Hücre Takip için vivo ¹⁹ F MRG

Bu prosedürün genel amacı, 19 FMRI kullanarak in vivo olarak 19 F etiketli hücrenin sayısını görüntülemek ve ölçmektir. Bu klinik veya klinik öncesi bir ortamda yapılabilir. Bu, ilk olarak hücrelerin uygun bir 19 F ajanı ile etiketlenmesiyle gerçekleştirilir.

Bu çoğunlukla ex vivo olarak yapılır. İkinci adım, bilinen bir referansla 19 F ve MR kullanılarak yapılabilen hücre başına 19 F içeriğini ölçmektir. Hücre başına 19 F içeriğinin deney sırasında sabit kaldığı varsayılır, aksi takdirde düzeltme faktörlerinin hesaplanması gerekir.

Daha sonra, konu, aktarılan etiketli hücreleri lokalize etmek için bir H ve 19 FMRI kullanılarak in vivo olarak görüntülenir. Görüntü verilerinden niceleme için bilinen bir referans ve uygun görüntüleme parametreleri gereklidir. Son adım, hücre sayısını hesaplamak için görüntü verilerini işlemektir.

Mümkün olduğunda verileri doğrulamak için ex vivo histoloji veya diğer teknikler kullanılabilir. Sonuç olarak, in vivo hücre takibi için 19 FMRI, metinde belirtildiği gibi belirli varsayımlar göz önüne alındığında, aktarılan hücreleri ilgili süre boyunca lokalizasyonları ve sayıları açısından incelemek için kullanılabilir. Bu tekniğin, süper paramanyetik hücre etiketleri kullanan bir HMRI gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, kafa karıştırıcı bir arka plan sinyali olmaması ve hücre sayısının doğrudan görüntü verilerinden belirlenebilmesidir.

Bu yöntem, hücrelerin nerede olduğu ve çeşitli zaman noktalarında kaç tane bulunduğu gibi hücresel terapötikler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokole başlamak için, önce olgunlaşmamış dendritik hücrelere iki mililitre ortamda 1 milyon hücre başına dört miligram konsantrasyonda bir 19 F etiketi ekleyin. Sonra karıştırmak için hafifçe döndürün.

Daha sonra, dendritik hücreleri olgunlaşmadan ve hasat edilmeden önce üç gün boyunca etiketle inkübe edin. Daha sonra hücreleri toplayın ve en az üç kez yıkayarak fazla etiketi çıkarın. PBS sayımında, elde edilen hücreler daha sonra enjeksiyon veya daha ileri testler için küçük bir PBS hacminde yeniden süspanse edilir.

Burada açıklanan protokolün bu spesifik dendritik hücreler ve etiket için geçerli olduğunu unutmayın. Bu nedenle, başka bir hücre tipi için bir protokolün ya literatürde bulunması ya da araştırmacı tarafından optimize edilmesi gerekecektir. Bilinen sayıda etiketli hücreyi bir NMR tüpüne yerleştirin.

Ardından 10 mikrolitre %5 tri Fluor veya asidik asit veya TFA ekleyin. TFA'nın rezonans frekansı, etiketle örtüşme nedeniyle uygun değilse, alternatif bir çözünür bileşik kullanın. Bir NMR spektrometresine bir numune yerleştirin ve flor 19 spektrumunu elde edin.

Ardından, referansın ve numunenin tepe noktalarının veya numunenin ana tepe noktasının altındaki göreceli alanları hesaplayın ve ardından numunedeki hücre başına ortalama flor sayısını hesaplayın. İstatistiksel anlamlılığa ulaşmak için tüm bu sürecin ortalama olarak tekrarlanması gerektiğini unutmayın. Bu, doğrudan MRI tarayıcısında spektroskopi kullanılarak da yapılabilir.

Ayrıca, bu prosedürün, hücreler arasındaki değişkenliği değil, yalnızca çok sayıda hücre için ortalama flor 19 yüklemesini ortaya çıkardığını unutmayın. Hücre alımının tekdüzeliğini kontrol etmek, 19 F ajanı ile bir floresan bileşenin varlığını gerektirir. Burada sadece üçüncü senaryo, hücrelerin homojen bir şekilde etiketlenmesini göstermektedir, ancak bu hesaplamalarda her zaman varsayılsa da, bu, tamamen anestezi uygulanmış bir fareyi bir beşiğe yerleştirerek ve tarama sırasında hareketi önlemek için hareketsiz hale getirerek görüntüleme için kurulan mikroskopi gibi tamamlayıcı teknikler kullanılarak doğrulanabilir.

Ayrıca, tarama sırasında fizyolojik izleme için sıcaklık ve solunum kontrolünü bağlayın. Gerekirse, hayvanın yanına harici bir referans yerleştirin, hem referans hem de ilgilenilen bölge bobinin merkezinde olmalıdır. 19 F görüntüleme için anatomik bir referans olarak geleneksel bir proton MRI taraması ile edinmeye başlayın.

