Name: Kovalent Öz-monte tabakalı Yaklaşım Kullanarak Yüzeyler üzerinde BMP-2 bağlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Keşfedin BMP-2'nin yüzeylere kovalent bağlanması için kendi kendine monte olan monolayer yöntemini. Bu teknik, büyüme faktörü biyolojisinde hücre zarındaki sinyal mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz onun tür destek için Prof JP Spatz (Biyofizik Kimya Bölümü, Heidelberg Üniversitesi ve Yeni Malzemeler Biyosistem Bölümü, Akıllı Sistemler Max Planck Enstitüsü, Stuttgart) teşekkür ederim. Max-Planck-Gesellschaft ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (EAC-A DFG SFB/TR79.) Gelen mali destek de büyük ölçüde kabul edilmiştir.

1.. 11-Mercaptoundecanoyl-N-hidroksisüksinimid ester (MU-NHS) sentezi <ol><li> Oda sıcaklığında (RT) 40 ml diklorometan (pa), 10 ml aseton (PA) (dimetilamino) piridin 1 g 11-mercaptoundecanoic asit - bir 500 mg N-hidroksisüksinimid çözeltisi ve 30 mg 4 damla damla ilave edildi. </li><li> 0 ° C&#39;ye soğutun ve reaksiyon, damla damla 1.1 g N, (azot atmosferi altında) 10 ml diklorometan içinde N &#39;-disikloheksilkarbodiimid ekleyin. 1 saat boyunca düşük ısıda reaksiyonu Ol ve daha sonra gece boyunca oda sıcaklığında karıştırın. </li><li> Çökeltiyi filtre edin ve indirgenmiş basınç altında kurutun. 1:1 &#39;lik bir oranda petrol benzen ve etil asetat (pa) ile flaş kromatografisi ile ürünü saflaştırmak. </li></ol> 2. Homojen Altın Katmanlar hazırlanması <ol><li> Hassas mendil ile ve etil asetat (pa) ve metanol (pa) 1:1 &#39;lik bir karışımını içeren bir çözelti içinde 5 dakika boyunca ses dalgalarına maruz bunları temiz cam lameller. Rinse, metanol ile alt-tabakalar ve azot akışı altında kurutulur. </li><li> Püskürtmeli kaplama cihazı içinde temiz yüzeylerde yerleştirin. Odasını boşaltın. 60 saniye için püskürtme ile krom hedeften en üst krom oksit katmanı kaldırın. Metal kiriş ve bir 40 nm altın tabakası ile kaplanması, ardından bir 10 nm krom tabaka ile kaplama, onları altında numuneler. </li></ol> 3. BMP-2 yüzey immobilizasyonu <ol><li> Yaklaşık 1 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar N, MU-NHS, N-dimethlyformamide (DMF) içinde eritin ve azot atmosferi altında 4 saat boyunca oda sıcaklığında MU-NHS çözeltisi içinde altın substratlar inkübe edin. </li><li> 2 dakika boyunca DMF içinde sonikasyon yüzeyler, DMF ve MeOH ile durulayın ve azot akışı altında kurutulur. </li><li> 100 ug / ml (-80 ° C&#39;de saklayın alikotları) &#39;lik bir konsantrasyonda steril 4 mM HCI rhBMP-2&#39;ye ait bir stok çözelti hazırlayın. Çalışma seyreltileri (3.5 ug / ml) için, PBS / NaCl (PBS, 1 M NaCl ihtiva eden) ve bir de stok solüsyonu seyreltikkullanımdan hemen önce pH 8.5 &#39;e djust. </li><li> Gece boyunca 4 ° C&#39;de rhBMP-2 çalışma çözeltisi içinde MU-NHS işlevselleştirilmiş yüzeyleri inkübe edin. Kuluçka Süpernatantı. Sonikasyon 2 dakika boyunca PBS / NaCI yüzeyler ve steril PBS / NaCI ile 3 kez yıkayın. </li></ol> 4. Yüzey Karakterizasyonu <ol><li> Antikorun spesifik olmayan bir şekilde emilmesi bloke etmek için,% 5 BSA ile inkübe yüzeyleri (w / v) bir anti-BMP-2 antikoru (1:100 içinde% 1 (ağırlık / hacim ile inkübasyon ve ardından oda sıcaklığında 1 saat için PBS solüsyonunda oda sıcaklığında 1 saat için) BSA / PBS çözeltisi). PBS ve 30 saniye süreyle sonikasyon ile iki kez yüzeyleri yıkayın. </li><li> Daha sonra PBS ile iki kere yıkayın, oda sıcaklığında 30 dakika için HRP ile konjüge edilmiş sekonder antikor (1:1000 içinde% 1 (w / v) BSA / PBS çözeltisi) ile alt-tabakaların inkübe edin. </li><li> Bir levha okuyucu ile 570 nm de HRP enzimatik aktivitesinin ölçülmesi için Ampliflu kırmızı deneyi kullanarak. </li></ol> 5. Biyolojik Aktivite Analizi <ol><li> 6-çukurlu pl içinde göz başına 1 x 10 tohum 5 fare C2C12 miyoblastlardır% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 37 ° C /% 5 CO2 seviyesinde 24 saat boyunca inkübe ile takviye piruvat içeren yüksek glukoz DMEM oluşan büyüme ortamı içinde Ateş,. </li><li> Hareketsiz BMP-2 dekore yüzeylere tohumlanmasından önce 3-5 saat boyunca serumsuz DMEM hücreleri açlıktan. </li><li> Kısa süreli sinyal indüksiyon araştırılması için, 200 ul taze serum içermeyen DMEM ile orta yerine ve hücreler üzerinde hareketsizleştirilmiş BMP-2 yüzeyleri yerleştirin. Yüzeyi çizmemek için ince uçlu cımbız ile ele alınmalıdır. </li><li> Yumuşak yüzeyleri çıkarın ve bir pipet ile ortam aspire, PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Hücre yanıtlarının analizi geçin. </li><li> Uzun süreli biyolojik aktivite, levha hücrelerin analizi için üzerine, altı gün boyunca düşük serum koşullarına (% 2 FBS) içinde 37 ° C /% 5 CO2 ile yüzeyler ve kültür onları. </li></ol>

