Name: İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin İnsan Solunum Sinsityal Virüs Enfeksiyonuna İmmün Tepkilerini İncelemek İçin Bir İn vitro Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Keşfedin, insan periferik kan mononükleer hücrelerinin solunum sinsityal virüs enfeksiyonuna immün tepkilerini in vitro modelde nasıl analiz edildiğini. Bu yöntem, viral patogenezdeki inflamatuar yolakları anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RSV A2, Dr. R. de Swart (Erasmus MC, Rotterdam, Hollanda) tarafından nazikçe sağlanmıştır. MV ve GF, Hollanda hükümetinin FES0908 numaralı projesi tarafından finanse edilen Virgo konsorsiyumu ve 050-060-452 numaralı Hollanda Genomik Girişimi (NGI) proje numarası tarafından desteklenmektedir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Not:
HRSV ile yapılan deneyler, biyogüvenlik seviyesi 2 olan bir laboratuvarda, biyolojik güvenlik kabini içerisinde gerçekleştirilmelidir. Biyolojik tehlikeler nedeniyle, tüm viral atıklar ve virüsle temas etmiş materyaller uygun şekilde bertaraf edilmek üzere toplayınız.
Potansiyel olarak enfekte insan kanı kullanılırken özel önlemler alınmalıdır.
Tüm protokoller boyunca endotoksin içermeyen reaktiflerin kullanılması kritik önem taşımaktadır.
1. HRSV A2 Kültürleme
<ol>
	<li>HeLa veya HEp-2 hücrelerini, yaklaşık %50 konfluense ulaşana kadar 175 cm2 kültür flaskında DMEM medyum + %10 fetal calf serum (FCS) + %1 penisilin/streptomisin (P/S) içerisinde kültürleyin.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığındaki fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>HRSV ekim stok virüsü içeren bir viyali 37 °C'lik su banyosunda çözdürün. MOI'yi 0,1 veya altında tutacak şekilde virüs stoğunu seyreltin. Bu işlem, defektif interferans parçacıklarının (DIPs) oluşumunu önleyecektir. Virüs stoğunu flask başına 4 ml enfeksiyon medyumunda (DMEM + %1 P/S) seyreltin ve HeLa veya HEp-2 hücrelerine ekleyin. Hücrelerin kurumasına neden olmayacak şekilde bu hacmi mümkün olduğunca düşük tutun. Hacim ne kadar düşük olursa enfeksiyon oranı o kadar yüksek olacaktır.</li>
	<li>37 °C'de, %5 CO2 ortamında 2-4 saat inkübe edin. Medyumu yeniden dağıtmak için flaskı her 15 dakikada bir çalkalayın.</li>
	<li>İnokülumu uzaklaştırın ve PBS ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>15 ml kültür medyumu (DMEM + %10FCS + %1 P/S) ekleyin ve 37 °C'de, %5 CO2 ortamında 3-5 gün inkübe edin. Hücreleri, virüs kaynaklı sitopatolojik değişiklikler, örneğin sinsitya oluşumu, ölüm ve yüzen hücreler açısından normal parlak alan mikroskobu ile gözlemleyin.</li>
	<li>Sitopatoloji ortaya çıktığında, hücreleri sıyırarak HRSV'yi hasat edin ve virüs süspansiyonunu steril 50 ml'lik bir tüpte toplayın. Hücre süspansiyonunu vorteksleyin. Hücrelerin sıyırılması ve vortekslemesi daha fazla viral parçacığın salınmasını sağlar.</li>
	<li>Hücre kalıntılarını çöktürmek için virüs süspansiyonunu oda sıcaklığında 1.800 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatandaki HRSV bu hızda çökelmez ve süpernatant, birden fazla 175 cm2 flaskı enfekte etmek için doğrudan kullanılabilir veya gelecekteki kullanımlar için 1 ml'lik alikotlar halinde -80 °C'de ekim stoğu olarak saklanabilir. Enfeksiyöz virüs parçacıklarının kaybını önlemek için HRSV'yi daima sıvı azot ile şok dondurun.</li>
	<li>Yukarıda belirtildiği gibi, yukarıdaki protokolle hazırlanan ekim stoğu birden fazla 175 cm2 kültür flaskını enfekte etmek için kullanılır. Purifikasyon için daha fazla virüs üretmek üzere aynı protokolü tekrarlayın. Bir ultrasantrifügasyon döngüsünde 180 ml'ye kadar virüs süspansiyonunu purifiye edin.</li>
	<li>Sitopatoloji ortaya çıktığında, hücreleri sıyırarak HRSV'yi hasat edin ve süpernatantı toplayın. Virüs süspansiyonunu vorteksleyin. Hücre kalıntılarını çöktürmek için oda sıcaklığında 1.800 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatandaki HRSV bu hızda çökelmez ve süpernatant, 50 ml'lik tüplere 15 ml şeklinde alikotlanır. Şok dondurun ve purifikasyona kadar -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>
2. HRSV'nin Saflaştırılması
Not: Bir ultrasantrifüj kullanmadan önce, bunun potansiyel olarak tehlikeli bir ekipman olduğunun farkında olun. Kullanım kılavuzlarını okuyun ve ilk ultrasantrifüjleme işlemini deneyimli birinin gözetimi altında gerçekleştirin.
<ol>
	<li>Ultrasantrifüj kovalarını %70 etanol ile temizleyin ve biyolojik güvenlik kabininde kurumaya bırakın.</li>
	<li>Her kovaya steril bir santrifüj tüpü yerleştirin.</li>
	<li>PBS çözeltisi içinde %30 (w/v) sükroz hazırlayın, filtre sterilizasyonundan geçirin (0,2 μm filtre) ve her santrifüj tüpünün dibine 5 ml ekleyin. Daha hızlı bir protokol için, sükroz çözeltili tüpler dondurulabilir. Steril olduklarından emin olun.</li>
	<li>Sükroz çözeltisi dondurulmadıysa, bu sükroz çözeltisinin üzerine 30 ml HRSV çözeltisini çok dikkatli bir şekilde ekleyin. Sükroz çözeltisini bozmamak için yavaşça pipetleyin. Net bir ayrım çizgisi koruyun. Tüpler dondurulduysa, viral süspansiyonu donmuş sükroz çözeltisinin üzerine dökün ve ardından çözünmeye bırakın.</li>
	<li>Altı ultrasantrifüj kovasını steril PBS ile çok dikkatli bir şekilde dengeleyin. Her şeyi steril tutmak için teraziyi bir akış kabinine yerleştirin. Tüpleri kenarın 3-5 mm altına kadar doldurun, aksi takdirde santrifüj tüpleri çökebilir. Kovaları 0,1 g hassasiyetle dengeleyin ve kapakların mükemmel şekilde eşleşmeme ihtimaline karşı vidalı kapağı da dahil edin.</li>
	<li>Ultrasantrifüjde 1,5 saat boyunca, 4 °C'de 20.000 rcf'de santrifüjleyin.</li>