Ardından sistemi hücre işaretleyicisinin 19 F frekansına ayarlayın ve 19 FMRI taraması gerçekleştirin. İdeal olarak, 19 FMRI taraması, muhtemelen daha düşük çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, geleneksel bir MRI ile aynı görüş alanına ve dilim seçimine sahip olacaktır. Ardından, burada görülen formülü kullanarak 19 F referans darbe kazancını belirleyin ve 19 F frekansını belirlemek için bir 19 FNMR spektrumu elde edin.

Ayrı bir in vitro deneyde radyo frekansı bobinine bağlı faktör C'yi tahmin edin. Yüzey bobini gibi homojen B bir profile sahip bir radyo frekansı bobininin kullanılması, 19 F verilerinin nicelleştirilmesini engelleyebilir. Sinyal sadece 19 F konsantrasyonuna değil, aynı zamanda bobinden olan mesafeye de bağlı olduğundan.

Bu nedenle, 19 F verilerini geriye dönük olarak düzeltmek için bir H kanalında bir B bir harita edinin. Bu, orantılılık faktörü C dışında bir H ve 19 F bobin profilinin aynı olmasını ve 19 F'lik bölgelerde yeterli bir H arka plan sinyalinin sağlanmasını gerektirir. 19 F verisini düzeltmek için önce iki çevirme açısı yöntemiyle bir H çevirme açısı haritası elde edin.

Bobine yakın, tahmini çevirme açısı 90 derecenin hemen altında olan çok uzun bir TR'nin üç kattan fazla olduğu bir HT'ye kadar bir gradyan yankı taraması kullanın. Ardından, ilk taramanın iki katı çevirme açısına sahip ikinci bir gradyan yankı taraması elde edin. Birinci ve ikinci gradyan ECHO taramalarının sinyali ve algısı aracılığıyla vle X, Y, Z'de bir H çevirme açısı alfa'yı hesaplayın.

19 F çevirme açısı, bir faktör dışında aynı olacaktır, oransal B bir profili nedeniyle, uyarma çevirme açısı alfa yeniden odaklama çevirme açısı iki alfa ile bir spin yankı dizisinden 19 F sinyal yoğunluğunun zayıflaması, sinyal alımı sırasında burada ekranda görülür. Kusurlu uyarılmaya bağlı zayıflama burada görülür. Daha sonra genel zayıflama hesaplanabilir.

Mükemmel 90 derece, 180 derece uyarma yeniden odaklama çevirme açısı durumunda bire normalleştirildiğini, B olanın düzeltilmiş 19 F görüntü sinyali yoğunluklarının SI 19 F düzeltildiğini, bir H ve 19 F bindirme görüntüsü oluşturmak için bu formül aracılığıyla hesaplandığını unutmayın. Görüntü verilerini dışa aktarın ve dosyaları görüntü J gibi bir görüntü işleme programında açın, ayarlamaları tüm görüntüler için aynı tuttuğunuzdan emin olarak görüntü ayarlamalarını gerektiği gibi uygulayın. Ardından 19 F görüntüleri yanlış renkte oluşturun ve ardından karşılık gelen bir H görüntüsünün üzerine yerleştirin.

Sinyali lokalize etmek için, ilgili hücrelerin ve referansın görünür olduğu 19 F büyüklüğündeki görüntüyü seçin, ilgili hücreler üzerinde ROI'ler çizin, referans ve örnekte gösterildiği gibi gürültü değeri için konunun dışındaki bir bölge. Burada, netlik için bir H anatomik taramasının gösterildiğini unutmayın. Basit orantılılık ve hücre başına 19 F değeri daha sonra ROI'deki hücre sayısını tahmin etmek için kullanılabilir.

Bu görüntüler, 19 F işaretli hücrelerin drenaj yapan bir lenf noduna transferini içeren bir protokolün tipik sonuçlarından alınmıştır. Burada, bir TFA referansı kullanarak 1 milyon etiketli hücreden oluşan 19 FNMR spektrumunu görüyoruz ve burada in vivo görüntüleme için temsili bir işlenmiş görüntü görüyoruz. Farenin ayakları arasına hücreler için kullanılan aynı etikete sahip kapalı bir kaptan oluşan bir referans yerleştirildi.

Açıklanan protokolü uygulayarak, ham 19 F kadir görüntüsüne dayanarak yaklaşık 1,2 milyonluk bir hücre sayısı hesapladık. 19 F görüntüsü, gri tonlamalı, anatomik proton görüntüsünün üzerine yanlış renkle bindirilir. Yeni bir deney kurarken, floru doğrulamak önemlidir.

Histoloji, optik görüntüleme veya diğer yöntemlerle MRG sonuçları. Örneğin, hücreler öldüğünde flor etiketinin dokuda kalabileceğini ve yanlış pozitif sinyale yol açabileceğini not etmek önemlidir.