Monoklonal Antikorlar TG30 ve GCTM-2 Kullanılarak Hücre Yüzey Antijenlerinin Tespiti ile İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Zenginleştirilmesi ve Temizlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik kök hücre alt kümelerini, TG 30 ve GC TM iki monoklonal antikorun hücre yüzeyi antijen bağlanmasına göre sıralamaktır. Bu, ilk önce insan embriyonik kök hücresinin veya HESC kültürlerinin tek hücreli süspansiyonlara ayrılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, HESC, monoklonal antikorlar, TG 30 ve GCTM iki ile boyanır.

Son olarak, hücreler floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması ile ayrılır ve kültüre geri döndürülür. Sonuç olarak, sıralanan hücrelerin koloni oluşturma kabiliyeti, akış sitometrisi ve faz kontrast mikroskobu ile değerlendirilebilir. Bu tekniğin görsel gözlem gibi mevcut yöntemlere göre ana görüntüsü, çok sayıda hücre için hücre bazında objektif bir pluripotentlik ölçümü sağlaması ve bunun embriyonik kök hücrelerin farklılaşmış hücrelerden ayrılmasını kolaylaştırmasıdır.

Bu yöntem, kültür koşullarındaki değişikliklerin farklı insan embriyonik kök hücresini ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre dizilerini kantitatif olarak nasıl etkilediği gibi pluripotens alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bugün prosedürü göstermek, laboratuvarımdan araştırma bilim adamları George Zoe Hun Chi ve Bay Wang olacak, Bir Hess tek hücre süspansiyonu yapmak için, kültürlenmiş bir Hess hücre hattı içeren iki T 75 şişesinden Hess Kültür ortamını aspire ederek başlayın. Her şişeyi 10 mililitre DPBS ile yıkayın ve daha sonra her kültürü 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de üç mililitre üçlü E eksprese edilmiş ayrışma çözeltisi ile inkübe edin.

Beş dakika sonra, hücreleri yerinden çıkarmak için şişenin yan tarafını çarpın ve ardından mikroskop altında ayrılmayı onaylayın. Daha sonra, steril 10 mililitrelik bir pipet kullanarak her şişeye 10 mililitre soğuk kültür ortamı ekleyin. Ağırlıklı olarak tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için ayrışmış hücreleri şişe duvarına birkaç kez nazikçe tritrate edin.

Şimdi Hess hücre yüzey antijenlerini boyamak için hes tek hücreli süspansiyonları 70 mikronluk bir hücre süzgecinden steril 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe havuzlayın. İlk olarak, 150 mikrolitre ortamda yaklaşık 100.000 hücreyi, altı kontrol 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinin her birine yerleştirin. Daha sonra, kontrol tüplerini ve kalan sıralama numunesini, izotip kontrolleri de dahil olmak üzere kültür ortamında sırasıyla 200 mikrolitre ve yaklaşık dokuz mililitre nihai reaksiyon hacimlerinde ilgilenilen birincil antikorlarla inkübe edin.

Tüpleri yatay olarak buzun üzerine yerleştirin ve sallanan bir platform üzerinde 30 dakika boyunca hafifçe karıştırın. Hücreleri döndürdükten sonra, süpernatanı atın ve ardından sıralama örneğini 20 mililitre soğuk kültür ortamında ve kontrol örneklerini 200 mikrolitrede yıkayın. Şimdi, sıralama örneğini 2.5 mililitrelik bir son hacimde, soğuk kültür ortamında uygun ikincil antikorlarla inkübe edin ve kontroller, aynı 200 mikrolitrelik bir son hacimde, bu sırada uygun kontrol tüpüne yeni hazırlanmış PE anti-US CD 90.2 antikoru ekleyin.

Bir kez daha, tüpleri sallanan bir platform üzerinde 30 dakika boyunca buz üzerinde yatay olarak yavaşça karıştırın. Hücreleri döndürdükten sonra, sıralama örneğini 20 mililitre soğuk kültür ortamında ve kontrolleri 200 mikrolitrede tekrar süspanse edin ve hücreleri ortamda iki kez yıkayın. Sıralama numunesini, propidyum iyodür ile takviye edilmiş iki ila üç mililitre soğuk kültür ortamında ve boyanmamış hücreler hariç kontrollerin her birinde 300 mikrolitrede yeniden süspanse edin.

