Kovalent Öz-monte tabakalı Yaklaşım Kullanarak Yüzeyler üzerinde BMP-2 bağlanması

Bu prosedürün genel amacı, BMP iki molekülünü biyoaktivitelerini kaybetmeden yüzeylere kovalent olarak bağlamaktır. Bu, önce fiziksel buhar biriktirme yoluyla bir alt tabaka üzerinde altın bir tabaka oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım, kendi kendine monte edilmiş bir mu NHSA iki işlevli NHS Tiyol bağlayıcı tek tabakası oluşturmaktır.

Daha sonra, RH BMP iki, bağlayıcıya kovalent olarak bağlanır. Son adım, bağlı olmayan BMP ikisini sonikasyon ile çıkarmaktır. Sonuç olarak, BMP iki'nin yüzeylere başarılı bir şekilde bağlandığını göstermek için bir antikor bağlama deneyi kullanılır ve yüzeye bağlı BMP iki'nin biyolojik aktivitesi, SMA 1 5 8 fosforilasyonu analiz edilerek hücrelerde belirlenir.

Bu yöntem, büyüme faktörü biyolojisi alanında, büyüme faktörlerinin hücre yüzeyindeki reseptörlerine ilk bağlanmasının sinyal tepkilerini tetiklemek için yeterli olup olmadığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek laboratuvarımın iki üyesi, Teresa Paul ve Elizabeth Schwab olacak. Bu işleme başlamak için, cam kapak kızaklarını hassas mendillerle temizleyin ve bire bir etil asetat ve metanol karışımı içinde beş dakika boyunca sonikleştirin.

Sonikasyondan sonra, substratları metanol ile durulayın ve azot akışı altında kurutun. Temiz alt tabakaları bir püskürtme kaplama cihazına yerleştirin ve hazneyi boşaltın. 60 saniye boyunca püskürterek en üstteki krom oksit tabakasını krom hedefinden çıkarın.

Daha sonra alt tabakayı 10 nanometrelik bir krom tabakası ile kaplayın ve ardından 40 nanometrelik bir altın tabaka ile kaplayın. Bittiğinde, altın alt tabakaları hazneden çıkarın ve bir kenara koyun. Altın substratları iki boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişeye aktarın ve nitrojen atmosferi altında dört saat boyunca oda sıcaklığında DMF'de bir milimolar M-U-N-H-S'de inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, substratları iki dakika boyunca DMF'de sonikasyona tabi tutun. Bunları DMF ve metanol ile durulayın ve nitrojen akışı altında kurutun. Mililitre başına 3.5 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için RHB MP iki stok çözeltisini PBS'de bir molar sodyum klorür ile seyreltin.

Bu çalışma solüsyonunu kullanımdan hemen önce steril 10 milimolar potasyum hidroksit ile pH 8.5'e ayarlayın. A-P-D-M-S halkasını numunenin üzerine yerleştirin. Yalnızca alt tabaka yüzeylerinin inkübasyon çözeltisine maruz kaldığından emin olmak için alt tabakayı altı oyuklu bir plakaya aktarın.

Daha sonra işlevselleştirilmiş M-U-N-H-S substratlarını RHB MP iki çalışma solüsyonu ile gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyon süpernatantını çıkardıktan sonra, PBS'ye bir molar sodyum klorür ekleyin ve substratları iki dakika boyunca sonikleştirin. Bittiğinde, antikorun spesifik olmayan emilimini engellemek için substratları PBS'de steril bir molar sodyum klorür ile üç kez yıkayın.

Alt tabakaları oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS'de% 5 BSA'da inkübe edin. Daha sonra substratları oda sıcaklığında bir saat boyunca bir anti BMP iki antikor çözeltisi ile inkübe edin, bittiğinde substratları PBS ile iki kez yıkayın ve 30 saniye boyunca sonikleştirin. Daha sonra, substratları bir HRP konjuge ikincil antikor çözeltisi içinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve daha sonra PBS ile iki kez yıkayın.

570 nanometrede HRP enzimatik aktivitesini ölçmek için bol miktarda grip kırmızısı tahlili kullanın, bir plaka okuyucu tohumu ile bir kez 10 ila beşinci ağız C, iki C, 12 miyoblast, büyüme ortamındaki altı kuyucuklu plakada kuyu başına ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin. Plakalar inkübatörden çıkarıldıktan sonra, ortamı kuyucuklardan aspire edin ve kısa süreli sinyal indüksiyonunun araştırılması için işlevselleştirilmiş BMP iki substrat yüzeyine tohumlamadan önce hücreleri serumsuz DMEM'de üç ila beş saat aç bırakın. Ortamı 200 mikrolitre taze serumsuz DMEM ile değiştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübasyonun ardından ince uçlu cımbız kullanarak hareketsiz hale getirilmiş BMP'yi iki substratı hücrelerin üzerine yerleştirin.

