Bir Kuş Türlerinin Sindirim Sistemi geçtikten sonra Bulaşıcı prions belirlenmesi için prosedürler

Bu prosedürün genel amacı, enfeksiyöz PreOn materyalinin Amerikan Kargalarının sindirim sisteminden geçişini belgelemektir. Bu, ilk olarak kargaları bulaşıcı PreOn materyali ile ölçerek gerçekleştirilir. İkinci adım, karga dışkısını gavajdan sonraki dört saat boyunca toplamak ve farelere enjeksiyona hazırlamaktır.

Daha sonraki fareler, bir mililitre karga dışkı homojenatı ile intraperitoneal olarak aşılanır. Son adım, farelerin klinik belirtilerini ifade edene kadar fareleri günlük olarak izlemektir. Sonuç olarak, fare modelinde enfeksiyöz PreOn'un varlığını doğrulamak ve hastalık bulaşmasını doğrulamak için western blot analizi kullanılır.

Kargaların taşıyabileceği fikri. CWD bize bir kış günü, biraz araştırma yaptığımız ve yolda ölen geyiklerin kargalar tarafından beslendiğini gördüğümüz tutsak bir geyik tesisine gittikten sonra geldi ve o günün ilerleyen saatlerinde, kargalar gökyüzünden hiçbir yerden çıkmadı, bu yem oluklarına indi, geyiğin hemen yanında beslendi, geyiğin tükettiği tahılın üzerine dışkılama yaptı, literatürden elde edilen gözlemlerin üzerine çok şey söyledi. Colorado'da yaz, Wyoming'de kışın New Mexico'da yoğun bir bölgede kargalar, öyle oluyor ki New Mexico'daki o bölge, bazı CABD'lerin ortaya çıktığı yer ve çatlak israfı hastalığının merkez üssünden yüz mil yüzlerce mil uzakta. Dolayısıyla bu iki gözlem, potansiyel olarak kargaların CWD'yi arazide taşımada bir rol oynayabileceğini düşünmemizi sağladı.

Bu tekniklerin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü yanlış intraperitoneal ve oral gavaj teknikleri çalışma hayvanlarının ölümüne neden olabilir. Başlamak için, çırpılmış bir yumurtaya dört damla mavi boya ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra beş mililitre boya ve yumurta karışımını iki inçlik bir gavaj iğnesine çekin ve bir kişi kargayı nazikçe dizginleyin.

Karganın gagasını boğazından aşağısını görecek kadar geniş açın ve gavaj iğnesini dikkatlice yemek borusuna sokun. Herhangi bir solunum değişikliği fark edilirse, şırıngayı çıkarın ve trakeaya yerleştirilmiş olabileceğinden tekrar deneyin. Gavaj iğnesinin yemek borusunda olduğundan emin olduktan sonra, şırınganın içeriğini yavaşça ifade edin.

Mavi-yeşil lekeli dışkı atılmayana kadar kargayı her 30 dakikada bir kontrol edin. Test kargalarının mavi boyalı dışkı atmayı bırakması yaklaşık dört saat sürdü. Daha sonra, bir parça enfekte olmamış C 57 siyah altı fare beynini, dört ölçü steril PBS'ye ve birkaç cam boncuk bir mermi karıştırıcısına ekleyin.

Homojenizatör, pürüzsüz kıvam elde edilene kadar numuneyi bir ila beş dakika homojenize edin. Ölümcül hasta R ML Chandler suşu ile enfekte olmuş C 57 siyah altı fare beyni kullanarak işlemi tekrarlayın. Daha sonra homojeni 3000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin.

Daha büyük partikül maddeyi çıkarmak için. Daha sonra süpernatanı çıkarın ve beyin maddesi hacmi başına %10'luk bir ağırlık oluşturmak için eşit hacimde steril bir XPBS ile seyreltin. PBS'de, numuneleri gavajdan 17 saat önce ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Karga kalemlerinden yiyeceği çıkarın, suyu değil. Kargaları rastgele tedavi gruplarına ayırın ve iki inçlik bir gavaj iğnesi kullanarak her kargayı beş mililitre taze çözülmüş, normal veya enfekte fare beyni homojenatı ile ağızdan gavajlayın. Sonra kargaları ayrı kafeslere aktarın.

Gavajdan dört saat sonra her kafesteki tüm dışkıları toplayın ve toplayın. Daha sonra, her karga için havuzlanmış dışkıyı, homojen bir doku elde edilene kadar cam boncuklu mavi mermi homojenizatöründe homojenize edin. Daha sonra karışımdan 500 mikrolitre alın ve 9.5 mililitre steril PBS santrifüjü, seyreltilmiş dışkı homojenatı 15 dakika boyunca bir ila 20 oranında seyreltin.

1.300 kez G ekleyin ve ardından süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. İkincil bir mikrobiyal enfeksiyon tehdidini en aza indirmek için, mililitre homojenat başına bir birim penisilin ve bir mikrogram streptomisin ekleyin. Ardından, kalan mikropların zarını bozmak için numuneleri 3000 MP'lik bir güç ayarında 70 saniye boyunca 30 MP'lik bir torda sonikleştirin.

İlk olarak, fareleri burada gösterilen dört gruptan birine rastgele atayın. Birinci grup enfekte karga dışkısı alacak. İkinci grup, enfekte olmayan karga dışkısı alacaktır.