<ol><li>Helm, G., Andersson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summary+statement%3A+Bone+morphogenetic+proteins%3A+Basic+science%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science.</a> Spine. 27 (16S), S9(2002).</li>
<li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).</li>
<li>Reddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs%3A+from+bone+morphogenetic+proteins+to+body+morphogenetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).</li>
<li>Rengachary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+basic+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Focus%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: basic concepts.</a> Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).</li>
<li>Schlunegger, M., Grütter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+feature+revealed+by+the+crystal+structure+at+2.2+%C3%85%3B+resolution+of+human+transforming+growth+factor-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2.</a> Nature. 358, 430-434 (1992).</li>
<li>Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+bone+morphogenetic+protein-2+at+2.7+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution.</a> J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).</li>
<li>Nimni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypeptide+growth+factors%3A+targeted+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polypeptide growth factors: targeted delivery systems.</a> Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).</li>
<li>Wozney, J., Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein+and+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+bone+formation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Related+Res%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair.</a> Clin. Orthop. Related Res. 346, 26(1998).</li>
<li>Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+BMP+inhibitors+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">BMP and BMP inhibitors in bone.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).</li>
<li>Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+BMP-2-BRIA+ectodomain+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).</li>
<li>Keller, S., Nickel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recognition+of+BMP-2+and+BMP+receptor+IA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).</li>
<li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+receptor+signaling%3A+transcriptional+targets%2C+regulation+of+signals%2C+and+signaling+cross-talk%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).</li>
<li>Nohe, A., Hassel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+bone+morphogenetic+protein+%28BMP%29+receptor+oligomerization+determines+different+BMP-2+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways.</a> J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).</li>
<li>Sieber, C., Kopf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li>
<li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery%3A+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li>
<li>Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+delivery+of+growth+factors+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Localized delivery of growth factors for bone repair.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).</li>
<li>Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+immobilization+of+epidermal+growth+factor+onto+culture+substrates+for+the+selective+expansion+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells.</a> Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).</li>
<li>Gonçalves, R., Martins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivity+of+immobilized+EGF+on+self-assembled+monolayers%3A+Optimization+of+the+immobilization+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+A.+94A%22%5BJournal%5D)">Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).</li>
<li>Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li>
<li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li>
<li>Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+converts+the+differentiation+pathway+of+C2C12+myoblasts+into+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage.</a> J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).</li>
<li>Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+release+from+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Growth factor release from tissue engineering scaffolds.</a> J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).</li>
<li>Uludag, H., D'Augusta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+proteins+with+biomaterial+carriers%3A+a+correlation+between+protein+pharmacokinetics+and+osteoinduction+in+the+rat+ectopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model.</a> J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).</li>
<li>Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+BMP-2+for+functionalization+of+titanium+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces.</a> Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).</li>
<li>Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+decorated+silk+fibroin+films+induce+osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).</li>
<li>Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+systems+for+bone+growth+factors+-+the+new+players+in+skeletal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration.</a> J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).</li>
<li>Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+growth+factor+immobilization+strategies+for+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration.</a> Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).</li>
<li>Crouzier, T., Fourel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+BMP-2+from+a+soft+biopolymeric+film+unveils+its+activity+on+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration.</a> Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).</li>
<li>Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+morphogenetic+protein+2+contains+a+heparin-binding+site+which+modifies+its+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity.</a> European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).</li>
<li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li>
<li>Kato, K., Sato, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+histidine-tagged+recombinant+proteins+onto+micropatterned+surfaces+for+cell-based+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays.</a> Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).</li>
<li>Martins, M., Curtin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+designed+surfaces+for+blood+deheparinization+using+an+immobilized+heparin-binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide.</a> J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).</li>
<li>Limbut, W., Kanatharana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+capacitive+immunosensors+based+on+self-assembled+monolayers+formed+from+thiourea%2C+thioctic+acid%2C+and+3-+mercaptopropionic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).</li>
<li>Patel, N., Davies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+protein+molecules+onto+homogeneous+and+mixed+carboxylate-terminated+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).</li>
<li>Hu, J., Duppatla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+PEGylation+of+bone+morphogenetic+protein-2+cysteine+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues.</a> Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).</li>
<li>Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD+modified+polymers%3A+biomaterials+for+stimulated+cell+adhesion+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond.</a> Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).</li>
<li>Cao, T., Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+spacer+length+effect+on+immobilized+Escherichia+coli+pili-antibody+molecular+recognition+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM.</a> Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).</li>
<li>Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+immobilize+bioactive+proteins%2C+including+bone+morphogenetic+protein-4+%28BMP-4%29%2C+on+titanium+alloy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy.</a> Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokolde, biyoaktif rhBMP-2 ile fonksiyonelleştirilmiş yüzeylerin hazırlanmasını tarif etmektedir. , RhBMP-2 protein 2) kovalent immobilizasyon altın yüzeyi üzerinde bir çift fonksiyonlu bağlayıcı, kendi kendine bir araya tek tabaka (SAM) 1) başlangıç ​​sistemi: Bu yaklaşım, iki adım içermektedir. Önceki çalışmada, iki fonksiyonlu linker ile büyüme faktörü bağlayıcı etkili doğrulanmış ve yüzey hareketsizleştirilmiş rhBMP-2 biyolojik aktivitesini muhafaza 19 olduğunu gösterdi. Immobilize bir formda sunulm...