	<li>Santrifüj tüpünü steril pensler kullanarak kovadan dikkatlice çıkarın. Virüs partikülleri sükroz tabakasından geçmiş olacak ve bir pelet oluşturacaktır. Buna karşılık, hücre tarafından salgılanan çözünür faktörler (örneğin sitokinler) çözelti içinde kalacaktır. Tüm sıvıyı boşaltmak için santrifüj tüpünü eğin. Kuruması için steril bir yüzey üzerine, örneğin bir kültür plağına ters şekilde bırakın ancak peletin tamamen kurumasını önleyin.</li>
	<li>Pelete dikkatlice 1 ml Hank's Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ekleyin ve HBSS'yi boşaltmak için santrifüj tüpünü eğin. Tüpü tekrar steril bir yüzey üzerinde ters şekilde kurumaya bırakın. Peletin tamamen kurumasını önleyin.</li>
	<li>Peleti 1 ml HBSS içinde 40 kez yukarı-aşağı pipetleyerek yeniden süspande edin. Virüsü yok edebileceği için hava kabarcığı oluşumunu önlemeye çalışın.</li>
	<li>Virüsü alikotlayın, sıvı azot içinde şok dondurun ve daha sonra kullanana kadar -80 °C'de saklayın. Tekrarlanan dondurma-çözme işlemleri enfeksiyöz titreyi düşüreceği için her deneyde yeni bir virüs alikotu kullanın. Çözerken, HRSV -20 ve 15 °C arasında daha az stabil olduğundan, virüsü her zaman 37 °C'de çözün.</li>
</ol>
3. HRSV'nin Nicelemesi
Not: Verilerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için nicelleştirmeyi en az 3 kez duble olarak tekrarlayın.
3.1. A549 hücrelerinin enfeksiyonu
<ol>
	<li>A549 hücrelerini 24 kuyucuklu plakada konfluens olana kadar kültüre edin.</li>
	<li>A549 hücrelerini oda sıcaklığında 1 ml PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Reduced Serum Medium içerisinde HRSV'nin 5 katlı seri dilüsyonlarını hazırlayın. Her iki kuyucuğa 100 μl dilüye edilmiş virüs ekleyin. En az 4 dilüsyon yapın (örneğin 4, 20, 100 ve 500 kat). İzotip kontrolü için kullanılacak, en yüksek dozda virüs ile enfekte edilmiş iki ekstra kuyucuk ve iki adet yalancı (mock) enfekte kuyucuk ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri %5 CO2, 37 °C'de 2 saat boyunca inkübe edin. Kurumayı önlemek için 24 kuyucuklu plakaları her 15 dakikada bir sallayın.</li>
	<li>Virüs süspansiyonunu uzaklaştırın ve hücreleri oda sıcaklığında 1 ml PBS ile 1 kez yıkayın.</li>
	<li>Reduced Serum Medium içerisinde %4 (w/v) sığır serum albümini (BSA) hazırlayın. Filtre sterilizasyonu (0,2 μm filtre) yapın ve her kuyucuğa 500 μl ekleyin.</li>
	<li>%5 CO2, 37 °C'de 22 saat boyunca inkübe edin.</li>
</ol>
3.2. FACS için Hazırlık
<ol>
	<li>Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri bir kez 1 ml oda sıcaklığında PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Her kuyucuğa 200 μl önceden ısıtılmış trypsin (37 °C) ekleyin ve 37 °C, %5 CO2 ortamında 10 dk inkube edin.</li>
	<li>Hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını mikroskop altında kontrol edin. Hücreler ayrıldıysa, trypsin'i nötralize etmek için 800 μl DMEM + %10 FCS + %1 P/S ekleyin. Hücreleri yeniden süspande edin.</li>
	<li>Hücreleri konik, doku kültürü işlem görmemiş 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Oda sıcaklığında 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Peletleri 200 μl soğuk PBS içinde yeniden süspande edin.</li>
	<li>4 °C'de 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve 200 μl soğuk PBS içinde yeniden süspande edin.</li>
	<li>4 °C'de 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve 150 μl %80 buz gibi soğuk aseton içinde yeniden süspande edin.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 15 dk fiksasyon işlemine tabi tutun.</li>
	<li>4 °C'de 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve 200 μl soğuk PBS + %0,1 BSA içinde yeniden süspande edin.</li>
	<li>4 °C'de 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve 50 μl anti-NP-RSV-FITC (PBS + %1 BSA içinde 1:50 seyreltilmiş) veya 50 μl IgG2 anti mouse-FITC (bu bir izotip kontrolüdür; bu nedenle aynı antikor konsantrasyonunu kullanın) içinde yeniden süspande edin.</li>
	<li>Protokolün geri kalanı boyunca tüpleri karanlıkta tutun. 4 °C'de en az 1 saat inkube edin; bu süre gece boyuna kadar uzatılabilir.</li>
	<li>150 μl soğuk PBS + %0,1 BSA ekleyin.</li>
	<li>4 °C'de 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve 200 μl soğuk PBS + %0,1 BSA içinde yeniden süspande edin.</li>
	<li>4 °C'de 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve 200 μl soğuk PBS + %0,1 BSA içinde yeniden süspande edin. Plaka, FACS ölçümüne kadar buz üzerinde ve karanlıkta tutulmalıdır.</li>
	<li>Enfekte hücreleri bir akış sitometresinde ölçün.</li>
</ol>
3.3. FITC-50 hesaplaması
<ol>
	<li>Negatif kontrolü (izotip kontrolü) kullanarak eşik değerini belirlemek için bir akış sitometrisi analiz programı kullanın. Pseudocolor grafik tipini seçin. Pozitif hücrelerin Q3 alanında yer aldığı bir kuadrant kapısı (quadrant gate) çizin. Her iki izotip kontrolünde de yanlış pozitiflerin yüzdesi %0,2'nin altında olmalıdır.</li>
	<li>Verileri bir hesap tablosu programına aktarın ve her dilüsyon için FITC+ hücrelerin yüzdesini içeren bir tablo hazırlayın. Her deney için her değerden, izotip kontrolü ile belirlenen yanlış pozitiflerin ortalama değerini çıkarın.</li>
	<li>Bir istatistik programında yeni bir dosya (XY scatter, Single X and multiple Y columns) açın. Verileri bu programa kopyalayın: X = dilüsyon, Y = % enfekte hücreler, n = 3; her dilüsyon için iki ölçümün ortalamasını kullanın. Doğrusal olmayan regresyon, tek fazlı eksponansiyel azalma (one-phase exponential decay) istatistiksel analizi gerçekleştirin. Eğrinin veri noktalarına uyup uymadığını kontrol edin; uymuyorsa farklı bir istatistiksel analiz seçin.</li>
