Name: Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Keşfedin HIV-spesifik CD4 T hücrelerinde sitokin salınımını ve immunoregülatör yolları in vitro analiz yöntemiyle. Bu teknik, antikor blokajının efektör fonksiyon üzerindeki etkisini değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz, anti-PD-L1 bloke antikorun sağlanması ve kullanılması için Gordon Freeman ederiz. Biz Massachusetts General Hospital ve bu projede onların değerli rolü için tüm katılımcıların de klinik ve laboratuar çalışanlarına teşekkür ederiz. , Ulusal Kalp Akciğer ve Sağlık Ulusal Enstitüleri Kan Enstitüsü (RO1 HL-092.565, DEK); Bu çalışma Ulusal Alerji Enstitüsü ve Sağlık Ulusal Enstitüsü (DEK PO1 AI-080192) Enfeksiyon Hastalıkları tarafından desteklenmiştir. DEK Quebec Sağlığı Araştırma Fonu Araştırmacı Kariyer Ödülü (FRQS) tarafından desteklenmektedir. FP Araştırma ve Harvard Küresel Sağlık Enstitüsü (HGHI) üzerine Massachusetts General Hospital İcra Komitesi burs hibe ile desteklenmektedir.

1.. Ficoll ayırma yoluyla tükenmesi ve PBMC&#39;lerin izolasyonu <ol><li> Tam kan, 50 ul / ml &#39;de insan CD8 + tükenmesi kokteyli eklenerek CD8 + T hücrelerinin tüketilmesi. </li><li> İyice karıştırın ve oda sıcaklığında (18-25 ° C) &#39;de 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, (Ca2 + veya Mg2 + olmaksızın Hank Dengeli Tuz Çözeltisi) HBSS ile tam kan karıştırın ve Histopaque fazla tabaka. 30 dakika (hiçbir fren, yavaş hızlanma) için 340 RCF Spin. </li><li> PBMC&#39;Ierde toplamak ve yeni bir 50ml konik transfer. 340 RCF 10 dakika boyunca iplik 50 IU Penisilin, 50 | ig / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin ve% 1 HEPES ile takviye edilmiş 45 ml RPMI 1640 ile yıkayın 2x. </li></ol> 2. Antikor Blockade ve Hücreler antijen-spesifik uyarım <ol><li> 50 IU Penisilin, 50 | ig / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin ve% 1 HEPES ile takviye edilmiş,% 10 insan serumu ihtiva eden RPMI 1640 içinde durum başına 2x10-6 yeniden süspanse hücre,durum başına 500 ul için muhasebe. </li><li> FACS tüp başına hücre süspansiyonu kısım 500 ul. </li><li> Incelenen yolu bağlı olarak, PD-L1, 10 ug / ml &#39;de antikorlar ve / veya izotip kontrolleri IL-bloke 10Rα ekleyin ve 37 ° C,% 5 CO2 de 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 1 ug / ml / peptid nihai konsantrasyonda, bir HIV-1 Gag peptidi havuzlu hücreleri uyarır. Ayrıca, her bir durum için bir bloke &quot;no uyarım&quot; kontrolü içerir. 37 ° C, 48 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin. </li></ol> 3. Toplama ve süpernatanı üzerinde yapılan analiz <ol><li> 48 saat sonra, 340 rcf 7 dakika FACS tüpler aşağı spin. </li><li> Dikkatle pelet bozmadan Luminex boncuk dizileri için Eppendorf tüpleri 2 x 225 ul süpernatant toplamak. </li><li> % 0.05 PBS-Tween bir son konsantrasyon vermek üzere 25 ul% 0.5 &#39;lik PBS-Tween ile toplanan süpernatan içinde virüs etkisiz hale getirirler. </li><li> Immed değildir Mağazası toplanan süpernatanlanVakit kaybetmeden bir -80 ° C derin dondurucuda kullanılabilir. </li><li> Üreticinin protokolüne göre Millipore Luminex kiti kullanılarak istenen sitokin konsantrasyonları ölçün. </li></ol> 4. Sitometrisi yoluyla Toplama ve Hücre Fenotipik Analizi <ol><li> Süpernatant topladıktan sonra, 3 ml PBS içinde hücreleri yıkayın. 340 rcf 7 dakika hücreleri Spin ve aşırı yıkama süzün. </li><li> Üreticinin protokolüne göre bir DEAD tamir edilebilir / CANLI Ölü Hücre Leke Kit kullanarak canlılığı için leke. </li><li> 340 RCF ve 4 ° C &#39;de, 7 dakika boyunca PBS içinde hücreler yıkayın 100 ul PBS% 1 FBS içinde süspanse edin. </li><li> FcR reaktifi ve karıştırmak için girdap bloke 1.4 ul ekleyerek, monositler veya başka antijen sunan hücreler, blok Fc reseptörleri için boyama durumunda. