MTT deneyi ile sentez ve Sitotoksisite Değerlendirilmesi: Anticancer Metal Kompleksleri

Bu prosedürün genel amacı, anti-kanser metallo ilaçları hazırlamak ve bunların sitotoksisitelerini MTT testi ile değerlendirmektir. Bu, ilk olarak metal bazlı anti-kanser bileşiklerinin sentezlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, 96 kuyulu kanser hücresi plakası hazırlamaktır.

Daha sonra, metal bazlı anti-kanser bileşikleri kanser hücrelerine yerleştirilir. Son adım, MTT'nin mitokondriyal ve sitozolik enzimler tarafından zen oluşturmak üzere indirgenmesinin sonuçta anti-kanser aktivitesi ve yarı maksimal inhibitör konsantrasyonun ölçüldüğü MTT testi ile hücre canlılığını ölçmektir. Ya da bileşiğin 50 değerinin belirlendiğini görüyorum.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, laboratuvar çalışanının tüm dikkatini gerektiren ve katı bir zaman çizelgesine yerleştirilen çok adımlı bir prosedür olduğu için zorlanabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü hücre plakasının hazırlanması kolay değildir, çünkü canlı hücrelerle çalışmak belirli yönergelerin izlenmesini gerektirir. Bir torpido gözünde çalışarak, ligand öncüsünün 0.42 milimolünü kuru THF'de çözerek vanadyum beş kompleksini hazırlayın.

Daha sonra, THF'de eşdeğer miktarlarda vanadyum ot tris isop oksit içeren bir karıştırma çözeltisine ekleyin. Uçucu maddeleri vakum altında çıkarmadan önce reaksiyon karışımını oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Ardından, soğuk bir heksan ekleyin ve vakum altında çıkarın.

Kantitatif bir verimde koyu mor bir toz elde edilmelidir. Elde edilen bileşiğin sekiz miligramını bir epi orph şişesinde tartın. Titanyum dört kompleksini hazırlamak için, ligand öncüsünün 0.35 milimolünü kuru THF içinde çözün ve bunu THF'deki titanyum tetra isop oksit miktarlarına eşdeğer bir karıştırma çözeltisine ekleyin.

Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında iki saat karıştırın. Daha sonra, kantitatif bir verimde sarı bir ürün vermek için uçucu maddeleri vakum altında çıkarın. 96 oyuklu bir plaka ilk kültüründe HT 29 hücrelerini hazırlamak için elde edilen bileşiğin sekiz miligramını bir efh şişesinde tartın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi 75 santimetre karelik bir şişedeki hücreler, HT 29 hücreleri maksimum co akıcılığına ulaştığında ortamı çıkarır. Hücreleri bir mililitre tripsin EDTA çözeltisi içinde yıkadıktan sonra, aynı çözeltiden bir mililitre ekleyin ve beş dakika inkübe edin. HT 29 hücrelerini şişeden ayırın ve tripsin aktivitesini devre dışı bırakmak için 10 mililitre ortam ekleyin.

Hücre karışımının beş mililitresini bir tüpe aktarın. Hücre karışımının birkaç damlasını bir karşı odaya aktarmak için bir pipet kullanın. Sayaç odası, beşe beş kareden oluşan iki parça içerir.

Hücreleri bir mikroskop kullanarak her parçanın beş temsili karesinde sayın. Köşelerde dört kare ve ortada bir kare. Mevcut hücrelerin tahmini miktarını hesaplayın.

Her parçanın beş temsili karesindeki hücreleri toplayın. İki parçanın ortalama toplamını hesaplayın ve 20'ye bölün. Ardından, 0,6'yı bölüme bölün.

Alınan sayı, plaka başına gereken hücre karışımı miktarıdır. Bu hesaplama, oyuk başına 9.000 hücre içeren bir plakayı ifade eder. Bir pipet kullanarak, plaka başına gereken hücre karışımı miktarını 13.2 mililitre ortamla birleştirin.

Karışımı 96 kuyulu bir tabağa ekleyin. Toplamda 66 kuyu içeren altı hat üzerinde kuyu başına 200 mikrolitrede 11 kanallı bir pipet kullanarak. Boş kontrol için her satırdan bir kuyucuk boş kalmalıdır.

Hücrelerin plakaya yapışmasına izin vermek için plakayı 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin, önce bileşikleri yerleştirmek için, sekiz miligram ağırlık bileşiğine 200 mikrolitre kuru THF ekleyin. Önce dokuz farklı einor dosyasına 60 mikrolitre THF ekleyerek bileşik çözeltiyi daha da seyreltin. Her çözelti için, 60 mikrolitreyi bileşik çözeltiden ilk einor dosyasına aktarmak için bir pipet kullanın.