	<li>Eğriye ait denklemi ve denklem değerlerini bir hesap tablosu programına kopyalayın. Y = %50 için X değerini hesaplayın. Buna göre, %50 enfeksiyonun gerçekleştiği dilüsyondaki FITC ile tespit edilen Enfeksiyöz Partikül/ml (FIP/ml) değerini aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplayarak FITC-50 değerini belirleyin: 
	<img alt="FITC50 hesaplama formülü; floresans yoğunluğu ölçüm denklemini gösteren diyagram." fo:src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Denklem 1"> 
	A = kuyuk başına ortalama A549 hücresi sayısı 
	B = enfeksiyon için kuyuk başına kullanılan μl virüs 
	C = %50 enfeksiyonun gerçekleştiği dilüsyon</li>
</ol>
4. Sağlıklı Gönüllü Kanından Periferik Kan Mononükleer Hücre (PBMC) İzolasyonu
<ol>
	<li>Bilgilendirilmiş onamyla sağlıklı gönüllülerden 10 ml'lik EDTA tüplerine venöz kan alın. 10 ml kan hacmi yaklaşık 107 PBMC sağlayacaktır.</li>
	<li>Bundan sonraki aşamalarda, steril bir laminar akış kabininde çalışın.</li>
	<li>Kanı, 50 ml'lik bir tüpte oda sıcaklığındaki PBS ile 2 kat seyreltin. 50 ml'lik tüp başına maksimum 35 ml seyreltilmiş kan toplam hacmi kullanılabilir.</li>
	<li>50 ml'lik steril bir şırınga alın ve sterilize edilmiş bir Luer lock iğne takın. Şırıngaya yoğunluk gradyanı medyumu çekin. İğneyi, seyreltilmiş kan bulunan tüpün tabanına yerleştirin ve 15 ml yoğunluk gradyanı medyumunu seyreltilmiş kanın altına dikkatlice pipetleyin. Yoğunluk gradyanı medyumu ile kan arasında net bir sınır olduğundan emin olun.</li>
	<li>Oda sıcaklığında, 800 x g hızda, 9 (maksimum) hızlanma ile ve fren kapalı şekilde 20 dakika santrifüjleyin. Kullanımdan sonra santrifüj sıcaklığını 4 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu sonucunda birden fazla katman oluşacaktır. Tabanda, üzerinde nötrofilleri içeren gümüşümsü bir katmanla birlikte eritrositlerden oluşan bir pelet bulunur. Bu peletin üzerindeki berrak katman, yoğunluk gradyanı medyumunu içerir. Yoğunluk gradyanı medyumu ile üstteki kan plazma katmanı arasındaki ince katman ise PBMC'leri içerir.</li>
	<li>PBMC'leri bir Pasteur pipetiyle dikkatlice toplayın ve hücreleri yeni bir 50 ml'lik tüpe aktarın. Bundan sonra PBMC'leri buz üzerinde tutun ve buz gibi soğuk PBS kullanın. Hacim 50 ml olana kadar buz gibi soğuk PBS ekleyin ve 4 °C'de, 400 x g hızda 10 dakika santrifüjleyin (fren 9'a ayarlı).</li>
	<li>Süpernatantı aspirasyon yoluyla atın, peleti 50 ml buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspande edin ve 4 °C'de, 400 x g hızda 10 dakika santrifüjleyin; bu işlemi 2 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Süpernatantı attıktan sonra, 1 ml buz gibi soğuk medyum (RPMI + %1 P/S) ekleyin ve hücreleri bir sayım odası kullanarak sayın.</li>
	<li>Hücre konsantrasyonunu 5 x 106 PBMC/ml olacak şekilde ayarlayın.</li>
</ol>
5. PBMC'lerin Canlı HRSV ile Stimülasyonu
<ol>
	<li>Deney düzeneğini hazırlayın; her koşul için deneysel tekrarlar ekleyin.</li>
	<li>Gerekli tüm stimülanları besiyeri (RPMI + %1 P/S) ile seyreltin. Kuyucuk başına nihai hacmin 200 μl olacağını unutmayın. 50 μl stimülan ekleneceği için 4x konsantrasyonunda stimülasyon stokları hazırlayın.</li>
	<li>Yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa, yukarıda belirtilen hücre süspansiyonundan 100 μl ekleyin (kuyucuk başına 5 x 105 PBMC).</li>
	<li>Her kuyucuğa 50 μl seyreltilmiş stimülan ekleyin. Toplam hacmi 200 μl yapacak şekilde iki farklı stimülan eklemek mümkündür. Yalnızca tek bir stimülan gerekiyorsa, hacmi besiyeri ile 200 μl'ye tamamlayın.</li>
	<li>96 kuyucuklu plakayı, %5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 °C'de gerekli inkübasyon süresi boyunca bekletin. Çoğu sitokin için 24 saatlik inkübasyon yeterli olacaktır.</li>
</ol>
6. Stimülasyonun Okunması
<ol>
	<li>İnkübasyon süresinin ardından, hücreleri tabana çöktürmek için 96 kuyucuklu plakayı oda sıcaklığında 450 x g hızında 5 dk boyunca santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı toplayın (maksimum 180 μl hacminde alın) ve sonraki sitokin analizi (-20 °C) veya virüs üretimi (-80 °C) için saklayın.</li>
	<li>Pellette bulunan stimüle edilmiş PBK'lar, lizis tamponu eklenerek qPCR/Western blot ile analiz edilebilir veya alternatif olarak, akış sitometrisi analizi için boyanabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Nair, H., Nokes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet. 375, 1545-1555 (2010).</li>
<li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+in+elderly+and+high-risk+adults%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection in elderly and high-risk adults.</a> N. Eng. J. Med. , 352-1749 (2005).</li>
<li>Openshaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+Immune+Responses+and+Lung+Inflammation+after+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Antiviral Immune Responses and Lung Inflammation after Respiratory Syncytial Virus Infection.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (2), 121-125 (2005).</li>
<li>Openshaw, P. J., Tregoning, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+and+disease+enhancement+during+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbio.+Rev%22%5BJournal%5D)">Immune responses and disease enhancement during respiratory syncytial virus infection.</a> Clin. Microbio. Rev. 18 (3), 541-555 (2005).</li>