Üçüncü grup enfekte fare beyni alacak ve dördüncü grup normal fare beyni alacak. Daha sonra MN birinci ve ikinci gruplar için, bir mililitre kazınmış pozitif veya kazınmış negatif karga dışkısı çizin. Farenin grup numarasına göre 25 gauge iğne kullanarak homojenize edin.

Ardından fareyi sırt boynu kürkünden tutun. Başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın ve ventral tarafı ortaya çıkarmak için hafifçe döndürün. Farenin arka ucunu, başı biraz daha aşağıda olacak şekilde yükseltin.

İğneyi deriden bir santimetre içeren, orta hattın bir santimetre lateralinden ve sakroiliak eklemin bir ila iki santimetre önüne sokun. Daha sonra hafifçe geri çekin ve homojeni yavaşça fare gövdesi boşluğuna enjekte edin. Daha sonra, donmuş fare beyin homojenatını üçüncü ve dördüncü gruplardaki hayvanlara enjeksiyon için hurdalı ve hurdasız olarak hazırlayın.

Önce haws stok karışımlarını steril PBS ile bir ila 10 oranında seyrelterek. Daha sonra üçüncü gruptaki farelere bir mililitre seyreltilmiş kazınmış pozitif beyin homojenatı ve farelere bir mililitre seyreltilmiş kazınmış negatif beyin homojenatı enjekte edin. Dördüncü grupta.

Fareleri, fare sıyrıklığının klinik belirtilerini ifade edene kadar günlük olarak izleyin. Klinik belirtiler arasında kifoz, ataksi, sert kuyruk, tımar eksikliği, zayıflama ve uyuşukluk sayılabilir. Altı klinik belirtinin her biri için günlük puanımı alın.

Görünür işaretler belirgin olduğunda. Sıfır, görünür hiçbir işarete eşit değildir. Biri ılımlı, ikisi ise şiddetli bir işaret seviyesine eşittir.

Her işaret için toplam günlük puanlar, üç gün boyunca veya 365 gün boyunca sürekli olarak altıya eşit veya daha büyük bir gün için sekize eşit veya sekize ulaştığında farelere ötenazi yapın. Aşılamadan sonra, ötenaziden hemen sonra beyinleri toplayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ardından, hatalı bir teşhisi doğrulamak için karkasları uygun şekilde atın.

Donmuş fare beyinlerini çözdürün ve homojen bir doku elde edilene kadar cam boncuklu mavi mermi homojenizatörde tek tek homojenize edin. Daha sonra, 109.39 mikrolitre PBS'yi pH sekizde 12.5 mikrolitre 500 milimolar EDTA ve mililitre proteinaz K çözeltisi başına 50 mikrogram 3.1 mikrolitre birleştirerek 125 mikrolitre proteinaz K sindirim çözeltisi hazırlayın. Daha sonra beynin 17 mikrolitresine üç mikrolitre sindirim solüsyonu ekleyin. Homojenize.

Numuneleri 45 santigrat derecede çalkalanan bir ısı bloğunda 30 dakika inkübe edin. Kuluçka bittiğinde, sekiz mikrolitre SDS sayfa yükleme tamponu ekleyerek sindirim çözeltisini etkisiz hale getirin ve numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Ardından numuneleri %12'lik bir SDS sayfasına yükleyin.

Jel proteinleri elektroforez eder ve jeli bir IMON PVDF membranına aktarır Aktarıldıktan sonra, PVDF membranını PBS'de %5 yağsız sütle 20 arasında %0,2 ile bloke edin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca kaya yapın. Daha sonra zarı, inkübasyonu takiben oda sıcaklığında bir saat boyunca süper blok ve kaya içinde bir ila 20.000 seyreltilmiş at turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş ödünç 224 ve IPRP monoklonal antikoru ile araştırın. Membranı PBS'de bir saat boyunca %0,2 ile 20 arasında durulayın.

Membranı kemilüminesan substrat ile beş dakika inkübe ederek proteinleri görselleştirin. Daha sonra zarı bir G box jel dokümantasyon sistemi üzerinde görüntüleme. Hastalıklı fareler, klinik fare sıyrık belirtilerinin tezahürü ile tanımlandı ve hastalık doğrulaması, Batı kan analizi ile tamamlandı.

Normal fare beyni homojen, sıyrıksız olarak burada gösterilmiştir, solda proteaz K yardımı olan ve olmayan iki şerit, proteaz K olmadan üç bükülme görülür. Ancak normal protein proteinazlara duyarlı olduğu için ikinci şeritte bükülmeler görülmez. Üçüncü şerit, proteaz sindirilmiş sıyırıcı pozitif kontrol örneğini gösterir.

Proteazlar, proteinlerin n ve c terminallerinin kaybına bağlı olarak üç orijinal bantta bir kaymaya neden olur. Ancak enfekte olmuş proteinler, normal beyin örneğinde olduğu gibi tamamen sindirilemez. Cılız bir kargadan dışkı ile aşılanmış bir fareden alınan proteinaz K sindirilmiş beyin sağda gösterilmiştir ve bantlar sindirilmediği için numunedeki prionların varlığını doğrular.

Bu videoyu izledikten sonra, bulaşıcı prion materyalinin kargaların sindirim sisteminden geçişini nasıl belgeleyeceğinizi daha iyi anlayacaksınız. Daha sonra bulaşıcılığı bir interperitoneal fare biyo-tahlili ile doğrulayın.