Kemik morfogenetik protein 2 (BMP-2), transforme edici büyüme faktörü (TGF-β) ailesi ve de novo kemik oluşumunun indükleyici hem de embriyonik gelişim ve yetişkin sırasında çeşitli dokuların düzenleyicisi olarak işlev görür 1-3 homeostasis bir üyesidir. Biyolojik olarak etkin olan homodimerik BMP-2 proteininin her bir monomer son derece tüm BMP 4 korunan bir &quot;sistein düğüm&quot; motifi içerir. Yedinci sistein iki monomer 5,6 arasında moleküller arası bir bağ oluşturan, dimerizasyon katılır ise yedi sistein kalıntılarının altı, her bir monomerin kararlı moleküller arası disülfid bağı oluşturur. Bu yüksek ölçüde korunmuş sistein düğüm BMP-2 proteininin üç boyutlu yapısını tanımlar ve bu ısı, denatüranlar ve asidik pH 7-9 karşı direnç gibi eşsiz özelliklerini belirler. BMP-2, böylece sinyal iletiminin uyarılması, serin / treonin kinaz zar reseptörlerine bağlanan <sup&gt; 10-12. Reseptör oligomerizasyon moduna bağlı olarak, farklı bir sinyal yollar aktive edilir: a Smad-bağımlı yolu Smad karmaşık nükleer translokasyonu ve transkripsiyon aktivasyonu reseptör fosforilasyon ile aktif hale sonuçları ise bir Smad-bağımsız bir sinyal kaskadı, p38 aracılığı ile sinyalizasyon alkalin fosfataz, indüklenmesine yol açacaktır gibi farklılaşma inhibitörü (Id) 12-14 gibi belirli hedef genler,. Kemik, BMP-2, böylece iyileşmesi ve kemik de novo oluşumunu teşvik edici, osteoblastlar içine mezenkimal kök hücrelerin farklılaşmasını indükler. Şu anda, rekombinant BMP-2 sitelerinin kırık iyileşmesini artırmak için klinik olarak uygulanır ifade edilmiştir. Kemik doku mühendisliğinde yaygın bir strateji, lokal verme sistemleri ile karşılaştırıldığında daha az invaziv bir enjekte edilebilir büyüme faktörleri, kullanılmasıdır. Bununla birlikte, in vivo çalışmalarda ve klinik uygulamalar göstermiştir ki, sahip olduğu kısa biyolojik yarı-ömür, spesifik olmayan locAdalet ve Hafıza ve BMP-2 hızlı lokal temizleme çeşitli lokal ve sistemik sorunlara ektopik 15 yol açabilir. Bu nedenle, etkili bir sunum, malzeme içinde veya üzerinde BMP-2&#39;nin sürüklenmesini veya immobilizasyon elde etmek için, hedef bölgede, yerel ve sürekli uygulama için de gereklidir. Sürekli teslim gibi fiziksel olarak yakalanmalarında, adsorpsiyon ya da iyon kompleks 16 gibi kovalent olmayan bir tutma yaklaşımlar ile elde edilebilir. Bununla birlikte, bilinen bu moleküllerin 17 denatürasyonda yüzeylerine proteinlerin spesifik olmayan adsorpsiyon olabilir neden olur. Büyüme faktörlerinin bağlanması kovalent için, desteklerin farklı son on yıl içinde geliştirilmiştir. Örneğin, proteinin amino ya da karboksil grupları hedefleyen iki işlevli bağlama moleküllerinin kullanılması, zorunlu olarak hareketsiz hale elde etmek için protein modifikasyonu gerektirmeyen yaklaşımın bir türüdür. Aslında, ise protein modifikasyonu, protein yönünü kontrol etme avantajını sunmaktadıryapay etki, peptit etiketleri ve bölgeye özgü zincirlerinin giriş büyüme biyolojik aktivitesi 17 faktörleri değiştirebilir. Bu durumda, bağlı destek malzemesi ile etkileşim için denatürasyon aşmak için, yüzeyler istenilen faktörü 18 bağlanması ve ardından bir bağlayıcı molekülün bir kendi kendine monte tek tabaka (SAM) ile, örneğin, önceden işlevselleştirilebilir. Bu serbest amin kalıntıları hedefleyerek kovalent bir yüzey üzerine BMP-2 kılınması için bir SAM tabanlı bir yaklaşım kullandık ve hareketsizleştirilmiş protein kısa ve uzun süreli biyolojik aktiviteye 19 hem de muhafaza göstermiştir. Bu protokol, hücre membranında meydana gelir ve