Çip üzerinde Stres Kaynaklı Antibiyotik Duyarlılık Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bakterilerin ilgilenilen antibiyotiklere duyarlılığını hızlı bir şekilde belirlemektir. Bu, ilk önce log fazındaki bakterilerin bir mikroakışkan kanalın dibine hareketsiz hale getirilmesiyle elde edilir. İkinci adımda, antibiyotik ve canlı bir ölü floresan lekesi içeren ortam daha sonra yüksek bir akış hızında kanaldan itilir, bakterileri strese sokar ve antibiyotik hedefli biyokimyasal yollarını aktive eder.

Sonraki aşama kontrast ve floresan görüntüleri, bakteri canlılığını izlemek için bir saat boyunca her iki dakikada bir otomatik olarak toplanır, normalleştirilmiş bakteri ölüm yüzdeleri, deneyin her zaman noktasında elde edilen görüntülerden hesaplanır. Sonuç olarak, bakterilerin antibiyotik duyarlılık fenotipi, zaman içinde normalleştirilmiş hücre ölüm yüzdesindeki bir artıştan belirlenir. Bu tekniğin et suyu, seyreltme veya mikrokültür gibi mevcut fenotipik duyarlılık test yöntemlerine göre en büyük avantajı, yöntemimizin bakteri bölünmesinin izlenmesini gerektirmemesidir.

Bunun yerine, duyarlılık profillerine doğrudan mevcut küçük popülasyondan erişebiliriz. Bu tekniğin etkileri, yöntemin hızlı olması, kolayca çoğullanabilmesi ve otomatikleştirilebilmesi nedeniyle dirençli bakteriyel enfeksiyonların teşhisine yöneliktir PDMS katmanını oluşturmak için, yeni hazırlanmış bir PDMS viskoz karışımının bir saat sonra oda sıcaklığında bir vakum odasında gazdan arındırılmasıyla başlayın, alüminyum kalıbı önceden tanımlanmış bir DGA PDMS karışımı kütlesi ile doldurmak için bir ölçek kullanın. PDMS'yi kalıbın ortasına yavaşça dökün, kalıbı düz tutmaya ve pimleri açıkta tutmaya dikkat edin.

PDMS'yi gece boyunca 37 derecelik bir fırında kürleyin. Ertesi sabah, üst kalıp plakasını serbest bırakın ve akış hücresini monte etmek için kürlenmiş PDMS'yi kalıptan dikkatlice çıkarın. İlk olarak, cam pencereyi akış hücresi cebine yerleştirin.

Ardından, aktif tarafı yukarı bakacak şekilde akış hücresinin cebinin içindeki cam pencerenin üzerine kaplamalı bir cam sürgü yerleştirin. Kanal girişleri metal plakadaki açık deliklerle hizalanacak şekilde kanallar aşağı bakacak şekilde yeni oluşturulmuş PDMS katmanı. Katmanlar arasındaki havayı yavaşça dışarı itin ve ardından PDMS cam sürgü düzeneğini, PDMS cam pencereye bakacak şekilde çevirin.

PDMS kanal girişlerini metal plakadaki açık deliklerle üst üste getirin ve ardından baskı plakasını üstüne yerleştirin ve vidaları sıkın. Şimdi monte edilmiş akış hücresini mikroskobun altına yerleştirin, mikroskop büyütmesini 60 x'e ayarlayın ve log fazı bakterilerini, gece boyunca kültürlenmiş bakteri kolonisinin 50 mikrolitresini 50 mililitre taze MH iki et suyuna karıştırılmış akış hücresine yüklemek üzere hazırlamak için kanal konumlarını önceden hizalayın. Alt kültür santrifüjünden sonra 10 mililitre kültürü 1.650 kez G ve oda sıcaklığında iki dakika santrifüjledikten sonra 250 RPM ve 37 santigrat derecede çalkalanarak üç saat inkübe edin.

Daha sonra süpernatanı çıkarın ve peleti bir mililitre taze MH iki ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra, bir mililitrelik şırıngaya kısa bir boru uzunluğu takın ve boruyu bir mililitre ortamla yıkayın, bakteri süspansiyonunu çekerken hava kabarcıklarını önlemek için boruda az miktarda ortam bırakın. Daha sonra 0.7 mililitre bakteri şırıngaya yükleyin ve akış hücresinin iki kanalını bakteri hücre kültürü ile doldurun.

Kanalın şeffaflığı bakterilerle doldukça değişir. Daha sonra, bakterilerin slayt yüzeyine yapışmasını sağlamak için akış hücresini 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. Deney için çözeltileri hazırlamak.

İlk olarak, iki adet 60 mililitrelik şırıngayı taze hazırlanmış kontrol solüsyonu ve iki adet 60 mililitrelik şırıngayı taze hazırlanmış antibiyotik solüsyonu ile doldurun. Hava kabarcıklarını gidermek için şırıngaları hafifçe vurun ve ardından ilgili çözeltileri borunun ucundan iterek giriş borusunu takın. Reaktiflerin ışık kaynaklı bozulmasını önlemek için çözeltileri alüminyum folyoya sarılı tutun.

Şimdi deneysel çözelti içeren şırıngaları birer birer pompaya monte edin. Pistonlarını pompaya takmak için gerektiği kadar sıkın. Şırıngaları enine çubuk tutan şırınga ile yerine kilitleyin.