<li>Villenave, R., Thavagnanam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+respiratory+syncytial+virus+infection+of+pediatric+bronchial+epithelium%2C+the+primary+target+of+infection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of respiratory syncytial virus infection of pediatric bronchial epithelium, the primary target of infection in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 5040-5045 (2012).</li>
<li>Tulic, M. K., Hurrelbrink, R. J., Prêle, C. M., Laing, I. A., Upham, J. W., Le Souef, P., Sly, P. D., Holt, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR4+polymorphisms+mediate+impaired+responses+to+respiratory+syncytial+virus+and+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR4 polymorphisms mediate impaired responses to respiratory syncytial virus and lipopolysaccharide.</a> J. Immunol. 179 (1), 132-140 (2007).</li>
<li>Vissers, M., Remijn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+augments+NOD2+signaling+in+an+IFN-%CE%B2-dependent+manner+in+human+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection augments NOD2 signaling in an IFN-β-dependent manner in human primary cells.</a> Eur. J. Immunol. 42 (10), 2727-2735 (2012).</li>
<li>Cherukuri, A., Patton, K., Gasser, R. A. Jr, Zuo, F., Woo, J., Esser, M. T., Tang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adults+65+years+old+and+older+have+reduced+number+of+functional+memory+T+cells+to+respiratory+syncytial+virus+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adults 65 years old and older have reduced number of functional memory T cells to respiratory syncytial virus fusion protein.</a> Clin. Vacc. Immunol. 20 (2), 239-247 (2013).</li>
<li>Shafique, M., Wilschut, J., de Haan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mucosal+and+systemic+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+by+inactivated+virus+supplemented+with+TLR9+and+NOD2+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Induction of mucosal and systemic immunity against respiratory syncytial virus by inactivated virus supplemented with TLR9 and NOD2 ligands.</a> Vaccine. 30, 597-606 (2012).</li>
<li>Kwilas, S., Liesman, R. M., Zhang, L., Walsh, E., Pickles, R. J., Peeples, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+grown+in+Vero+cells+contains+a+truncated+attachment+protein+that+alters+its+infectivity+and+dependence+on+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus grown in Vero cells contains a truncated attachment protein that alters its infectivity and dependence on glycosaminoglycans.</a> J. Virol. 83 (20), 10710-10718 (2009).</li>
<li>Treuhaft, M. W., Beem, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+interfering+particles+of+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Defective interfering particles of respiratory syncytial virus.</a> Infect. Immun. 37 (2), 439-444 (1982).</li>
<li>Korns Johnson, D., Homann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+and+improved+quantification+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29+titers+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Accelerated and improved quantification of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) titers by flow cytometry.</a> PLoS One. 7 (5), e37337(2012).</li>
<li>Wurfel, M. M., Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+high+and+low+responders+to+lipopolysaccharide+in+normal+subjects%3A+an+unbiased+approach+to+identify+modulators+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of high and low responders to lipopolysaccharide in normal subjects: an unbiased approach to identify modulators of innate immunity.</a> J. Immunol. 175 (4), 2570-2578 (2005).</li>
<li>Kimpen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+and+asthma.+The+role+of+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus and asthma. The role of monocytes.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 7-9 (2001).</li>
<li>Wang, S. Z., Forsyth, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+neutrophils+with+respiratory+epithelial+cells+in+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">The interaction of neutrophils with respiratory epithelial cells in viral infection.</a> Respirology. 5 (1), 1-10 (2000).</li>
<li>San-Juan-Vergara, H., Sampayo-Escobar, V., Reyes, N., Cha, B., Pacheco-Lugo, L., Wong, T., Peeples, M. E., Collins, P. L., Castano, M. E., Mohapatra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol-rich+microdomains+as+docking+platforms+for+respiratory+syncytial+virus+in+normal+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cholesterol-rich microdomains as docking platforms for respiratory syncytial virus in normal human bronchial epithelial cells.</a> J. Virol. 86 (3), 1832-1843 (2012).</li>
<li>Davidson, D., Zaytseva, A., Miskolci, V., Castro-Alcaraz, S., Vancurova, I., Patel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+endotoxin-stimulated+leukocytes+of+term+new+born%3A+control+of+cytokine+gene+expression+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of endotoxin-stimulated leukocytes of term new born: control of cytokine gene expression by interleukin-10.</a> Plos One. 8 (1), e53641(2013).</li>
</ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Bu çalışmada, PBMC'nin HRSV ile enfeksiyonunun, inflamatuar yolakların çalışılabileceği hızlı ve güvenilir bir model sistem olduğunu gösterdik. PBMC'leri teşvik etmek için bir HRSV stoğunun hazırlanması ve miktarının belirlenmesi gerekir.
Çoklu hücre hatları HRSV enfeksiyonuna duyarlıdır. HRSV kültürü için en çok kullanılan hücre hatları HEp-2, HeLa ve Vero hücreleridir. Bununla birlikte, HRSV'nin kültürlenmesi için Vero hücrelerinin kullanılmasını önermiyoruz çünkü Vero hücrelerinde HRSV'nin ...

