İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin İnsan Solunum Sinsityal Virüs Enfeksiyonuna İmmün Tepkilerini İncelemek İçin Bir İn vitro Model

Bu prosedürün genel amacı, insan bağışıklık hücrelerinin respiratuar sinsityal virüs veya RSV enfeksiyonuna verdiği yanıtı incelemektir. Bu işlem, öncelikle helo hücrelerinde enfeksiyöz bir RSV stokunun kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, kültüre edilen RSV stoğu ultrasantrifüjasyon ile saflaştırılır.

Ardından, primer insan kan bağışıklık hücreleri yoğunluk gradyanlı santrifüj ile izole edilir. Son adımda, izole edilen bağışıklık hücreleri virüs ile stimüle edilir. Nihayetinde, RSV enfeksiyonuna karşı gelişen hücresel bağışıklık yanıtı ELISA, qPCR veya akış sitometrisi ile değerlendirilebilir.

Bu teknik, respiratuar sinsitial virüs enfeksiyonlarını incelemek için değerli bir katkıdır. RSV, insanlara karşı oldukça yüksek bir adaptasyon yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, virüsün patogenezinde rol oynayan enflamatuar yolları incelemek için insan immün hücrelerinin kullanılması önemlidir.

Bu videoda kullanılan virüs RSV olsa da, bu yöntem influenza virüsü veya rinovirüs gibi diğer virüslerin çalışılması için de kolayca uyarlanabilir. Bir tüp insan RSV stok çözeltisini 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtarak başlayın. Virüs çözündüğünde, stoğu her flask için 4 mL'lik enfeksiyon ortamı alikotlarında seyreltin.

MOI değerini 0,1 veya daha düşük tutarak, hücrelerin kurumasına neden olmayacak mümkün olan en düşük toplam hacimde virüsü heli hücrelerine ekleyin. Ardından, besiyerini yeniden dağıtmak için flaskı her 15 dakikada bir çalkalayarak kültürleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında iki ila dört saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, inokülumu uzaklaştırın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.

Ardından flasklara 15 mililitre kültür ortamı ekleyin ve aynı kültür koşulları altında üç ila beş gün boyunca inkübe edin. Virüsle indüklenen sitopatolojik değişiklikler için hücreleri her gün bir kez normal aydınlık alan mikroskobu altında gözlemleyin. Bu değişiklikler gözlemlendiğinde, RSV'yi hasat etmek için hücreleri sıyırın ve ardından süspansiyonu steril bir 50 mililitre tüpe toplayın, hücreleri vorteksleyin ve ardından hücre kalıntılarını çöktürmek için oda sıcaklığında 1800 Gs'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

RSV bu hızda çökelmez ve bu nedenle süpernatan, bir mililitrelik ekim stoku olarak minus 80 degrees Celsius'ta saklanabilir. Gelecekteki kullanımlar için hazırlanan alikotlar, enfeksiyöz virüs partiküllerinin kaybını önlemek amacıyla RSV ve sıvı azot ile her zaman şok dondurulur. RSV'yi saflaştırmak için işleme, bir ultracentrifuge'in her kovasına steril bir santrifüj tüpü yerleştirerek başlayın.

Ardından, her tüpün altına taze hazırlanmış filtre sterilizasyonlu sükroz çözeltisinden beş mililitre ekleyin. Daha sonra, sükroz çözeltisini bozmamaya ve katmanların belirgin kalmasına dikkat ederek, sükroz çözeltisinin üzerine çok yavaş bir şekilde 30 mililitre RSV çözeltisi ekleyin. Ardından, steriliteyi korumak için bir akışlı kabin içerisinde, kapaklar dahil olmak üzere altı ultrasantrifüj kovasını steril PBS ile birbirine 0,1 gram toleransla dikkatlice dengeleyin. Virüsü 20.000 RCF ve dört santigrat derecede 1,5 saat boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işlemi tamamlandığında, santrifüj tüplerini sepetlerden dikkatlice çıkarmak için steril bir pens kullanın. Virüs partikülleri, bir pelet oluşturmak üzere sükroz tabakasından geçmiş olacaktır. Santrifüj tüplerini bir viral atık şişesine boşaltın ve tüpün steril bir yüzey üzerinde baş aşağı durarak süzülmesini sağlayın.

Çökeleğin tamamen kurumasını önleyin. Ardından, bir mililitre HPSS'yi dikkatlice çökeleğin üzerinden geçirin ve HPSS'yi boşaltmak için santrifüj tüpünü tekrar eğin. Sonrasında, çökeleğin kurumamasına dikkat ederek tüpü yeniden ters çevirin.

Şimdi, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek peleti başka bir mililitre HBSS içinde 40 kez yeniden süspande edin; çünkü kabarcık oluşumu virüse zarar verebilir. Ardından, virüs alikotlarını sıvı azot içerisinde hızlıca dondurun. Virüsü, kantifikasyon ve ilerideki kullanımlara kadar -80 °C'de saklayın. Sağlıklı gönüllülerden 10 mililitrelik EDTA tüplerine kan aldıktan sonra, kanı oda sıcaklığındaki PBS ile 50 mililitrelik bir tüp içerisinde maksimum 35 mililitre dilüe kan elde edene kadar iki kata kadar seyreltin.