osteojenik sinyalizasyon sorumlu hücre içi sinyal düzenleyen mekanizmaları üzerinde in vitro çalışmalar için hücrelere BMP-2 sunmak için basit ve verimli bir yol sağlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>N-hidroksisüksinimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4- (dimetilamino) piridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>522805</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>AppliChem</td><td>A2282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>11-merkaptoundekanoik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Diklormetan</td><td>Merck</td><td>106050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N, N'-disikloheksilkarbodiimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D80002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Petrol benzen</td><td>Merck</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam lameller</td><td>Carl Roth</td><td>M 875</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylacetate</td><td>AppliChem</td><td>A3550</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>4627</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N, N-dimetilformamid</td><td>Carl Roth</td><td>T921</td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>355-BM</td><td>Taşıyıcısız; E.coli</td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>&nbsp</td></tr> olarak ifade edilir;<tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli (dimetil siloksan) (PDMS)</td> <td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silikon elastomer kiti</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-rhBMP-2</td><td>Sigma</td><td>B9553</td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Ampliflu Kırmızı test</td><td>Sigma</td><td>90101</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) (1x), sıvı</td><td>Gibco</td><td>41966</td><td>Yüksek glikozlu</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>F7524</td><td>Steril filtreli, hücre kültürü test edilmiş</td></tr><tr><td>Kalem / Strep</td><td>Gibco</td><td>15140</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsin% 0.05 (1x) EDTA 4Na</td><td>Gibco</td><td>25300</td> <td>ile &nbsp;</td></tr><tr><td>Glisin (0.1 M)</td><td>Riedel-de Ha&euml; n</td><td>33226</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (% 1)</td> <td>Sigma</td><td>I8896</td><td>Lizis tamponu (ALP testi) 19</td></tr> <tr><td>Magnezyum klorür (MgCl2) (1 mM)</td> <td>Carl Roth</td><td>HNO3.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Çinko klorür (ZnCl2) (1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>3533.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-nitrofenilfosfat (pNPP)</td><td>Sigma</td><td>S0942</td><td>Fosfataz substrat</td></tr><tr><td>Anti-misin ağır zincir (MHC)</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası, Iowa Üniversitesi</td><td>MF20</td><td>Monoklonal antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi anti-fare IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Ultrsonic banyosu (Sonorex Super RK 102H), Frekans 35 kHz</td><td>BANDELIN electronic GmbH Co. KG</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MED 020 Sputtercoating sistemi</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td>Kaplama koşulları Cr: 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 sn Au: 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 sn</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 Plaka okuyucu</td><td>Tecan</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