Human Respiratory Syncytyal Virüs (HRSV), çocuklarda alt solunum yolu enfeksiyonlarının en sık nedenidir. Her yıl, beş yaşın altındaki 33 milyondan fazla çocuk HRSV ile enfekte olmakta ve bu da üç milyondan fazla hastaneye yatışa ve yaklaşık 200.000 ölüme yol açmaktadır1. Giderek artan sayıda kanıt, HRSV'nin altta yatan kronik hastalıkları olan yaşlılar ve yetişkinler için de önemli bir tehdit oluşturduğunu göstermektedir2.
Küçük çocuklarda HRSV enfeksiyonlarının çoğu, soğuk algınlığı ile karşılaştırılabilir hafif semptomlarla ortaya çıkar ve klinik müdahale gerektirmez. Bununla birlikte, hastaların küçük bir kısmı şiddetli bronşiolit nedeniyle hastaneye yatış ve mekanik ventilasyon gerektirir.
HRSV hastalığının patogenezinin bir kısmı, konakçının enfeksiyona karşı aşırı coşkulu ve yetersiz bağışıklık tepkisidir3,4. Bu, birkaç gözlemle gösterilmiştir. Maksimal hastalık periyodu genellikle viral enfeksiyonun zirvesinden önce gelir ve enfekte dokuların hücresel infiltrasyonu ve enflamatuar sitokinlerinsalınması ile daha iyi çakışır 3. Başka bir kanıt dizisi, 1960'larda formalin inaktive edilmiş HRSV (FI-RSV) denemelerinden geliyor. Aşı, küçük bebeklerde koruma sağlamak yerine, abartılı bir bağışıklık tepkisi ile sonuçlandı ve bu da solunum yolu hastalığının artmasına ve daha yüksek morbidite ve mortalite ile sonuçlandı.
HRSV enfeksiyonlarının patogenezini incelemek için çeşitli modeller geliştirilmiştir. HEp-2 ve A549 gibi sürekli hücre hatları, HRSV enfeksiyonunu in vitro olarak incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Epitel hücreleri, HRSV enfeksiyonunun5 birincil hedefleridir, bu nedenle bu hücre tiplerine çok fazla odaklanılmıştır. Bununla birlikte, in vivo durum çok daha karmaşıktır ve bir hücre tipi ile sınırlı değildir. Bu karmaşık etkileşimleri incelemek için, HRSV patogenezini incelemek için çeşitli hayvan enfeksiyon modelleri geliştirilmiştir. Şimdiye kadar, hem heterolog (insan olmayan) modellere hem de aynı kökenli konak-pnömovirüs modellerine odaklanan iki farklı strateji kullanılmıştır. HRSV için heterolog modellere örnek olarak şempanzeler, koyunlar, pamuk fareleri ve fareler verilebilir. Doğal konakçıda RSV enfeksiyonu, sığır RSV ve pnömovirüs kullanılarak sığırlarda ve farelerde incelenmiştir.
Bu modellerin her biri hastalık patogenezi hakkında önemli bilgiler sağlamış olsa da, HRSV insanlara yüksek oranda uyarlanmıştır. Bu nedenle, şu anda kullanılan hücre hatlarına ve hayvan modellerine ek olarak, insan birincil PBMC'lerini HRSV ile stimülasyon için bir model olarak kullanmayı öneriyoruz. İnsan PBMC'leri, küçük çocuklar6, bağışıklığı baskılanmış bireyler ve sağlıklı yetişkinler7 veya yaşlı bireyler8 dahil olmak üzere belirli araştırma sorularını ele almak için bir dizi kişiden elde edilebilir. PBMC'ler, enfeksiyonun doğuştan gelen yönlerini ve virüse adaptif yanıtı incelemek için kullanılabilir. HRSV hastalığının patogenezi için önemli olan aktive edilmiş inflamatuar yolaklar mRNA ve protein düzeyinde incelenebilir. Ayrıca, bağışıklık hücrelerinin (alt kümelerinin) viral enfeksiyonu akış sitometrisi ile belirlenebilir. Bu modeli daha önce HRSV enfeksiyonunun bakteriyel ligand muramil dipeptit (MDP) ile birlikte proinflamatuar sitokinlerin indüksiyonu üzerindeki sinerjik etkilerini belirlemek için kullandık7. HRSV hastalığının patogenezinde rol oynayan inflamatuar yolakları incelemek için insan primer PBMC'lerinin HRSV stimülasyonunu sağlam, kolay ve hızlı bir in vitro model olarak kullanmayı öneriyoruz.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Ca2+ Mg2+ veya fenol kırmızısı</td></tr><tr><td>olmayan PBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025-100</td><td>HBSS, Kalsiyum, Magnezyum, Fenol Kırmızısı</td></tr><tr><td>yok DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966-047</td><td>DMEM, Yüksek Glikoz, GlutaMAX, Pirüvat</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>72400054</td><td>RPMI 1640 Orta, GlutaMAX, HEPES</td></tr><tr><td>Azaltılmış Serum Ortamı (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>51985-026</td><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı, GlutaMAX</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td>FBS (Fetal Sığır Serumu)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Sığır serumundan albümin</td></tr><tr><td>P / S</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Penisilin-Streptomisin, sıvı</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>İnvitrojen</td><td>25300-054</td><td>%0.05 Tripsin-EDTA (1x), Fenol Kırmızı</td></tr><tr><td>HeLa hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>A549 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>Sükroz BioXtra, &; % 99,5</td></tr> <tr><td>IgG2 anti-fare-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555057</td><td>Ms IgG2b K FITC izotip kontrolü</td></tr><tr><td>Anti-NP-RSV-FITC</td><td>Abcam</td><td>ab25849</td><td>Anti-Solunum Sinsityal Virüs antikoru [671] (FITC)</td></tr> <tr><td>Yoğunluk gradyan ortamı (Lymphoprep)</td> <td>Eksen-Kalkan</td><td>1114545</td><td></td></tr><tr><td>EDTA tüpleri</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Merck Analiz</td><td></td> için <td></td></tr><tr>Millipore 1000141000 Aseton <td colspan="4"><güçlü>Malzeme </güçlü</td></tr><tr><td>>Santrifüj Tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>İnce Duvar, Poliallomer, 38,5 ml, 25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>SureSpin 630 Rotor, 36 ml kovalı Sorvall</td><td></td><td>79368</td><td>Sallanan kova titanyum rotor</td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultrasantrifüj</td><td>Sorvall</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>CB 150l CO2 İnkübatör</td><td>Bağlayıcı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan periferik kan mononükleer hücrelerinin İnsan solunum sinsityal virüs enfeksiyonuna İmmün tepkilerini İncelemek İçin bir İn vitro model