Daha sonra 60 mikrolitreyi tekrar askıya alın ve bir sonraki şişeye aktarın ve 10 farklı konsantrasyon elde edilene kadar bu şekilde devam edin. THF'deki her konsantrasyonun 20 mikrolitresini 180 mikrolitre ortamla seyreltmeye devam edin. Ayrıca, 180 mikrolitre ortama 20 mikrolitre THF ekleyerek yalnızca çözücü içeren bir kontrol çözeltisi hazırlayın.

Daha sonra, elde edilen her çözeltiden her bir oyuğa 10 mikrolitre ekleyin. Bu, litre başına 200 miligrama kadar bileşiğin nihai konsantrasyonlarını vermek için ortamda yukarıda belirtilen hücre çözeltisinin 200 mikrolitresini içerir. Her satır, bileşikle 10 farklı konsantrasyonda muamele edilmiş hücreleri içerir.

Bir, sadece çözücü ile muamele edilmiş hücreleri içeren kuyuyu kontrol edin ve hücresiz bir kuyuyu kontrol edin Boş kontrol için, bileşiğin her ölçümünü üç kez tekrarlamak için hatları ayarlayın. Yüklü plakayı% 5 karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede üç gün boyunca inkübe edin. MTT çözeltisini 11 kanallı bir pipet kullanarak metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın.

Boş kontrol kuyuları hariç her kuyucuğa 20 mikrolitre MTT çözeltisi ekleyin. İnkübasyondan sonra plakayı üç saat daha inkübe edin. Orta çözeltiyi her kuyucuktan çıkarın ve her oyuğa 200 mikrolitre izopropanol ekleyin.

Formu çözmek için plakayı homojen olana kadar 30 dakika karıştırın. Bir mikroplaka okuyucu, spektrofotometre ile her ölçümü üç farklı günde tekrarlayan 200 mikrolitre homojen çözelti için 550 nanometrede absorbansı ölçün. Daha sonra, ölçülen değerden boş kontrol absorbans değerini çıkararak, sonucu THF çözücü kontrol değerinin absorbansına bölerek ve %100 ile çarparak hücre canlılığının yüzdesini hesaplayın.

Rapor edilen IC 50, en az üç farklı günde toplanan tüm IC 50 değerlerinin ortalamasıdır ve hata değeri standart sapmadır. MTT testinden alınan veriler, bileşiğin sitotoksisitesini değerlendirmek için analiz edilir. Ölçümler, her platoda en az üç nokta ve eğimi tanımlamak için üç nokta olmak üzere eşit bir nokta dağılımını gösteren bir grafik oluşturacak bir dizi konsantrasyon üzerinde gerçekleştirilmelidir.

Yüksek konsantrasyonlarda veya düşük konsantrasyonlarda yetersiz ölçümler, IC 50 değerlerinin belirlenmesi için gerekli olan eğrinin doğrusal olmayan regresyon uyumunu bozacak ve sonuç olarak doğruluklarını azaltacaktır. Doğrusal olmayan regresyon uyumu ile belirlenen bağıl IC 50 değerleri, test edilen bileşik tarafından mümkün olan hücre büyümesinin inhibisyonunun %50'sine yol açan konsantrasyonlara karşılık gelir. Bu, ölçülen maksimum ve minimum hücre canlılığı arasındaki orta nokta olarak hesaplanır ve bunlar sırasıyla %100 ve %0 olması gerekmez.

Protokolde açıklanan deneylerin sonuçlarını incelerken. Sisplatinin yanı sıra titanyum ve vanadyum komplekslerinin de oldukça aktif olduğu açıktır. Ayrıca, belirli bir bileşiğin maksimum inhibisyon değeri %100'e ne kadar yakınsa, farklı bileşikler arasındaki IC 50 değerlerini karşılaştırırken, bağıl IC 50 değeri mutlak olana o kadar yakındır.

Titanyum dört kompleksi en yüksek sitotoksisiteye sahiptir ve IC 50 değerleri sisplatin ve Vanadyum beş kompleksinden daha düşüktür. Bununla birlikte, serbest ligand, ligandın farklı konsantrasyonlarda eklenmesinden bu yana belirgin şekilde azalmış aktivite sergiler. Hücre canlılığı, kompleksleri için olduğu kadar önemli ölçüde düşmez.

Bu, komplekslerin yüksek anti-kanser aktivitesinin, bu prosedürü denerken metal merkezlerine dayanmasını sağlar. Steril koşulları her zaman korumak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, anti-kanser bileşiklerinizin sitotoksisitesini M-T-T-S-A ile nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.