Fare Direnç arterlerden mikrovasküler endotel Tüpler İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, doğal bir sağlam mikrovasküler endotelin hücre içi ve hücre içi sinyal dinamiklerini incelemek için endotel hücre tüplerini fare superior epigastrik arterinden veya SEA'dan izole etmektir. Bu, önce SEA'nın fare abdominal iskelet kası duvarından izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, damar nazikçe ve somatik olarak sindirilir ve daha sonra düz kas hücrelerini ve adventitiyi endotel hücre tüpünden ayırmak için dikkatlice TATed.

Son adımda, tüp bir akış odasına sabitlenir ve fizyolojik bir tuzlu su çözeltisi ile süper kaynaştırılır. Sonuç olarak, konfokal görüntüleme, doğal sağlam mikrovasküler endotel tüpündeki kalsiyum sinyalizasyonunu görselleştirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin endotel hücrelerinin kültürlenmesi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, tüpü oluşturan ve doğal morfolojilerini, protein ekspresyonlarını ve yanıt verebilirliklerini koruyan endotel hücrelerinin endotel, vücuttaki kan akışı kontrolünün ayrılmaz bir parçasıdır.

Bu tekniğin uygulanması, kan akışı kontrolüne aracılık eden hücreden hücreye sinyalleme olaylarını ve vasküler disfonksiyon sırasında nasıl ters gidebileceklerini araştırmamıza olanak tanır. Önce SEA'yı izole etmek için, anestezi uygulanmış bir farenin kasık bölgesi alanının hemen üzerindeki deriden küçük bir kesi yapın, kesiği her iki yönde yanal olarak ilgili arka bacaklara uzatın ve ardından insizyona ventral orta hat boyunca göğüs kafesinin tepesine kadar devam edin ve insizyonu her iki yönde yanal olarak ilgili dört uzuvlara daha da uzatın. Şimdi cildi nazikçe kaldırın ve cildi alttaki kaslara tutan bağ dokusunu kesin ve karın kaslarının tüm yüzeyini açığa çıkarın.

Açıkta kalan kası oda sıcaklığında tuzlu su çözeltisi ile sulayın. Daha sonra stereo mikroskop altında, sternumun altında bulunan yağ yastığını kaldırın. Yağ yastığı boyunca ve alt kaburga boyunca bir kesi yapın.

DENİZ şimdi görünür olmalı, artere zarar vermemeye dikkat etmeli, maruz kalan dokuyu daha fazla oda sıcaklığı, tuzlu su çözeltisi ile sulamalıdır. İskelet kasının üst tabakası geri çekildikten sonra, SEA'nın uzunluğuna dikkat edin ve ardından arterin altındaki ince kas tabakasını dikkatlice çıkarın. Ardından, SCA'nın altından altı oh ipek sütür uzunluğunda bir geçiş yapmak için açılı forseps kullanın.

Daha sonra arteri ve bitişik damarını basınçlı tutmak ve kanı damar lümeni içinde tutmak için bağlayın. SCA'yı karşı tarafta bağladıktan sonra, ilgili tarafları ayırmak için karın kaslarının orta hattı boyunca bir kesi yapın ve ardından kesiyi cilt için yapıldığı gibi her iki yönde yanal olarak uzatın. Karın kasını vücuttan tamamen ayırmak için kesiye dış kenar boyunca dikey olarak devam edin.

Daha sonra, sızdırmazlığı korumak için SEA'yı ligasyonun üzerinde kesin ve izole edilen kas ve arteri 10 mililitre dört santigrat derece diseksiyon tamponu içeren 50 mililitrelik bir behere yerleştirin. Kası karnın diğer tarafından izole ettikten sonra, dokuları diseksiyon tamponunda 10 dakika inkübe edin. Şimdi, SEA'yı içeren karın kasını, bir silindir koruyucu tabakası ile kaplanmış ve diseksiyon tamponu içeren dört santigrat derece Petri kabına yerleştirin SEA ve kasları daha önce belirtilen yaklaşık in vivo uzunluklarına germek için 0.15 milimetre böcek pimleri kullanın.

SEA'yı, kasları peritona bakan ince tabaka üstte olacak şekilde yönlendirerek silindir koruyucusuna sabitleyin. Daha sonra, yukarı akış ligasyon bölgesinden aşağı akış ucuna doğru çalışarak, SEA'nın eşleştirilmiş damarından ve çevresindeki dokudan ilk ana dal bölgesine kadar yaklaşık bir ila iki santimetre temizleyin. SEA'yı dal sahasının hemen üzerinde ve ligasyonun hemen altında kesin.

Ardından, bir pipetin arka ucunu buz gibi soğuk diseksiyon tamponu içeren beş mililitrelik bir şırıngaya takmak için bir parça elastik boru kullanın. Kanülasyon pipet ucunu diseksiyon haznesine sabitleyin ve SEA'yı kanüle edin. Daha sonra tüm eritrositler dışarı atıldıktan sonra, SEA'yı kanülasyon pipetinden çıkarın ve endotel tüplerini izole etmek için pipeti diseksiyon kabından çıkarın.