Pompa hızını dakikada bir mililitreye ve pompa hacmini 60 mililitreye ayarlayın ve tüm şırıngalardan sabit bir sıvı akışı görülene kadar pompayı yıkayın. Şimdi akış hücresini inkübatörden çıkararak ve önceden hizalanmış mikroskop aşamasına monte ederek deneye başlayın. Daha sonra, bir şırıngadan gelen bir giriş tüpünü ve bir atık şişesine giden bir çıkış tüpünü akış hücresi kanallarının her birine bağlayın.

Bu noktada, deney tamamen kurulmuştur ve başlamaya hazırdır. Faz kontrastı alma süresini 10 milisaniye ve floresan alma süresini 1600 milisaniye olarak ayarlayın ve ardından akışı başlatmadan önce her konum için faz kontrastı ve floresan görüntüleri elde edin. Akış görüntüsünün başlamasından önce, kanal içindeki yüklü bakteri yoğunluğunun yüksek olması nedeniyle kanalın dibine odaklanmanın mümkün olmayabileceğini lütfen unutmayın.

Şimdi sıvı akışını başlatın. Hemen mikroskobun kanalların altına odaklandığını kontrol edin. Ardından, akışın ilk dakikası içinde hedef alanların faz kontrastı ve floresan görüntülerini alın.

İlk görüntü kümesinden sonra 60 dakikalık akış gerçekleşene kadar her iki dakikada bir görüntü alın. Deneyin düzgün bir şekilde ilerlediğinden emin olmak için gerektiği gibi yeniden odaklanma, elde edilen faz kontrastı ve floresan verileri incelenebilir. Bu veri örneğinde, birinci ve ikinci kanallara duyarlı bir suş yüklenirken, üçüncü ve dördüncü kanallarda bir direnç gerinim bulundu.

Deneyin sonunda, ardışık çamaşır suyu ve su uygulamasıyla bir temizleme döngüsü çalıştırın. Dört adet 20 mililitrelik şırıngayı 10 mililitre% 10 ağartıcı solüsyonu ve dört adet 60 mililitrelik şırıngayı di su ile doldurun. Köpürme işleminden sonra, ağartıcı dolgulu şırıngaları akış hücresine takın ve pompa hızını dakikada bir mililitreye ve pompa hacmini üç mililitreye ayarlayın.

Pompayı üç dakika çalıştırın, kanalın temizliğini ekranda izleyin. Üç dakika sonra, çamaşır suyu şırıngalarını su şırıngalarıyla değiştirin ve dakikada bir mililitre hızla 30 dakika çalıştırın. Son olarak, görüntü işleme yazılımını kullanarak her görüntüdeki bakteri sayısını sayın.

NF'nin floresan görüntü sayısında sayılan ölü bakteri sayısına eşit olduğu bu formülü kullanarak normalleştirilmiş bakteri hücre ölüm yüzdesini zamanın bir fonksiyonu olarak hesaplayın. Ve NP, faz kontrast görüntüsünden belirlenen toplam bakteri sayısına eşittir. Burada gösterilen görüntüler, duyarlı bir staphylococcus aria suşunun bir mikroakışkan akış hücresi içindeki oksasilin zamana bağlı tepkisini göstermektedir.

Bu kadranlar, deneye başladıktan bir dakika sonra ve burada gösterilen karşılık gelen floresan görüntüleriyle bir saat sonra elde edilen faz kontrast görüntülerini gösterir. Deneyin sonunda, kanal içindeki hücre ölümünü ve tek tek epoksi kaplı slaytların stokastik homojenliği nedeniyle suşun antibiyotiğe duyarlılığını gösteren floresan bakteri sayısında önemli bir artış gözlenir. Bu varyasyonu açıklamak için sürekli stres altında deney boyunca bakteri hücre kaybı olabilir, ölü bir hücre popülasyonunun her floresan görüntüsü, toplam hücre popülasyonunu aynı zaman noktasının bir saniyesine kadar veren birlikte elde edilen faz kontrast görüntüsü ile normalleştirilir.

Bu büyütmeler, sayma algoritmasının, floresan görüntülerdeki tek tek bakterileri doğru bir şekilde saymada, yoğun nüfuslu faz kontrast görüntülerine göre daha başarılı olduğunu göstermektedir. Ölü hücre lekesi, tek tek ölü bakteriler için yüksek bir floresan kontrastı verir. Floresan bakteri sayısı nadiren toplam sayının% 5'ini aştığından, her bakteri arka plana göre çok parlaktır.

Bu nedenle, floresan bakteriler yüksek derecede doğrulukla kolayca sayılabilir. Örneğin, bu deneyde tespit edilen toplam 5.828 bakteriden kırmızı ile vurgulanan 174'ünün burada öldüğü belirlendi. Üç farklı deney için normalleştirilmiş MSSA ve Mr.RSA verileri, dirençli suşlar için beklendiği gibi gösterilmiştir, normalleştirilmiş hücre ölümünün büyüklüğü %0,5'ten düşüktür ve deney boyunca değişmez.

Bununla birlikte, duyarlı suşlar, deneyin sonunda hücre ölümünde sabit bir artış ve %1'den daha yüksek bir değer gösterir. Duyarlı suşlar için hücre ölümünün başlaması deneyler arasında biraz değişir, ancak genellikle 10 ila 30 dakika arasında gerçekleşir. Antibiyotiğe dirençli patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman septik teknik gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

Bu teknik, araştırmacıların bakterilerin strese nasıl tepki verdiğini keşfetmelerinin önünü açacak ve yeni hızlı teşhislerin geliştirilmesini ve yeni ilaçların keşfini etkileyecektir.