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca inkübe </li><li> Yüzey antikorlar, vorteks ekleyin ve karanlıkta 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> , PBS,% 1 FBS hücreleri yıkayın fazla yıkama süzün ve 200 ul% 4 paraformaldehid ekleyin. Kuluçkaya yatmakKaranlıkta 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı. </li><li> 250 ul PBS,% 1 FBS içinde PBS,% 1 FBS, tekrar süspansiyon hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresi üzerinde elde MULTILASER (örneğin BD LSRII veya Fortessa). </li></ol> 5. QRT-PCR ile analiz Hücrelerinin <ol><li> Hücreleri için akış sitometri ile analiz değil: yüzer toplama sonra,% 1 beta-merkaptotanol içeren 300 ul Oiagen Tampon RLT içinde lyse hücreler. Protokolü ile devam değilse, hücreler bu noktadan sonra -80 ° C &#39;de dondurulabilir. </li><li> Üreticinin protokolü takip edilerek, bir RNA izolasyon kiti kullanarak, RNA izole edilir. </li><li> Üreticinin protokolü takip edilerek, bir cDNA sentez kiti kullanılarak RNA&#39;dan cDNA sentez. </li><li> SYBR Green teknolojisi kullanılarak kantitatif PCR gerçekleştirin. </li><li> 10 uM&#39;lik nihai bir konsantrasyon vermek üzere su içermeyen nükleaz primerlerin eklenmesiyle hazırlık geninin (örneğin, IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) dahil olmak üzere, kullanılan her bir primer için bir primer karışımını oluşturmakuM. Buz üzerinde tutmak. </li><li> 10,5 ul nükleazsız su, 12.5 ul SYBR yeşil ve plaka başına 1 ul primer karışımı ekleyerek her primer için bir ana karışımı oluşturun. Buz üzerinde tutmak. </li><li> Kullanılacak, plakanın her oyuğuna pipetle 24 ul ana karışımı. </li><li> Şablona göre her kuyuya 1 ul cDNA ekleyin. </li><li> 800 rcf 3 dakika boyunca kuyu ve santrifüj plaka Cap. </li><li> Bir Mah-PCR makinesi, örneğin bir Stratagene MX3005P enstrüman üzerinde plakayı. </li></ol> 6. 48 saat sonra hücre içi sitokin boyama için İntibak Brefeldin ve Monensin önce hücre içi sitokin boyama 6 saat ekleyin. Monensin, üreticinin talimatlarına uygun olarak ilave edilirken Brefeldin 10 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda ilave edilir. Kolaylık sağlamak için, Brefeldin 5 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda leke önce 12 saat eklenebilir. <ol><li> Yüzey leke sonra, en çok PBS% 1 FBS ve leke ile yıkama hücreleriIL-12, IFN-γ, ve bir tespit / Permeabilization Solution kiti ve protokol kullanılarak TNF-α gibi ekstrasellüler sitokinler. </li><li> 250 ul PBS,% 1 FBS içinde hücreler tekrar süspansiyon yıkayın ve (örneğin, BD LSR II veya Fortessa) akış sitometresi bir MULTILASER çalışır. </li></ol> 7. Hücreleri Ayırma adaptasyon <ol><li> Canlılığı için stimülasyon, leke sonra 16 saat üreticinin protokolüne göre / CANLI ÖLÜ tamir edilebilir Ölü Hücre Leke Kit kullanarak. Tüm işlem sırasında hücreleri buz üzerinde tutun. </li><li> 340 RCF ve 4 ° C &#39;de, 7 dakika boyunca PBS ile yıkayın hücrelerin 100 ul PBS% 1 FBS içinde süspanse edin. </li><li> Karıştırmak için yüzey antikorlar, vorteks ekleyin ve 20 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde hücrelerin inkübe edilir. </li><li> 340 RCF ve 4 ° C&#39;de PBS,% 1 FBS ile yıkanır ve hücreler tekrar süspansiyon 500 ul% 10 Fetal Bovine Serum ihtiva eden soğuk RPMI 1640 50 IU Penisilin, 50 | ig / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin ve% 1 ile desteklenmiş hepes. </li><li> 5 ml polistiro kullanılarak Filtre hücreleriHücre-Süzgeç kapaklı rene Yuvarlak Dipli Tube. </li><li> Fetal Bovine Serum 50 IU Penisilin, 50 | ig / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin, ve her bir tüpe,% 1 HEPES ile takviye edilmiş% 10 ihtiva eden 200 | il RPMI 1640 eklenmesi ile bir tür toplama tüpleri hazırlayın. Sıralama sırasında buz üzerinde tüm tüpler tutun. </li><li> Canlı bir enstrüman biyozararli malzeme için donanımlı bir tesiste bulunan (örn. BD FACS Aria II) faiz hücre alt sıralamak. </li><li> Hücreler kriteri edildikten sonra, geriye zaman istenilen miktarda inkübatör ve yüzer toplama / Luminex analizi ve hücre topağı toplama / PCR analizi ile takip yer hücreleri. </li></ol>