İlk olarak, 12 x 75 milimetrelik bir cam kültür tüpünü yarıya kadar buz gibi soğuk diseksiyon tamponu ile doldurun. Daha sonra SEA'yı bir ila üç milimetrelik parçalara kestikten sonra, arteriyel parçaları kültür tüpüne aktarmak için açılı forseps kullanın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, sindirim enzimlerini ayrışma tamponu ile ayrı bir 12 x 75 milimetre kültür tüpünde bir mililitrelik nihai hacme birleştirin ve enzim çözeltisini bir ısıtma bloğu ile 37 santigrat dereceye ısıtın.

Arteriyel parçaları içeren kültür tüpünü dört santigrat dereceden çıkarın ve enzim çözeltisi 37 santigrat dereceye kadar ısınırken ısınması için oda sıcaklığına yerleştirin. Şimdi oda sıcaklığındaki diseksiyon tamponunu kültür tüpünden dikkatlice aspire edin ve damar segmentlerini içeren küçük bir hacim bırakın. Şimdi yavaş yavaş oda sıcaklığında, enzimler içermeyen ayrışma tamponunu damar segmentlerine ekleyin, böylece arteriyel parçalar kültür tüpünün dibinde kalacak ve kalan diseksiyon tamponunu yıkayın.

Enzim çözeltisi 37 santigrat dereceye ulaştığında, damar segmentlerini içeren kültür tüpünden ayrışma tamponunu tekrar aspire edin ve damar segmentlerini içeren küçük bir hacim bırakın. Şimdi 37 derecelik enzim çözeltisini kültür tüpüne aktarın ve kültür tüpünü ısıtma bloğunda 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında, mineral yağ ile doldurulmuş bir literasyon pipeti hazırlayın, pipeti çizin, temiz bir mola verin, pipeti forseps ateşiyle kırın, pipetin ucunu parlatın ve bir mikro manipülatöre monte edilmiş bir mikro şırınga üzerine sabitleyin.

Ardından, pipeti iki nanolitre ayrışma tamponu ile doldurmak için mikro şırınga pistonunu geri çekin ve pipet ucunu inkübasyonun sonundaki akış odasının üzerine yerleştirin. Tamponu az önce gösterildiği gibi dikkatlice aspire ettikten sonra, arteriyel segmentleri dört mililitre oda sıcaklığında ayrışma tamponu ile yıkayın. Daha sonra, bir mililitrelik mikro pipetle bir kap segmentini nazikçe aspire edin ve kabı bir mililitre ayrışma tamponu ile bir akış odasına yerleştirin.

Tasyon pipetinin ucunu damar segmentinin bir ucuna yakın bir yere yerleştirin ve ardından damar segmentini saniyede yaklaşık 225 nanolitre hızla tasyon pipetine aspire edin, böylece endotel hücrelerinde mekanik zorlanmaya neden olmaz, kabı hazneye geri çıkarın. Sindirim başarılı olursa, düz kas hücreleri ve adventiti endotel tüpünden ayrılacaktır. Tüpün dolanmasını önlemek için adventitia'yı endotel tüpünden mümkün olan en kısa sürede uzaklaştırın ve ardından tüm düz kas hücreleri ayrışana kadar tasyonu gösterildiği gibi tekrarlayın.

Son yinelemeden sonra, ASEE ve izole edilmiş endotel tüpünü akış odasının ortasına yerleştirdi, akış yönü boyunca hizaladı ve tetikleme pipetini çıkardı. Sabitleme pipetlerini akış odasının her iki ucuna monte edilmiş mikro manipülatörlere sabitleyin ve ardından uçlarını endotel tüpünün ilgili uçlarına yerleştirin. Sabitleme pipetlerini, tüpün her iki ucundan yaklaşık 50 mikrometre uzakta, tüpün dibine doğru bastırarak, tüpün zıt uçlarının üzerine birer birer indirin.

Sabitleme pipeti tüpe temas ettiği gibi, tüpün ekseni boyunca yavaşça geri çekin ve yaklaşık in vivo uzunluğuna kadar uzatın. Tüpü sabitlemek için pipeti haznenin tabanına doğru bastırın ve ardından süperfüzyon solüsyonunun endotel tüpü boyunca sabit bir akışını sağlamak için peristaltik bir pompa kullanarak süperfüzyon solüsyonunun akışına başlayın. Bu diferansiyel girişim kontrast görüntüsünde, bir SEA'dan izole edilmiş bir endotel hücre tüpü, oda sıcaklığında dakikada üç mililitrede süperfüzyon tamponu ile bir saatlik bir süperfüzyon gösterilmiştir.

Bu film, bir mikromolar asetilkolin stimülasyonuna yanıt olarak bir grip oh dört yüklü endotel hücre tüpünün kalsiyum tepkilerini göstermektedir. Bu temsili floresan görüntüler, asetilkolin ile endotel tüpü stimülasyonundan sonra çeşitli zaman noktalarında toplandı. Hücre içi kalsiyumun zamanla nasıl salındığına dikkat edin.

Bu prosedürü denerken, endotel hücreleri son derece hassas olduğundan ve kolayca hasar gördüğünden, tri konumlandırma ve sabitleme sırasında endotel tüpüne mekanik olarak zarar vermekten kaçınmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, endotel tüplerini farenin üstün epigastrik arterinden nasıl izole edeceğiniz konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız ve böylece doğal sağlam mikrovasküler endotelyumu incelemelisiniz.