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

İnsan solunum sinsityal virüsü (HRSV) enfeksiyonları, hafif enfeksiyonlardan yaşamı tehdit eden bronşiolite kadar geniş bir hastalık şiddeti spektrumu sunar. Şiddetli hastalık patogenezinin önemli bir kısmı, immünopatolojiye yol açan artmış bir immün yanıttır.	Burada, insan bağışıklık hücrelerinin bir HRSV enfeksiyonuna karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için kullanılan bir protokolü açıklıyoruz. İlk olarak, HRSV'nin kültürlenmesi, saflaştırılması ve miktarının belirlenmesi için kullanılan yöntemleri açıklıyoruz. Daha sonra, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) canlı HRSV ile uyarıldığı bir insan in vitro modelini tarif ediyoruz. Bu model sistem, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkisi de dahil olmak üzere hastalık şiddetine katkıda bulunabilecek birden fazla parametreyi incelemek için kullanılabilir. Bu yanıtlar transkripsiyonel ve translasyonel düzeyde ölçülebilir. Ayrıca, hücrelerin viral enfeksiyonu, akış sitometrisi kullanılarak kolayca ölçülebilir. Birlikte ele alındığında, PBMC'nin canlı HRSV ile uyarılması, HRSV'nin neden olduğu hastalıkta yer alan mekanizmaları incelemek için hızlı ve tekrarlanabilir bir model sistem sağlar.

Burada açıklanan HRSV A2 kültürü ve saflaştırma yöntemi, ml başına 2 x 107 ile 2 x 108 arasında miktarlanan FITC-50 enfeksiyöz viral partikül verimi sağlayacaktır. FITC ile boyanmış enfekte hücrelerin sayıldığı mikroskobik analiz sonuçları (sonuçlar gösterilmemiştir), FACS ile yapılan miktar belirleme sonuçları ile karşılaştırılmıştır (Şekil 1). Her iki yöntem benzer titrelere yol açmış olsa da, FACS yöntemi farklı deneyler arasında çok daha düşük bir standart sapmaya sahipti ve dah...

İnsan solunum sinsityal virüsü (HRSV) küçük bebeklerde ciddi bronşiyolite neden olabilir. Şiddetli HRSV hastalığının patogenezinin bir kısmı, konakçı immün yanıtından kaynaklanır. Primer insan bağışıklık hücrelerinin HRSV ile uyarılması, enflamatuar yolların ve enfeksiyonun aktivasyonunu incelemek için hızlı ve tekrarlanabilir bir model sistem sağlar.

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin İnsan Solunum Sinsityal Virüs Enfeksiyonuna İmmün Tepkilerini İncelemek İçin Bir İn vitro Model