<ol><li>Zajac, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+immune+evasion+due+to+persistence+of+activated+T+cells+without+effector+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function.</a> J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).</li>
<li>Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+persistence+alters+CD8+T-cell+immunodominance+and+tissue+distribution+and+results+in+distinct+stages+of+functional+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment.</a> J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).</li>
<li>Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+detrimental+roles+of+IL-10+in+HIV+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Cytokine+Netw%22%5BJournal%5D)">Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis.</a> Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).</li>
<li>Porichis, F., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+PD-1+in+HIV+pathogenesis+and+as+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+HIV%2FAIDS+Rep%22%5BJournal%5D)">Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).</li>
<li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">T cell exhaustion.</a> Nat. 12, 492-499 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+PD-1+expression+on+HIV-specific+CD8%2B+T+cells+leads+to+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction.</a> Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).</li>
<li>Day, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+expression+on+HIV-specific+T+cells+is+associated+with+T-cell+exhaustion+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression.</a> Nature. 443, 350-354 (2006).</li>
<li>Brockman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+is+up-regulated+in+multiple+cell+types+during+viremic+HIV+infection+and+reversibly+inhibits+virus-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells.</a> Blood. 114, 346-356 (2009).</li>
<li>Barber, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+function+in+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Nature. 439, 682-687 (2006).</li>
<li>Zhang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+up-regulation+is+correlated+with+HIV-specific+memory+CD8%2B+T-cell+exhaustion+in+typical+progressors+but+not+in+long-term+nonprogressors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors.</a> Blood. 109, 4671-4678 (2007).</li>
<li>Ndhlovu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+immunomonitoring+models+of+HIV-1-specific+CD8+T-cell+responses+accurately+identify+subjects+achieving+spontaneous+viral+control%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control.</a> Blood. 121, 801-811 (2013).</li>
<li>Porichis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+HIV-specific+CD4+T+cells+to+PD-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade.</a> Blood. 118, 965-974 (2011).</li>
<li>Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+CD25%2B+regulatory+T+cells+impair+HIV-1-specific+CD4+T+cell+responses+by+upregulating+interleukin-10+production+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes.</a> 86, 6586-6594 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Supernatant koleksiyonu bu deneysel tasarım bir zorunluluk parçasıdır. Luminex deneyi için süpernatantlar hasat zaman, tam bölünen miktarları yapılan ve donma-erime döngüleri nedeniyle protein bozulmasını önlemek için -80 ° C&#39;de tutuldu. Dondurma ve eritme proteinler için ve dondurularak çözülür en aza indirerek sert işlemler olabilir, sinyal deneylerde maksimize edilir. Bu nedenle, bu kez aynı sayıda dondurularak çözülmüş edilmiş alikotlarından çalışırken, tekrarlanabilir ve daha detaylı bilgi elde etmek için daha ...