kovalent Öz-monte tabakalı yaklaşım kullanarak yüzeyler üzerinde bmp-2 bağlanması

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Kemik morfogenetik protein 2 (BMP-2), kemik dokusunun hücre dışı matris içinde gömülü bir büyüme faktörüdür. Bu şekilde iyileşme ve de novo kemik oluşumunu stimüle osteoblastlar içine mezenkimal hücre farklılaşmasının tetikleyici olarak BMP-2 davranır. Iskeleleri ile birlikte rekombinant insan BMP-2 (rhBMP-2) klinik kullanımı sunum moduna göre, son tartışmalar yükseltti ve miktarı teslim edilecek. Burada sunulan protokol hücreler üzerinde in vitro çalışmalar için BMP-2 sunmak için basit ve verimli bir yol sağlamaktadır. Bir heterobifonksiyonel bağlayıcının bir öz monte tek tabaka oluşturmak üzere nasıl tarif ve rhBMP-2 kovalent immobilizasyon elde etmek için daha sonraki bağlanma aşamasını göstermektedir. Bu yaklaşımla, bu proteinin biyolojik aktivitesini muhafaza ederken, BMP-2 sürekli bir sunum elde etmek mümkündür. Aslında, BMP-2 yüzey hareketsiz spesifik reklamlar önleyerek hedef inceleme sağlar:orption, büyüme faktörü miktarının azaltılması ve süre, en önemlisi de, yüzeyden kontrolsüz salınmasını engellemektedir. Hücreler, kovalent olarak hareketsizleştirilmiş rhBMP-2 sunulması yüzeylere maruz kaldıkları zaman, BMP-2 tetiklediği hem kısa hem de uzun süreli sinyal olaylarının BMP-2 ile uyarılması, hücre tepkileri ile ilgili in vitro çalışmalar için bu yaklaşım uygun hale yer alıyor.