Alt tabakaları nazikçe çıkarın ve ortamı bir pipetle aspire edin. Daha sonra hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve uzun süreli biyolojik aktivitenin analizi için jel elektroforezi ve western blotting kullanarak hücre tepkilerinin analizine devam edin. Hücreleri daha önce tarif edildiği gibi yüzeylere yerleştirin ve altı gün boyunca% 2 FBS'de% 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de kültürleyin.

Kuluçka sonrası. RH BMP'yi doğrulamak için hücreleri floresan mikroskobu ile görüntüleyin: immobilize RH BMP sunan iki bağlanma yüzeyi, ikisi bir BMP, iki spesifik antikor ve HRP ile konjuge edilmiş bir ikincil antikor ile inkübe edildi. Hücre stimülasyonundan önce ve sonra yüzey immobilize RH BMP iki veya I BMP iki tespit edildi.

Burada gösterilen, anti BMP iki IgG tarafından tanınan bir onayda RH BMP iki'nin yüzeye başarılı bir şekilde bağlanmasıdır. Yüzeyde hareketsizleştirilmiş RH BMP iki, amli gribi kırmızı chole metrik testi kullanılarak ölçüldü ve veriler, hücre stimülasyonundan sonra, proteinin hala yüzeyde tespit edildiğini, hareketsizleştirilmiş RHB MP iki sunan yüzeylere hücre tepkilerinin değerlendirildiğini ve işlenmemiş altın substratların etkisi ile karşılaştırıldığını gösteriyor. Burada, C iki C 12 hücresi, üstten yaklaşan RHB MP iki işlevselleştirilmiş yüzey tarafından 30 dakika boyunca uyarıldı.

Bu modelde, BMP iki, hücrelerin çok çekirdekli myo tüplerine farklılaşmasını inhibe eder ve osteoblast fenotiplerini indükler. BMP iki sinyal yolunun aşağı akış raportörleri olan SMAD 1 5 8'in aktivasyonu, burada gösterildiği gibi batı blotlama ile analiz edilir. SM fosforilasyonu, I BMP iki tarafından 30 dakikalık stimülasyondan sonra gözlenirken, işlenmemiş altın numunelerine maruz kalan hücrelerde SMAD 1 58'in fosforilasyonu meydana gelmez.

Bu sonuç, immobilizasyon işleminin BMP iki kısa vadeli aktiviteyi değiştirmediğini ve I BM P iki'nin uzun vadeli osteojenik farklılaşmayı etkileyip etkilemediğini belirlemek için smad sinyallemesinde erken adımları tetiklediğini göstermektedir. Alkalin fosfatazın ekspresyon seviyesi, bir chole metrik testi ile araştırıldı. C iki C 12 hücresinin alkalin fosfataz aktivitesi, hücreler altı gün boyunca düz altın ve IBP iki yüzey üzerinde inkübe edildikten sonra ölçüldü.

I BM P iki yüzeyinde kültürlenen hücrelerin lizatlarındaki alkalin fosfataz aktivitesi, kontrole kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir absorpsiyon göstermiştir. Bu sonuç, IBMP iki'nin, IBP iki'nin etkisini araştırmak için C iki C 12 hücresinde alkalin fosfataz ekspresyonunu indüklediğini ortaya koymaktadır. Miyojenez C'de, iki C 12 hücresi doğrudan altın üzerine veya işlevselleştirilmiş yüzeylere kaplandı ve düşük serum koşulları altında kültürlendi.

Altı gün sonra, burada gösterildiği gibi miyozin ağır zincirinin boyanması yapıldı. C iki C 12 hücresi, altın substratlar üzerindeki hücrelerin aksine I BM P iki varlığında miyozin ağır zincirli pozitif miyo tüpleri oluşturamadı. Bu prosedürü takiben, ek soruları cevaplamak için BMP iki'nin altın nanopartiküller üzerinde hareketsiz hale getirilmesi gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Örneğin, sinyal tepkilerini verimli bir şekilde tetiklemek için yerel olarak hareketsiz BMP iki'nin ne kadarına ihtiyaç duyulduğu.