Kalıcı viral enfeksiyonlar esnasında, virüs spesifik T-hücreleri, T hücresi bitkinlik olarak bilinen bir işlem fonksiyonel kusurlar kazanır. Erken kronik viral enfeksiyonun LCMV murin modelinde in vivo çalışmalarda tükenmiş virüs spesifik T hücreleri, viral yönden enfekte edilmiş hücrelere karşı sitolitik fonksiyon düşük çoğalma yeteneğini kaybeder ve bu IL-2, TNF-a gibi sitokinler üretmek için kapasitesi düşük olduğunu göstermiştir α ve 1,2 IFN-γ. Örneğin PD-1 ve IL-10 gibi bağışıklık yolların, karmaşık bir ağ, kronik enfeksiyonlar sırasında yukarı düzenlenen ve (3,4 gözden) T hücre fonksiyon bozukluğuna katkıda bulunur. Olarak, LCMV fare Bu engelleyici yolların karşı bloke edici antikor vivo tatbikat model T hücresi tükenme (5 gözden), kısmen geri fenomen olduğunu gösteren, tükenmiş virüs spesifik T hücrelerinin fonksiyonunu ve gelişmiş viral açıklık geri. Th BulgularE LCMV modeli hızlı bir şekilde HBV, HCV ve HIV 5 gibi insan kronik viral enfeksiyonların uzatıldı. Kronik HIV-1 enfeksiyonunda, PD-1 ve IL-10 yollar enfekte olmuş kişilerde yukarı regüle edilir ve CD4 ile ters viral yük ve doğrudan, hastalığın ilerlemesi parametreleri ile ilişkili 6-8 sayılır. LCMV fare modeline benzer, insanlardaki T hücresi tükenme, kısmen geri olgudur belirten HIV spesifik CD4 ve CD8 T hücrelerinin in vitro çoğalması geri PD-1 ya da IL-10 yollarının antikor blokajı. Bununla birlikte, hassas insan örnekleri üzerinde deneyler doğa hem de in vitro deneyleri, bu girişimlerin elde fonksiyonel restorasyon profillerin ayrıntılı soruşturma duyarlılığında sınırlamalar nedeniyle çarpıcı yoktur. Çoğalma deneyleri, bugüne kadar, çoğu çalışmalarda test tek güvenilir in vitro deney olmuştur, ancak bu Inter etkisi üzerine kanıt dikkate değer bir eksikliği varon VENTIONS: sitotoksik T hücrelerinin 1) öldürme kapasitesi, 2) viral replikasyonu üzerindeki T hücrelerinin antiviral etkisi, 3) sitokin sekresyon profili ve diğer hücre alt-gruplarla ilgili CD4 T hücresi yardımıyla 4) etkisi. Hücre içi sitokin boyama (ICS) bir çok yararlı ve yaygın olarak kullanılan bir akım farelerde ve insanlarda hem de çeşitli hücre tiplerinde sitokinlerin üretimini tespit etmek için kullanılır sitometrisi göre deneyidir. Ayrıca inhibitör yollarının antikor ablukasının etkisini araştırmak için kullanılır olmuştur. ICS deneylerinde, sitokin salgılama Brefeldin ve / veya Monensin ilavesiyle engellenir. Hücrelerin içinde sıkışıp sitokinler sonra çok renkli akış sitometrisi kullanılarak floresan antikorlar ile tespit edilir. Tipik olarak antijen ilave 2 saat içinde ilave edilir ve Brefeldin Monensin, hem de hücreler için toksik olmasından dolayı, tahlilin süresi genellikle antijen stimülasyonu sonrası 6 veya 12 saat ile sınırlıdır. ICS deney yararlı i olmuştur güçlü bir tekniktirn hücreleri, antikor maruz 9 sonra belli bir süre sonra ekstre edildi farelerde antikor müdahale bloke in vivo etkisinin araştırılması. Bununla birlikte, insan örneklerinde inhibitör reseptörlerin blokajı etkisini değerlendirmek için bu deneysel yaklaşımın uygulanması için çeşitli sınırlamalar vardır. In vitro olarak, bir 6 ya da 12 saat stimülasyonu (insan örnekleri tipik durum) &#39;de önleyici bir yollarının antikor müdahaleler gerçekleştirirken, standart ICS deneyleri ile ölçüldüğü haliyle, çoğu durumda önleyici reseptörlerinin blokajı antijen-spesifik T hücrelerinin yanıt sıklığını değiştirmez 6, 7. Ortalama yoğunluğu ya da ortalama floresan ile ölçülen hücre başına sitokin üretiminin ölçümü tutarsız sonuçlar 6, 7, 10, verdik. Öte yandan, ICS sonra geç bir zaman noktasında gerçekleştirildiğinde stimülasyonu (yani altı gün), sitokin salgılayan c sayısındaki değişimlerarşın gözlenebilir. Farklılıklar değiştirilmiş çoğalma, hayatta kalma ve zaman 6&#39;daki belirtilen süre boyunca birikir efektör fonksiyonu değişiklikleri, bir kombine etkisi vardır. Kısmen, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için bir yolu yayılması ortaya beklemeden sitokin salgı engelleyicinin ilave edilmeden önce antijen ile daha uzun bir süre (örneğin, 36 saat, 60 saat vs.) Boyunca inkübe etmektir. Başarıyla HIV spesifik CD4 ve CD8 T hücreleri tarafından 11,12 sitokin salgılanmasının kinetiklerini belirlemek için bu yöntemi kullandık, ancak bu yaklaşım küçük tepkiler tespit etmek mümkün değildir ve toplam sitokin salgı meydana gelen entegre bir sonucu vermeyecektir stimülasyon beri. Bu nedenle, ICS supernatan sitokin mRNA miktarının ya da sitokin salgılanması ölçümleri ile karşılaştırıldığında aktive T hücreleri tarafından üretilen sitokin inhibe edici miktarına yollarının blokajı etkisini tespit etmek için yeterince hassas bir yöntem değildirAynı zaman noktalarında t. Ayrıca, aktive edilmiş T hücreleri tarafından üretilen sitokinlerden çok pozitif ya da negatif geri besleme katkıda otokrin bir şekilde hareket antijen sunan hücreler ile etkileşim aracılığıyla döner. Bu nedenle, tahlil sırasında ICS Brefeldin veya Monensin ilavesi sitokin salgılanmasını önler ve böylece T hücrelerinin uyarılması optimal değildir. Son olarak, ICS ile birden fazla sitokin tespiti akış sitometrisi ile sitokinlerin belirlenmesi yanı sıra, herhangi bir panelde aynı anda kullanılabilir fluorochromes sayısında kısıtlamalar tarafından kullanılabilirliği ve antikorlar duyarlılığı ile sınırlıdır. Biz hücreler (APC) ve doğal öldürücü hücreler (NK hücreleri) sunulması antijen HIV-spesifik CD4 T hücreleri tarafından sitokin salınımını düzenleyen ve daha sonra CD4 yardım içinde immünregulatuar yolların etkisini değerlendirmek için son derece hassas bir in vitro deneysel bir yaklaşım geliştirdi. Bu yöntem, aynı zamanda Çarpışma değerlendirmek için kullanılabilirPBMC&#39;lerden CD4 T hücreleri tüketen veya sadece CD8 T hücreleri tarafından tanınan uygun peptitler ile uyarılmasıyla CD8 T hücre işlevi üzerindeki inhibitör moleküllerinin blokajının ct. , 2), daha geniş bir paneli araştırmak 1) üretilmiş sitokin düzeylerinin daha doğru bir ölçümü gerçekleştirmek: hücre içi sitokin boyama deneyleri aksine olarak, edebilmek amacıyla, HIV-özgü CD4 T-hücreleri tarafından sitokin salgılanması ile müdahale karar sitokinler veya efektör moleküller, ve 3) diğer hücre alt-gruplarla ilgili HIV-özgü CD4 T-hücreleri tarafından üretilen sitokin etkisini değerlendirmek. Biz, ilgi konusu bağışıklık yolu için bloke edici antikorların mevcudiyetinde bir HIV-1 Gag peptidi havuzlu CD8 tükenmiş PBMC uyarır. Inkübasyon, genellikle 48 saat içinde arzu edilen süre sonra, boncuk dizileri ile sitokin salgılanmasını ölçmek ve farklı hücre alt fenotipik analizi için ya da transkripsiyonel analizi için ya da hücre pelletleri toplamak için süpernatantlar toplamak. Of t dikkat,Onun 48 saat zaman noktası, biz T hücreleri 12 çoğalan önemli bir nüfus tespit yok. Bu esnek bir yaklaşım ve bu tasarımın bazı uyarlamaların farklı hipotezler gidermek için uygulanabilir. Örneğin, (örneğin, vb HIV spesifik CD4 T hücreleri veya PD-1 yüksek CD4 T hücreleri gibi). Tek hücre alt yüzer ve hücre topakları toplanması ve ardından 36 saat süre ile inkübasyondan önce, daha kuluçkalamadan 12 saat sonra sıralanabilir daha spesifik PBMC&#39;lerin tanımlanmış alt popülasyonlar tarafından sitokin salgılanması üzerindeki abluka müdahalelerin etkisini araştırmak için.