Bir biyolojik belirsiz fakat kimyasal akort sistemi sağlar beri bizim kurulum, altın yardımcı madde olarak seçildi. Dahası, kendi kendine bir araya tek katmanlarının uygulanması pek çok avantaj içerir: bunların fonksiyonel uç-gruplar ayrıca modifiye edilebilir ise SAMs kendiliğinden, metaller ve az kusurları ile bir şekilde tek tabakaları üzerinde kendi "baş grupları" ile adsorbe. Böylece kontrollü ama son derece uyarlanabilir şekilde 20 arabirimi özelliklerini uyarlamak için bir platform sağlar. <p class...

Bu yüzeylerde BMP-2 etkin hareketsiz hale getirmeye yönelik bir metodu tarif etmektedir. Yaklaşımımız serbest amin kalıntısı ile BMP-2 bağlanması kovalent elde etmek için bir kendi kendine monte tek tabaka oluşumuna dayanır. Bu yöntem, hücre membranında sinyalini incelemek için yararlı bir araçtır.

Kovalent Öz-monte tabakalı Yaklaşım Kullanarak Yüzeyler üzerinde BMP-2 bağlanması

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Bu prosedürün genel amacı, BMP iki molekülünü biyoaktivitelerini kaybetmeden yüzeylere kovalent olarak bağlamaktır. Bu, önce fiziksel buhar biriktirme yoluyla bir alt tabaka üzerinde altın bir tabaka oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım, kendi kendine monte edilmiş bir mu NHSA iki işlevli NHS Tiyol bağlayıcı tek tabakası oluşturmaktır.Daha sonra, RH BMP iki, bağlayıcıya kovalent olarak bağlanır. Son adım, bağlı olmayan BMP ikisini sonikasyon ile çıkarmaktır. Sonuç olarak, BMP iki'nin yüzeylere başarılı bir şekilde bağlandığını göstermek için bir antikor bağlama deneyi kullanılır ve yüzeye bağlı BMP iki'nin biyolojik aktivitesi, SMA 1 5 8 fosforilasyonu analiz edilerek hücrelerde belirlenir.Bu yöntem, büyüme faktörü biyolojisi alanında, büyüme faktörlerinin hücre yüzeyindeki reseptörlerine ilk bağlanmasının sinyal tepkilerini tetiklemek için yeterli olup olmadığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek laboratuvarımın iki üyesi, Teresa Paul ve Elizabeth Schwab olacak. Bu işleme başlamak için, cam kapak kızaklarını hassas mendillerle temizleyin ve bire bir etil asetat ve metanol karışımı içinde beş dakika boyunca sonikleştirin.Sonikasyondan s

covalent-binding-bmp-2-on-surfaces-using-self-assembled-monolayer

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Burada kemik morfogenetik protein (BMP) sabit hücreler sinyal görselleştirmek için antikor kombinasyonu ile yakınlık ligasyon Assay (PLA), nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu teknik bize BMP4 uyarımı altında efektör-kompleksleri aktif endojen BMP nükleer birikimi takip etmek ve zaman içinde bunların seviyelerini ölçmek için izin verdi.

Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi

Çok çeşitli tek molekülleri kovalent olarak bir AFM ucuna bağlamak için bir protokol sunulmuştur. Bu moleküllerin katı mesnetler ve biyo-arayüzler üzerindeki yapışma kuvvetini ve serbest enerjisini belirlemek için prosedürler ve örnekler verilmiştir.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Nanoyapılı substratları hareketsizleştirilmiş proteinler ve aptamerlerle arayüzleyen nano-biyolojik sistemlerin üretimini ve karakterizasyonunu tanımlıyoruz. Nanoyapılı substratların litografik üretimi, biyo-işlevselleştirme ve yüzey geliştirilmiş Raman spektroskopisi (SERS) karakterizasyonunu içeren ilgili deneysel adımlar rapor edilmiştir. Yüzeyde hareketsizleştirilmiş proteinlerin SERS tespiti ve protein-ligand ve aptamer-ligand bağlanmasının araştırılması gösterilmiştir.