Ardından, steril bir luer lock iğneyi steril 50 mililitrelik bir şırıngaya takın ve ardından şırıngaya yoğunluk gradyanı medyumu aspire edin. İğneyi seyreltilmiş kan tüpünün tabanına yerleştirin ve yoğunluk gradyanı ile kan arasında temiz bir ayrım çizgisini koruyarak, kanın altına dikkatlice 15 mililitre yoğunluk gradyanı medyumu pipetleyin. Şimdi hücreleri, oda sıcaklığında, maksimum ivmelenme ve frenleme ile 800 GS'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Ayrıştırmanın ardından, eritrositler tüpün tabanındaki pelet içerisinde, üstlerinde ise nötrofillerin oluşturduğu gümüşümsü bir tabaka ile birlikte bulunur.

Pelletin üzerindeki berrak katman yoğunluk gradyanı ortamını içerir ve yoğunluk gradyanı ortamı ile en üstteki kan plazma katmanı arasındaki ince katman PBMC'leri içerir. PBMC'leri dikkatlice toplamak için pastör pipeti kullanın, ardından hücreleri buz üzerinde yeni bir 50 mililitre tüpe aktarın. Hacim 50 mililitre olacak şekilde buz gibi soğuk PBS ekleyin ve santrifüj işlemi tamamlandığında hücreleri pelletleyin.

Süpernatantı aspire edin ve peleti 50 mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın; ikinci yıkamadan sonra, pelete bir mililitre buz gibi soğuk besiyeri ekleyin, hücreleri sayın ve hücre konsantrasyonunu mililitre başına beş x 10⁶ pbmc olacak şekilde ayarlayın. pbmc'leri canlı RSV ile stimüle etmek için öncelikle, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakadaki her kuyucuğa 100 mikrolitre pbmc ekleyin. Ardından, her birine taze olarak dilüe edilmiş iki stimülan maddeden 50 mikrolitre ekleyin.

Plakayı 24 saat boyunca 37 °C'de ve %5CO2 ortamında inkübe edin, ardından plağı santrifüjleyip süpernatantı daha sonra Eliza ile analiz etmek üzere toplayın. Peletteki stimüle edilmiş pbmc'ler qPCR ile analiz edilebilir veya akış sitometrisi için boyanabilir. A-P-B-M-C stimülasyon deneyi gerçekleştirirken, bu yöntemle stimüli fraksiyon yöntemi önerilmektedir.

Koşullar, RPMI veya insan RSV gibi standart stimülasyon koşulları ile mial, dipeptit veya LPS gibi test fraksiyonu koşulları olarak ikiye ayrılır. Önemli bir nokta olarak, her deneye RPMI tek başına gibi bir negatif kontrol ve LPS gibi bir pozitif kontrol her zaman dahil edilir; RSV ile 24 saatlik stimülasyondan sonra farklı PBMC popülasyonları doz bağımlı bir enfeksiyon oranı ve RSV enfeksiyon verimliliğinde farklılık gösterir. Virüs ile 24 saatlik stimülasyon sonrası, TNF alfa veya interferon gama ekspresyonu için PBMC'lerin qPCR R analizi, RSV'nin bu iki inflamatuar sitokinin transkripsiyonunda güçlü bir yukarı regülasyonu indüklediğini göstermektedir. Aksine, miam dipeptit veya LPS ile stimülasyon sadece zayıf bir mRNA ekspresyonu ile sonuçlanır.

P BMC'ler hem RSV ve MIAL dipeptidi ile birlikte stimüle edildiklerinde, güçlü bir sinerjik yukarı regülasyon gözlemlenir. Stimüle edilen pbmc'lerin TNF Alfa veya İnterferon gama üretimleri Eliza ile analiz edilmiştir. Transkripsiyonel düzeydeki gözlemlerin aksine, RSV, p BMC'ler tarafından TNF alfa ve interferon gama protein sekresyonunun zayıf bir indükleyicisidir; miam dipeptidi ile stimülasyon ise düşük miktarlarda TNF alfa üretimi ve hiç interferon gama üretimi ile sonuçlanır.

Transkripsiyonel analizlerle benzer şekilde, sitokin indüksiyonunun RSV replikasyonuna bağlı olup olmadığını görmek için kontrol olarak RSV ve MIAM dideptidi ile birlikte stimüle edildiklerinde, hem TNF alpha hem de interferon gamma sinerjik bir yukarı düzenleme göstermektedir. P BMC'ler, grafiklerde gösterildiği üzere canlı veya beta propal lakton ile inaktive edilmiş RSV ile stimüle edilmiştir; hem canlı hem de inaktive edilmiş RSV proinflamatuar sitokin üretimini indüklemiştir. RSV ile yapılan deneylerin, biyogüvenlik seviyesi 2 bir laboratuvarda, biyolojik güvenlik kabini içerisinde gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.

Ayrıca, bu yöntemi denerken tüm prosedür boyunca endotoksin içermeyen reaktifler ve malzemeler kullanmayı hatırlamak kritik önem taşır. Bu videoyu izledikten sonra, insan pbmc'lerinin RSV ile nasıl stimüle edileceği ve immün yanıtı analiz etmek için kullanılabilecek çeşitli analizler hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.I.