<table><tbody><tr><td>Hanks Ca 2 + veya Mg < > 2 + </td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Histopak-1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Serumu AB</td><td>Gemini BioProducts</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Mediatech</td><td>30 001 CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Mediatech</td><td>25 005 CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tamponu</td><td>Mediatech</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>FcR bloke edici reaktif, insan</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>RozetSep İnsan CD8 + Tükenme Kokteyli </td><td>Kök Hücre</td><td>15663</td><td></td></tr><tr><td>CANLI / ÖLÜ Sabitlenebilir Ölü Hücre Leke Kiti, UV uyarması için</td><td>Invitrogen</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Improm-II Ters Transkripsiyon Sistemi</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR qPCR Düşük Rox Master Karışımı</td><td>Agilent</td><td>600830</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fiksasyon/Geçirgenleştirme Çözüm Kiti</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337100</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&#947; astar</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>İÇİN: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA</td></tr><tr><td>GAPDH astar</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>İÇİN: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG</td></tr></tbody></table>

vitro testi hiv-spesifik cd4 t hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T hücre bitkinlik kronik viral enfeksiyonlar sırasında başarısız patojen klirensinde önemli bir faktördür. Örneğin PD-1 ve IL-10 gibi bağışıklık düzenleyici yolları, bu devam eden antijen maruz kalma üzerine yukarı regüle ve proliferasyonu kaybı, düşük sitolitik işlevine katkı ve CD4 ve CD8 T hücreleri tarafından sitokin üretimi bozulmaktadır. LCMV enfeksiyonunun murin modelinde, T hücresi tepkilerini artmış olarak bu iki yolun karşı bloke edici antikorların uygulanması. Bununla birlikte, insan örneklerinden hücrelerinde sitokin salgılanması üzerindeki bu blokajı etkisini ölçmek için bir in vitro deney, şu anda mevcuttur. Bizim protokolü ve deneysel yaklaşım doğru ve verimli bir şekilde HIV bulaşmış bireylerden HIV-özgü CD4 T-hücreleri tarafından sitokin üretiminin restorasyon ölçmek için olanak sağlar. Burada, HIV-özgü CD4 T hücreleri ve diğer cel üzerindeki etkisi ile sitokin salgılanmasının ölçümü sağlayan bir in vitro deney tasarımı tasvirl kümeler. CD8 T hücreleri, bütün kandan tükenmiş ve kalan PBMC Ficoll ayırma yöntemi ile izole edildi. CD8-tükenmiş PBMC daha sonra, bir HIV-1 Gag peptidi havuzu ile uyarıldıktan sonra, hücreler, 37 ° C,% 5 CO2 inkübe edildi, PD-L1 ve / veya IL-10Rα karşı bloke edici antikor ile inkübe edilmiştir. 48 saat sonra, yüzer boncuk diziler ve hücre topakları tarafından sitokin analizi için toplandı, sonra, qRT-PCR kullanılarak sitometri veya transkripsiyonel analizi kullanılarak akış fenotipik analizi ya da toplandı. Daha ayrıntılı analiz için, farklı hücre popülasyonları PBMC&#39;lerden selektif alt azalması ile ya da aynı deneylerde değerlendirilen önce akış sitometrisi kullanılarak sıralama ile elde edilmiştir. Bu yöntemler, antijene özgü T-yardımcı hücreleri tarafından sitokin üretiminin modülasyonu tespit etmek ve bağışıklık hücrelerinin farklı popülasyonlar arasında fonksiyonel etkileşimi belirlemek için son derece hassas ve özel bir yaklaşım sağlar.