Yüzey EBL Fabrikasyon Nanostructured Alt Tabakalar Kullanma biyomoleküllerin Raman Spektroskopisi Algılama Geliştirilmiş

Biz bir sıvı lipid iki katmanının çevrili nanometrik protein yamaları ile cam fonksiyonel hale getirilmesi için bir protokol mevcut. Bu alt tabakalar gelişmiş optik mikroskop ile uyumludur ve hücre yapışması ve göç çalışmaları için platform olarak hizmet etmesi beklenmektedir.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Kemik morfogenetik Protein 2 (BMP2) katkılı Biyomalzeme yeni bir tedavi stratejisi sendikasız Kemik kırıkları iyileşmek için kullanılmaktadır. Yan etkileri faktörü kontrol edilemez bir sürümden kaynaklanan üstesinden gelmek için biz site için yeni bir strateji teklif-doğrudan böylece malzemeleri ile geliştirilmiş Osteojenik yetenekleri oluşturma faktörü, hareketsiz.

Site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Prob moleküllerinin atomik kuvvet mikroskobuna kovalent bağlanması (AFM) kantilever uçları fiziksel özelliklerinin araştırılması için gerekli bir tekniktir. Bu bize yüksek tekrarlanabilirlik ile AFM tabanlı tek molekül kuvvet spektroskopisi ile polimerlerin germe kuvveti, desorpsiyon kuvveti ve uzunluğu belirlemenize olanak sağlar.

AFM tabanlı Kuvvet Spektroskopisi için Tek Moleküllerin Kovalent Eki

Biyomembran kuvvet probu (BFP), yerinde dinamik kuvvet spektroskopisi (DFS) tekniğidir. BFP, canlı hücreler üzerindeki moleküler etkileşimlerin yay sabitini ölçmek için kullanılabilir. Bu protokol, BFP tarafından tespit edilen moleküler bağlar için yay sabit analizi sunar.

Biyomembran Kuvvet Probu Spektroskopisi ile Moleküler Yay Sabit Analizi

Büyüme Faktörü ß aile öncül proteinlerinin dönüştürülmesi Xenopus laevis embriyolarında ektopik olarak ifade edildiğinde, küçülürler, bölünürler ve erken gastrula aşamasına geç blastülde başlayan blastokoele salgılanırlar. İmmünoblot analizi için blastocoele boşluğundan dekolte ürünlerini aspire etmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Xenopus laevis Embriyolarının Blastocoele'sine Salgılanan Dönüşüm Faktörü ß Aile Bölünmesi Ürünlerinin Analizi

Kemik iliği vasküler nişinin in vitro bir modeli, mezenkimal ve endotel hücrelerinin önceden dökülmüş 3D PEG hidrojelleri üzerine tohumlanmasıyla oluşturulur. Nişlerin endotel ağları, ECM bileşenleri ve ALP aktivitesi kullanılan büyüme faktörüne bağlı olarak değişir. Platform, gelişmiş kanser modelleri için kullanılabilir.

Bir görüntüleme mikroplakasında önceden dökülmüş poli (etilen glikol) (PEG) hidrojeller kullanılarak vaskülarize osteojenik kemik iliği nişinin basit bir şekilde kurulması

Polimer aşılı, metal-organik çerçeve (MOF) kristalleri kullanılarak kendinden montajlı metal-organik çerçeve tek katmanlarının sentezi ve karakterizasyonu için bir protokol sağlanır. Prosedür, polimer aşılı MOF parçacıklarının, taramalı elektron mikroskobu görüntüleme ile kanıtlandığı gibi, iyi şekillendirilmiş, serbest duran, tek katmanlı yapılarla sonuçlanan bir hava-su arayüzünde kendi kendine monte edilebileceğini göstermektedir.

Polimer kaplı parçacıklar kullanılarak kendinden montajlı metal-organik çerçeve tek tabakalarının sentezi ve karakterizasyonu

Keşfedin BMP-2'nin yüzeylere kovalent bağlanması için kendi kendine monte olan monolayer yöntemini. Bu teknik, büyüme faktörü biyolojisinde hücre zarındaki sinyal mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

Kovalent Öz-monte tabakalı Yaklaşım Kullanarak Yüzeyler üzerinde BMP-2 bağlanması

Daha fazla video keşfet