliğini patogenezinde farklı çözünür moleküler sinyallerin rolünü araştıran gibi ekran için kullanılabilir.

Çözünür Sinyal aracılı Etkileşimleri Araştırılması için Epitel Hücreleri ve Bakteriler mikroakışkan Co-kültür

Kaynak: Calatayud Arroyo, M. ve diğerleri. In vitro bağırsak konak-mikrob arayüzünde sentetik bakteriyel konsorsiyumunun uygulanabilirliğinin değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018).Bu video, bakteriyellerin canlılığını incelemek için in vitro bağırsak konakçı-mikrop modelini gösteriyor. Caco-2 ve HT29-MTX hücrelerinin ortak kültürü, simüle edilmiş sindirim koşullarında önceden işlenmiş bakterilerle kuluçka geçirilir. Epitel bariyer bütünlüğü transepitelyal elektriksel direnç kullanılarak...

Bakteriyel Yapışma ve İçselleştirmeyi Değerlendirmek İçeriği Değerlendirmek İçerik Bağırsak Modeli

Bu video, enfeksiyon yayılımını incelemek için plasental dokularda bir enfeksiyon modeli oluşturma yöntemini göstermektedir. Bir ex vivo plasental organ kültürü, fakültatif bir hücre içi parazit olan Listeria monocytogenes ile enfekte olur. Bakteriler, plasenta dokusuna girmek için ekstravillöz trofoblastları (EVT'ler) istila eder ve daha sonra hücreden hücreye yayılma yoluyla diğer hücrelere yayılır.

Ex Vivo Organ Kültüründe Bakteriyel Enfeksiyon Modeli Oluşturma Tekniği

Mukozal bakteriyel enfeksiyona yanıt olarak nötrofil trans-epitel göçü epitel yaralanmasına ve klinik hastalığa katkıda bulunur. Bu fenomeni düzenleyen moleküler mekanizmaların çözülmesine yönelik araştırmaları kolaylaştırmak için transwell filtrelerinde yetişen patojen, insan nötrofilleri ve polarize insan epitel hücre katmanlarını birleştiren bir in vitro model geliştirilmiştir.

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Bu protokol, apikal yüzeye erişime izin veren, ters polariteye sahip ince bağırsak enteroidlerini kullanan apikal-dışarı nekrotizan enterokolit (NEC) bir çanak içi modelini tanımlar. NEC ile ilişkili epitel bozulmasını tespit etmek için bir immünofloresan boyama protokolü ve NEC-in-a-dish protokolüne tabi tutulan apikal-out enteroidlerin yaşayabilirliğini belirlemek için bir yöntem sunuyoruz.

İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Mevcut protokol, bağırsak geçirgenliğini belirlemek için apikal-dışarı enteroid modelinde lusifer sarısı kullanan bir yöntemi özetlemektedir. Bu yöntem, nekrotizan enterokolit gibi inflamatuar bağırsak hastalıklarını modelleyen enteroidlerde parasellüler geçirgenliği belirlemek için kullanılabilir.

Apikal-Out Enteroid Modelde Lucifer Sarı Kullanarak Bağırsak Geçirgenliğinin Belirlenmesi

Escherichia coli, doğum sırasında bakterileri yutan yenidoğanlarda sepsise neden olur. E. coli'nin enterik yoldan kan dolaşımına seyahat etme kabiliyetinde yer alan süreç tam olarak anlaşılamamıştır. Bu in vitro model, E. coli suşlarının bağırsak epitel hücrelerinden geçme yeteneğini değerlendirir.

Yenidoğan Escherichia coli Bakteriyemi İzolasyonlarının İntestinal Transsitozunun Değerlendirilmesi

Bu protokol, hastalık patogenezine yönelik mekanik çalışmalar için kullanılabilen bir in vitro nekrotizan enterokolit (NEC) modelini açıklar. İnsan yenidoğan bağırsağından, endotel hücrelerinden ve şiddetli NEC'li bir yenidoğanın bağırsak mikrobiyomundan türetilen bağırsak enteroidleri ile tohumlanmış bir mikroakışkan çipe sahiptir.

İnsan Yenidoğan Bağırsak Enteroidlerini ve Disbiyotik Mikrobiyomu İçeren Nekrotizan Enterokolitin Mikroakışkan Modeli

Mevcut protokol, in vitro epitel hücre dizileri kullanılarak Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu sorgulamak için enfeksiyon testlerini açıklamaktadır.

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

Çalışma, doku kök hücresinden türetilen bağırsak organoidleri kullanılarak bakteriyel enfeksiyonun in vitro incelenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Protokol, organoidlerin iki boyutta nasıl kültürleneceğini ve farklılaştırılacağını, onları yapışkan-invaziv Escherichia coli ile enfekte edeceğini ve epitel bariyer sızıntısı, enfeksiyon görüntüleme ve epitel RNA yanıtı gibi önemli okumaları nasıl değerlendireceğini açıklar.

Konak-bakteri etkileşimlerini incelemek için invazin veya bazal zar ekstraktı üzerine iki boyutlu organoid kültürü

Yapışkan-invaziv Escherichia coli suşlarında antibiyotik direnci, geleneksel gentamisin koruma testi kullanılarak bakteriyel invaziyanı değerlendirmede zorluklar yaratmaktadır. Bakteriyel istilayı nicel olarak değerlendirmek için koloni oluşturan birimlerin sayılması ve enfekte hücrelerin immünofluoresans konfokal mikroskopisi ile niteliksel olarak görselleştirilmesi için geliştirilmiş bir yöntem tanımlanmıştır.

Escherichia coli hücre istilasının nicelendirilmesi ve görselleştirilmesi için amikacin koruma testi

Keşfedin dikey difüzyon odası modelini kullanarak bağırsak epitel hücrelerinde bakteri etkileşimlerini ve istilasını incelemeyi. Bu yöntem, fizyolojik oksijen koşullarında Campylobacter jejuni davranışını değerlendirmeye yardımcı olur.

Bağırsak Epitel Hücreleri Of Enterik Bakteriyel Invasion

Daha fazla video keşfet