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Bu prosedürün genel amacı, insan bağışıklık hücrelerinin respiratuar sinsityal virüs veya RSV enfeksiyonuna verdiği yanıtı incelemektir. Bu işlem, öncelikle helo hücrelerinde enfeksiyöz bir RSV stokunun kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, kültüre edilen RSV stoğu ultrasantrifüjasyon ile saflaştırılır.Ardından, primer insan kan bağışıklık hücreleri yoğunluk gradyanlı santrifüj ile izole edilir. Son adımda, izole edilen bağışıklık hücreleri virüs ile stimüle edilir. Nihayetinde, RSV enfeksiyonuna karşı gelişen hücresel bağışıklık yanıtı ELISA, qPCR veya akış sitometrisi ile değerlendirilebilir.Bu teknik, respiratuar sinsitial virüs enfeksiyonlarını incelemek için değerli bir katkıdır. RSV, insanlara karşı oldukça yüksek bir adaptasyon yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, virüsün patogenezinde rol oynayan enflamatuar yolları incelemek için insan immün hücrelerinin kullanılması önemlidir.Bu videoda kullanılan virüs RSV olsa da, bu yöntem influenza virüsü veya rinovirüs gibi diğer virüslerin çalışılması için de kolayca uyarlanabilir. Bir tüp insan RSV stok çözeltisini 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtarak başlayın. Virüs çözündüğünde, stoğu her flask için 4 mL'lik enfeksiyon ortamı alikotlarında seyreltin.MOI değerini 0,1 veya daha düşük tutarak, hücrelerin kurumasına neden olmayacak mümkün olan en düşük toplam hacimde virüsü heli hücrelerine ekleyin. Ardından, besiyerini yeniden dağıtmak için flaskı her 15 dakikada bir çalkalayarak kültürleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında iki ila dört saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, inokülumu uzaklaştırın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.Ardından flasklara 15 mililitre kültür ortamı ekleyin ve aynı kültür koşulları altında üç ila beş gün boyunca inkübe edin. Virüsle indüklenen sitopatolojik değişiklikler için hücreleri her gün bir kez normal aydınlık alan mikroskobu altında gözlemleyin. Bu değişiklikler gözlemlendiğinde, RSV'yi hasat etmek için hücreleri sıyırın ve ardından süspansiyonu steril bir 50 mililitre tüpe toplayın, hücreleri vorteksleyin ve ardından hücre kalıntılarını çöktürmek için oda sıcaklığında 1800 Gs'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.RSV bu hızda çökelmez ve bu nedenle süpernatan, bir mililitrelik ekim stoku olarak minus 80 degrees Celsius'ta saklanabilir. Gelecekteki kullanımlar için hazırlanan alikotlar, enfeksiyöz virüs partiküllerinin kaybını önlemek amacıyla RSV ve sıvı azot ile her zaman şok dondurulur. RSV'yi saflaştırmak için işleme, bir ultracentrifuge'in her kovasına steril bir santrifüj tüpü yerleştirerek başlayın.Ardından, her tüpün altına taze hazırlanmış filtre sterilizasyonlu sükroz çözeltisinden beş mililitre ekleyin. Daha sonra, sükroz çözeltisini bozmamaya ve katmanların belirgin kalmasına dikkat ederek, sükroz çözeltisinin üzerine çok yavaş bir şekilde 30 mililitre RSV çözeltisi ekleyin. Ardından, steriliteyi korumak için bir akışlı kabin içerisinde, kapaklar dahil olmak üzere altı ultrasantrifüj kovasını steril PBS ile birbirine 0,1 gram toleransla dikkatlice dengeleyin. Virüsü 20.000 RCF ve dört santigrat derecede 1,5 saat boyunca santrifüjleyin.Santrifüj işlemi tamamlandığında, santrifüj tüplerini sepetlerden dikkatlice çıkarmak için steril bir pens kullanın. Virüs partikülleri, bir pelet oluşturmak üzere sükroz tabakasından geçmiş olacaktır. Santrifüj tüplerini bir viral atık şişesine boşaltın ve tüpün steril bir yüzey üzerinde baş aşağı durarak süzülmesini sağlayın.Çökeleğin tamamen kurumasını önleyin. Ardından, bir mililitre HPSS'yi dikkatlice çökeleğin üzerinden geçirin ve HPSS'yi boşaltmak için santrifüj tüpünü tekrar eğin. Sonrasında, çökeleğin kurumamasına dikkat ederek tüpü yeniden ters çevirin.Şimdi, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek peleti başka bir mililitre HBSS içinde 40 kez yeniden süspande edin; çünkü kabarcık oluşumu virüse zarar verebilir. Ardından, virüs alikotlarını sıvı azot içerisinde hızlıca dondurun. Virüsü, kantifikasyon ve ilerideki kullanımlara kadar -80 °C'de saklayın. Sağlıklı gönüllülerden 10 mililitrelik EDTA tüplerine kan aldıktan sonra, kanı oda sıcaklığındaki PBS ile 50 mililitrelik bir tüp içerisinde maksimum 35 mililitre dilüe kan elde edene kadar iki kata kadar seyreltin.Ardından, steril bir luer lock iğneyi steril 50 mililitrelik bir şırıngaya takın ve ardından şırıngaya yoğunluk gradyanı medyumu aspire edin. İğneyi seyreltilmiş kan tüpünün tabanına yerleştirin ve yoğunluk gradyanı ile kan arasında temiz bir ayrım çizgisini koruyarak, kanın altına dikkatlice 15 mililitre yoğunluk gradyanı medyumu pipetleyin. Şimdi hücreleri, oda sıcaklığında, maksimum ivmelenme ve frenleme ile 800 GS'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Ayrıştırmanın ardından, eritrositler tüpün tabanındaki pelet içerisinde, üstlerinde ise nötrofillerin oluşturduğu gümüşümsü bir tabaka ile birlikte bulunur.Pelletin üzerindeki berrak katman yoğunluk gradyanı ortamını içerir ve yoğunluk gradyanı ortamı ile en üstteki kan plazma katmanı arasındaki ince katman PBMC'leri içerir. PBMC'leri dikkatlice toplamak için pastör pipeti kullanın, ardından hücreleri buz üzerinde yeni bir 50 mililitre tüpe aktarın. Hacim 50 mililitre olacak şekilde buz gibi soğuk PBS ekleyin ve santrifüj işlemi tamamlandığında hücreleri pelletleyin.Süpernatantı aspire edin ve peleti 50 mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın; ikinci yıkamadan sonra, pelete bir mililitre buz gibi soğuk besiyeri ekleyin, hücreleri sayın ve hücre konsantrasyonunu mililitre başına beş x 10⁶ pbmc olacak şekilde ayarlayın. pbmc'leri canlı RSV ile stimüle etmek için öncelikle, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakadaki her kuyucuğa 100 mikrolitre pbmc ekleyin. Ardından, her birine taze olarak dilüe edilmiş iki stimülan maddeden 50 mikrolitre ekleyin.Plakayı 24 saat boyunca 37 °C'de ve %5CO2 ortamında inkübe edin, ardından plağı santrifüjleyip süpernatantı daha sonra Eliza ile analiz etmek üzere toplayın. Peletteki stimüle edilmiş pbmc'ler qPCR ile analiz edilebilir veya akış sitometrisi için boyanabilir. A-P-B-M-C stimülasyon deneyi gerçekleştirirken, bu yöntemle stimüli fraksiyon yöntemi önerilmektedir.Koşullar, RPMI veya insan RSV gibi standart stimülasyon koşulları ile mial, dipeptit veya LPS gibi test fraksiyonu koşulları olarak ikiye ayrılır. Önemli bir nokta olarak, her deneye RPMI tek başına gibi bir negatif kontrol ve LPS gibi bir pozitif kontrol her zaman dahil edilir; RSV ile 24 saatlik stimülasyondan sonra farklı PBMC popülasyonları doz bağımlı bir enfeksiyon oranı ve RSV enfeksiyon verimliliğinde farklılık gösterir. Virüs ile 24 saatlik stimülasyon sonrası, TNF alfa veya interferon gama ekspresyonu için PBMC'lerin qPCR R analizi, RSV'nin bu iki inflamatuar sitokinin transkripsiyonunda güçlü bir yukarı regülasyonu indüklediğini göstermektedir. Aksine, miam dipeptit veya LPS ile stimülasyon sadece zayıf bir mRNA ekspresyonu ile sonuçlanır.P BMC'ler hem RSV ve MIAL dipeptidi ile birlikte stimüle edildiklerinde, güçlü bir sinerjik yukarı regülasyon gözlemlenir. Stimüle edilen pbmc'lerin TNF Alfa veya İnterferon gama üretimleri Eliza ile analiz edilmiştir. Transkripsiyonel düzeydeki gözlemlerin aksine, RSV, p BMC'ler tarafından TNF alfa ve interferon gama protein sekresyonunun zayıf bir indükleyicisidir; miam dipeptidi ile stimülasyon ise düşük miktarlarda TNF alfa üretimi ve hiç interferon gama üretimi ile sonuçlanır.Transkripsiyonel analizlerle benzer şekilde, sitokin indüksiyonunun RSV replikasyonuna bağlı olup olmadığını görmek için kontrol olarak RSV ve MIAM dideptidi ile birlikte stimüle edildiklerinde, hem TNF alpha hem de interferon gamma sinerjik bir yukarı düzenleme göstermektedir. P BMC'ler, grafiklerde gösterildiği üzere canlı veya beta propal lakton ile inaktive edilmiş RSV ile stimüle edilmiştir; hem canlı hem de inaktive edilmiş RSV proinflamatuar sitokin üretimini indüklemiştir. RSV ile yapılan deneylerin, biyogüvenlik seviyesi 2 bir laboratuvarda, biyolojik güvenlik kabini içerisinde gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.Ayrıca, bu yöntemi denerken tüm prosedür boyunca endotoksin içermeyen reaktifler ve malzemeler kullanmayı hatırlamak kritik önem taşır. Bu videoyu izledikten sonra, insan pbmc'lerinin RSV ile nasıl stimüle edileceği ve immün yanıtı analiz etmek için kullanılabilecek çeşitli analizler hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.I.

an-vitro-model-to-study-immune-responses-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İnsan Solunum Sinsiyel Virüsü Enfeksiyonuna Karşı İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin Bağışıklık Tepkilerini Çalışmak İçin Bir In vitro Modeli

Bu yöntem EpiAirways, hava-sıvı arayüzü yetişen birincil insan solunum yolu epitel doku, biyolojik ilgili ko-kültür uzun bakteriyel...