Bu in vitro bir sistem kullanılarak sitokin ölçümleri gerçekleştirirken, bu uyarım kontrol ile karşılaştırıldığında herhangi bir antijene özgü yanıtları ayırt edebilmek için gereklidir. Genel olarak, bu kontrol ve uyarım tahlilin lineer aralığı içindeydi no göre sitokin seviyelerinde en azından üç kat bir artış elde antijenik uyarımı herhangi bir değeri pozitif tepkiler olarak. Zayıf bir antijene özgü CD4 T hücresi tepkilerini gözlemlemek kılar, 0.16 pg / ml gibi düşük sitokinlerin konsantrasyonlarının saptanma...

Biz HIV-spesifik CD4 T hücreleri tarafından sitokin salgılanmasının düzenlenmesinde immünregulatuar yolların rolünü araştırmak için bir in vitro testi geliştirdi.

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Bu prosedürün genel amacı, uyarılmış T hücrelerinin sitokin salgılanmasını, transkripsiyonunu ve morfolojik etkisini analiz etmektir. İlk olarak, periferik CD sekiz tükenmiş kan mononükleer hücresini HIV ile enfekte olmuş bireylerden izole etmek için bir FI çağrı gradyanı kullanın, hücreleri ya izotip kontrolü ya da ilgilenilen bloke edici antikor ile inkübe edin. Daha sonra hücreleri ilgilenilen antijen ile uyarın.Daha sonra, sitokin ölçümleri için süpernatanlar ve istenirse fenotipik analiz veya transkripsiyonel analiz için hücre peletleri toplamak için hücre kültürlerini santrifüjleyin. Bu protokolü, tek tek hücre tiplerini akış sitometrisine göre sıralamayı içerecek şekilde uyarlayın Sitokin sekresyonu ile ilgili sonuçlar. Fenotipik veya transkripsiyonel analiz, inhibitör yolakların antikor blokajının, HIV spesifik CD dört T hücrelerinin efektör fonksiyonunu geri kazanma üzerindeki etkisini gösterebilir.Bu in vitro test, geniş bir efektör molekül panelini araştırmak ve ayrıca T hücreleri için HIV'e özgü C tarafından üretilen sitokinlerin diğer hücre alt kümeleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için inhibitör yolların blokajı ile restore edilen sitokin seviyelerini ölçmek için etkili bir şekilde kullanılabilir. Laboratuvarımızdan bir araştırma teknisyeni olan Megan Hart şimdi bu prosedürü gösterecek, İnsan CD'si sekiz pozitif tükenme kokteylini mililitre tam kan başına 50 mikrolitrede ekleyerek CD sekiz pozitif T hücresini tüketin, iyice karıştırın ve 20 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, tam kanı çile tamponu ile karıştırın.Şimdi kanı dikkatlice histo paketinin üzerine koyun, ardından gradyanı 540 RCF'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Periferik kan mononükleer hücrelerinin katmanını toplayın. Hücreleri 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın ve 45 mililitre tam RPMI 1640 ile iki kez yıkayın.Yıkanmış hücreleri tam RPMI 1640'ta yeniden askıya alın. Daha sonra faks tüpü başına 500 mikrolitre hücre süspansiyonu aliquot. Araştırılan yola bağlı olarak, bloke edici antikorları ekleyin.Ayrıca izotip kontrollerini uygun tüplere ekleyin. Hücreleri hücre kültürü inkübatöründe 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri bir HIV bir gag peptit havuzu ile uyarın.Ayrıca her engelleme koşulu için bir stimülasyon kontrolü içermez. 48 saat boyunca hücreleri kültürlemeye devam edin. Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin, ardından peleti rahatsız etmeyin.Luminex hız dizilerinin virüsü 25 mikrolitre% 0.5 PBS arasında etkisiz hale getirmesi için iki kez 225 mikrolitre süpernatanı EOR tüplerine aktarın. Ardından, üreticinin protokolüne göre Millipore luminex kitini kullanarak istenen sitokin konsantrasyonlarını ölçün. Hücreleri canlılık için üç mililitre PBS boyasında yıkadıktan sonra, monositler veya diğer antijen sunan hücreler için 1.4 mikrolitre FCR bloke edici reaktif girdabında boyama yapılırsa,% 1 FBS içeren 100 mikrolitre PBS'de hücreleri yeniden süspanse edin ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca karıştırın ve inkübe edin.Daha sonra, yüzey antikorları girdabını ekleyin ve karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Bir yıkamadan sonra 200 mikrolitre% 4 para formaldehitte yıkayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika inkübe edin. Bir yıkamadan sonra, hücreleri kantitatif RTPCR için çoklu lazer akış sitometresinde analiz için 250 mikrolitre% 1 FBS'de askıya alıyoruz, hücreleri 300 mikrolitre kyojen tamponunda lyce, RLT% 1 Beamer keto etanol izolat RNA'sı, üreticinin protokolünü takip eden bir RNA izolasyon kiti kullanarak.Şimdi bir CD NA sentez kiti kullanarak ve üreticinin protokolünü izleyerek RNA'dan CD NA'yı sentezleyin. Daha sonra, nükleaz içermeyen suya primerler ekleyerek temizlik genleri de dahil olmak üzere her astar için bir astar karışımı oluşturun ve buz üzerinde tutun. Her amplifikasyon ana karışımı için, plaka başına 10,5 mikrolitre nükleaz içermeyen su, 12,5 mikrolitre siber yeşil ve bir mikrolitre astar karışımı ekleyin.Şimdi her reaksiyona 24 mikrolitre ana karışım pipetleyin. Ayrıca, şablona göre her birine bir mikrolitre CD NA ekleyin. Kuyuları kapatın ve plakayı 1500 RCF'de üç dakika santrifüjleyin.Ardından, hücre yüzeyi boyama için plakayı bir QRT PCR R makinesinde çalıştırın. Hücre içi sitokin boyamadan yaklaşık altı saat önce felden ve monin boyalarını ekleyin. Daha sonra hücreleri PBS'de% 1 FBS ile yıkayın ve hücreleri yıkadıktan sonra bir fiksasyon geçirgenlik solüsyon kiti ve protokolü kullanarak hücre içi sitokinleri boyayın.Peletleri 250 mikrolitre% 1 FBS'de askıya aldıktan sonra, numuneleri stimülasyondan 16 saat sonra çoklu lazer akış sitometresinde çalıştırın, canlı ölü sabitlenebilir ölü hücre boyama kitini kullanarak canlılık için lekeleyin. Üreticinin protokolüne göre, bir PBS yıkamasından sonra, hücreleri karanlıkta buz üzerinde 20 dakika boyunca karıştırmak ve inkübe etmek için yüzey antikorları girdabında 100 mikrolitre% 1 FBS içinde askıya alıyoruz. Hücreleri bir kez yıkayın ve hücreleri 500 mikrolitre soğuk tamamlayıcı RPMI 1640'ta askıya alın.Ortam daha sonra hücreleri bir hücre süzgeci kapağından beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe süzer. Daha sonra, her bir toplama tüpüne 200 mikrolitre tamamlanmış RPMI 1640 ortamı. Biyolojik olarak tehlikeli madde kültürü için donatılmış bir tesiste bulunan bir alette ilgilenilen hücre alt kümelerini canlı sıralama sırasında tüm tüplerin buz üzerinde tutulması.İstenen süre boyunca sıralanan hücreler. Bu deneyde luminex ve PCR analiz analizlerinin ardından, bir HIV V bir gag peptit havuzu ile CD sekiz tükenmiş pbmc stimülasyonu, interferon gama üretimi için medyan 800 kat artışla sonuçlanır. İnterferon gama transkriptlerinin seviyesi, stimülasyondan sonra medyan on kat arttı.Bunda, HIV'e özgü CD dört T hücresi fonksiyon sonuçlarının in vitro analizi, interferon gama protein sekresyonu ile interferon gama mRNA seviyeleri arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstermektedir. İlginç bir şekilde, HIV tıkaç peptit havuzu tarafından stimülasyon, tetanozun bakteriyel antijenlerinden daha fazla interferon gama sekresyonu ile sonuçlanır. IL 13 sekresyonu ile elde edilen toksoid diğer sonuçlar, HIV ve tetanoza özgü CD dört T hücresi yanıtının farklı sitokin profillerini gösterir.PD bir yolağının blokajı genellikle herhangi bir antijen stimülasyonu olmadan sitokin sekresyonu üzerinde önemli bir etkiye sahip değildir, ancak interferon gama ve IL iki sekresyonunu arttırır. Hücreler HIV ile uyarıldığında, bir tıkaç peptit havuzları. CD üç hücreleri pbmc'den tükendiğinde, antijen stimülasyonuna yanıt olarak üretilen interferon gama veya IL iki yoktur.Bu veriler, interferon gama ve IL iki sekresyonunun HIV spesifik CD dört, T hücresi ve antijene özgü stimülasyona yanıt olarak indüklendiğini göstermektedir. Bu deney, PD bir blokajın interferon gama ve IL iki üzerindeki etkisini incelemek için gerçek sıralanmış CD dört T hücresi kullanılarak gösterilen iş akışını kullanır. Bu yöntemin önemli bir avantajı, immün düzenleyici moleküllerin HIV'e özgü CD dört T hücrelerinin antijen sunan hücrelerle etkileşimini nasıl düzenlediğini değerlendirme kapasitesidir.Burada protokol, stimülasyondan 48 saat sonra hücre içi sitokin boyaması yapmak üzere uyarlandı. Sonuçlar, monositlerin HIV bir gag peptit havuzları ile stimülasyondan sonra IL 12'nin birincil kaynağı olduğunu göstermektedir. Bu in vitro deneysel yaklaşım, T hücresi immünolojisi alanındaki araştırmacıların, insan örneklerinde Addison'a özgü thücrelerin etkili işlevini düzenlemede immün düzenleyici yolların etkisini keşfetmelerini sağlar.

in-vitro-assay-to-evaluate-impact-immunoregulatory-pathways-on-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tregs bağışıklık sisteminin güçlü bastırıcılar. Bunları tanımlamak için benzersiz yüzey belirteçleri bir eksikliği vardır, dolayısıyla, Tregs tanımları öncelikle fonksiyonel. Burada bir optimize...