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Bu video, tiplenemeyen Haemophilus influenzae (NTHi) yoluyla lenfositleri uyarmak ve bağışıklık tepkisini değerlendirmek için in vitro bir tekniği göstermektedir. İzole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) NTHi ile inkübe edilmesi, bakteri hücrelerinin T lenfositlerini uyarmasına neden olarak sitokin üretimine yol açar. Sitokinlerin sekresyonunu inhibe ettikten sonra, uyarılmış T lenfositlerinde biriken hücre içi sitokinleri tespit etmek için immünofloresan boyama yapılır.

Patojenik Bakteriler Yoluyla Lenfositleri Uyarmak için İn Vitro Teknik

Bu video, insan rahim mukozal dokusunun insan immün yetmezlik virüsü tip 1, HIV-1 ile ex vivo enfeksiyonunu ve bunların hava-sıvı arayüzünde jelatin süngerlerin üzerinde bakımını göstermektedir. Bu yöntem, insan dokularında HIV-1 replikasyonunun ve patogenezinin izlenmesine izin verir.

Ex Vivo Koşullarda HIV Patogenezini İncelemek için Bir İnsan Servikal Mukoza Enfeksiyonu Modeli

Bu video, respiratuar sinsityal virüse (RSV) karşı nötralize edici antikorları ölçmek için bir testi göstermektedir. RSV nötralize edici antikorlar içeren serum ile ön inkübasyon, virüs partiküllerini nötralize ederek hücresel enfeksiyonu ve plak oluşumunu azaltır. Virüsle enfekte olmuş hücreler daha sonra plak görselleştirme için fiksasyon, bloke etme ve florofor konjuge antikor etiketlemesine tabi tutulur. Bu işlem, nötralizasyon titresini temsil eden RSV'nin yüzde ellisini nötralize eden en...

Respiratuar Sinsityal Virüse Özgü Nötralize Edici Antikor Titresini Ölçmek İçin Bir Test

Bu video, murin akciğerlerinde bulunan bağışıklık hücrelerini tanımlamak için bir in vitro tekniği göstermektedir. Hedef bağışıklık hücrelerini murin akciğer dokusundan izole ettikten sonra, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücreleri üzerindeki spesifik belirteçlere karşı florofor etiketli antikorlardan oluşan bir kokteyl kullanılarak yüzey olarak etiketlenirler. Ek olarak, monositler, makrofajlar ve dendritik hücreler, hücre içi bir işaretleyici kullanılarak etiketlenir. Çeşitli bağışıklık...

Murin Akciğerlerinde Bulunan Doğuştan Gelen ve Adaptif Bağışıklık Hücrelerini Tanımlamak için İn Vitro Bir Yöntem

Aşıların nasıl çalıştığı hakkında genel bir bilgi eksikliği var. Burada, dendritik hücrelere ve T hücresi bağışıklığına özel olarak odaklanarak, aşılara karşı erken konak bağışıklık tepkileri hakkında fikir edinmek için ters genetik ve kemik iliği kimerik farelerin birlikte kullanılmasını öneriyoruz.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

İnsan ko-enfeksiyonunun in vitro olarak çoğaltılması zordur. Bununla birlikte, insan sıtma parazitleri, doğal olarak HIV ile enfekte olmuş taze izole edilmiş insan periferik kan mononükleer hücreleri gibi, in vitro olarak kolayca kültürlenebilir. Bu, HIV ko-enfeksiyonu bağlamında sıtma parazitlerine karşı erken bağışıklık tepkilerini incelemek için mükemmel bir model sağlar.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

Bu çalışmada açıklar yüksek işlem hacmi, nötralize antikorlar respiratuvar sinsityal virüs (RSV) için belirli titresi belirlemek için görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil. Bu tahlil biçimi farklı örnek türleri üzerinde test edilmiştir.

Bir geliştirilmiş ve yüksek üretilen iş respiratuvar sinsityal virüs (RSV) mikro-nötralizasyon tahlil

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

Bu protokol, viral olarak enfekte olmuş nazal epitel hücreleri ile doğuştan gelen hücre aktivasyonu arasındaki erken etkileşimlerin araştırılmasını detaylandırır. Bağışıklık hücrelerinin bireysel alt kümeleri, viral enfeksiyonlara yanıt olarak aktivasyonlarına göre ayırt edilebilir. Daha sonra erken antiviral yanıtlar üzerindeki etkilerini belirlemek için daha fazla araştırılabilirler.

Solunum Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Doğuştan İmmün Hücre Aktivasyonunun İncelenmesi için Temassız Ko-Kültür Modeli

Bu protokol, IAV'nin intranazal uygulaması ve fare akciğer hasarının aşağı akış analizi ve akciğer hücre tiplerinde ilişkili transkripsiyonel değişiklikler için talimatlar sağlar.

İnfluenza Enfeksiyonu Sonrası Displastik ve Fonksiyonel Akciğer Alveoler Onarımının Modellenmesi

Keşfedin, insan periferik kan mononükleer hücrelerinin solunum sinsityal virüs enfeksiyonuna immün tepkilerini in vitro modelde nasıl analiz edildiğini. Bu yöntem, viral patogenezdeki inflamatuar yolakları anlamak için değerlidir.

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin İnsan Solunum Sinsityal Virüs Enfeksiyonuna İmmün Tepkilerini İncelemek İçin Bir İn vitro Model (Video) | JoVE Journal

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin İnsan Solunum Sinsityal Virüs Enfeksiyonuna İmmün Tepkilerini İncelemek İçin Bir İn vitro Model

Daha fazla video keşfet