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Bu video, önceden aktive edilmiş efektör T hücreleri tarafından indüklenen kanser hücrelerinde bir apoptoz testini göstermektedir. Bu hücrelerin floresan çekirdeklerle işaretlenmiş kanser hücreleri ile birlikte kültürlenmesiyle, kaspaz ile bölünebilir bir florojenik substrat eklenir. Apoptotik kanser hücreleri, çekirdeklerinde farklı bir renk gösterecek ve bu da çift floresansa yol açacaktır. Bu ikili floresan, apoptoz geçiren kanser hücrelerinin göstergesidir.

Önceden Aktive Edilmiş CD8 + T Hücrelerinin Kanser Hücrelerine Karşı Sitotoksisitesini İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

CD4+ Regülatör T hücreleri güçlü immün modülatörlerdir ve immün homeostazda önemli işlevlere hizmet ederler. Bu hücrelerin periferik kandaki azlığı, özellikle HIV-1 enfeksiyonu bağlamında fonksiyonel çalışmaları zorlaştırır. Burada, HIV-1 ile enfekte bireylerden alınan periferik kandan fonksiyonel CD4 + Treg'leri izole etmek ve genişletmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

Bu tür tek hücre düzeyinde sitokin üretimi tespit etmek ve T hücre yanıtlarının hem nicel hem de nitel karakterizasyonu sağlanmıştır interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, gibi fonksiyonel deneylerde sahip yeni kuşak varicella zoster karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini ölçmek için kullanılabilir virüsü (VZV).

Göbek Kordon Kanı Transplantasyonu takiben, IFN-γ değerlendirin ELISpot Tahlili Varisella-Zoster Virüs spesifik hücre-aracılı bağışıklık geliştirilmesi

Burada, basit bir manuel protein çökeltme adımı ve çevrimiçi kolon ekstraksiyonu kullanarak kurutulmuş kan lekelerinde immünosupresan takrolimusun miktarını belirlemek için yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (HPLC-MS/MS) testini açıklıyoruz.

LC-MS / MS kullanarak Kurutulmuş Kan Spotlar Immünosupresan Tacrolimus Niceleme

Bu protokol, HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre tabanlı tasarlanmış bağışıklığa sahip insanlaştırılmış bir kemik iliği/karaciğer/timus fare modeli oluşturma yöntemlerini açıklar.

Insanlaşmış Fare Modelinde HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre Tabanlı Engineered Bağışıklık

Burada, naif ve kronik lenfositik koryomenenjit virüsü ile enfekte farelerden izole edilen düzenleyici T (Treg) hücrelerinin fenotipini analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Ek olarak, Treg hücrelerinin baskılayıcı aktivitesini değerlendirmek için bir süreç sunuyoruz.

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Burada, hoşgörü Ekiminde teşvik ve içinde in vitro ve in vivo değerlendirmek için bir protokol farklı hücre alt kümeleri alıcıdan gelen süpresif kapasitesi ve donör veya eksojen antijenleri doğru alıcının bağışıklık durumu mevcut.

Vitro ve In Vivo değerlendirme T, B ve Myeloid hücrelerin süpresif etkinlik ve nakli alıcılardan gelen Humoral yanıt

Burada, sitotoksisik T lenfosit (CTL) yanıt olarak bir model tümör antijeni için immundominance muayene sağlayan bir akış sitometri tabanlı in vivo öldürme tahlil tarif. Biz bu zarif tahlil mekanik çalışmalar için ve ilaç etkinliği test için istihdam olabilir nasıl örnekler sunuyoruz.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Farmakolojik ajanların naif monosit türevli dendritik hücrelerden in vitro olarak tolerojenik dendritik hücreler üretme kapasitesini değerlendirmek ve otolog düzenleyici T hücresi üretimi ile potansiyellerini doğrulamak için bir prosedür tanımladık.

İnsan CD14+ Monositlerinden Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi için İmmünomodülatör Ajanları Test Etmek İçin Basit ve Etkili Bir Yöntem

Bu protokol, düzenleyici T hücrelerinin efektör T hücre çoğalması ve farklılaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için in vitro bir ortak kültür stratejisi sunar.

In Vitro Düzenleyici T Hücrelerinin Fonksiyonel Analizi: Proliferasyon ve Farklılaşmaya Odaklanma

Keşfedin HIV-spesifik CD4 T hücrelerinde sitokin salınımını ve immunoregülatör yolları in vitro analiz yöntemiyle. Bu teknik, antikor blokajının efektör fonksiyon üzerindeki etkisini değerlendirir.

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

Daha fazla video keşfet