Daha sonra, her bir hücre süspansiyonunu, beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı test tüplerine bağlı 35 mikronluk bir kapak hücre süzgecinden süzün ve süzgeç kapaklarındaki herhangi bir kalıntı hücre süspansiyonunu tüplere zorlamak için tüpleri santrifüjleyin. Ardından, her bir hücre süspansiyonunu yeniden askıya almak için tüplerin kenarlarına hafifçe vurun ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin. TG 30 GCTM iki floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması için akış sitometresini, ayrışmış Hess hücre süspansiyonlarının potansiyel kümeleri ve çiftleri ortadan kaldırmak için tek hücreler olarak kapılanacak şekilde ayarlayın.

Daha sonra, yalnızca sağlam hücrelerin sıralanması için ön ve yan saçılma kapıları ile potansiyel kalıntıları temizleyin. Daha sonra canlı olmayan hücreleri propidyum iyodür ekspresyonuna göre hariç tutun. Fare embriyonik fibroblastlarını veya metamfetamin besleyici hücrelerini, fare CD 90.2 pe ekspresyonlarına dayalı olarak negatif seçimle dışarı çıkarın.

TG 30 G CTM'yi, boyanmamış hücreler için arka plan otofloresansına ve ayrıca izotip kontrollerine göre iki negatif yürüyüşe ayarlayın. Metamfetamin besleyicilerden arındırılmış izole edilebilir canlı HESC fraksiyonu daha sonra son olarak TG 30 negatif GCT M, iki negatif TG 30 düşük GCT M, iki düşük TG 30 orta GC TM, iki orta ve TG 30 yüksek GCTM iki yüksek alt popülasyona ayrılabilir. Akış sitometresini kurduktan sonra, iki adet beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı test tüpünün her birine bir mililitre metamfetamin şartlandırılmış ortam ekleyin ve bunları buzun üzerine yerleştirin.

Daha sonra, farklılaşmış TG 30 negatif GC TM iki negatif ve pluripotent TG 30 yüksek GCTM iki yüksek hücre alt fraksiyonundan her biri 400.000 hücreyi kurtarın. Toplama tüplerini döndürdükten sonra, resus her bir hücre peletini bir mililitre önceden dengelenmiş MEF şartlandırılmış ortamda süspanse eder. Daha sonra, metamfetamin şartlandırılmış ortamdaki her fraksiyondan HESC ile önceden dengelenmiş, üçte bir MEF yoğunluğu T 75 şişesini tohumlayın, hücre kültürlerini 37 santigrat derecede% 5 CO2'de inkübe edin ve ortamı yaklaşık iki hafta boyunca günlük olarak tazeleyin.

Pluripotent TG 30 yüksek GCTM iki yüksek hücre kültürleri, bir hafta sonra insan kök benzeri koloniler gösterir ve dokuz ila 11 günde yaklaşık% 80 co akıcılığına ulaşır. TG 30 negatif GC TM iki negatif hücre kültürleri çoğunlukla 11 ila 13 gün içinde ko-akıcılığa ulaşan hücreler gibi fibroblastların bir çimi olarak büyür. Hücre yüzeyi antijenleri TG 30 ve GC TM iki'nin kombine tespiti, pluripotent aşamada ve erken HESC farklılaşmasının çeşitli aşamalarında, kök hücre belirteçlerinin ve soya özgü transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonu ile belirtildiği gibi, bir dizi hücre alt kümesinin ayrımına izin verir. önceki raporlarla uyumlu olarak, TG 30 GC TM iki negatif düşük, orta ve yüksek alt fraksiyonlar, bu çalışma için kullanılan insan embriyonik kök hücre erkek tek hat içinde ayırt edilebilir, burada bir TG 30 GCTM iki akışlı sitometri analizine özgü farklı kapılı alt popülasyonların yüzdeleri burada gösterilen deneyde gösterilmiştir.

Tanımlanmış sayıda TG 30 negatif GCT M iki negatif hücre, yaklaşık iki hafta boyunca tasnif edildikten sonra art arda kültürlendi ve daha sonra yeniden kaplamadan önce sadece TG 30 negatif GCT M iki negatif fraksiyonu toplamak için başvuruldu. Her geçişte sonuçlar, başlangıçtaki TG 30 negatif GCT M iki negatif alt fraksiyonun, ardışık paketlemeden sonra TG 30 negatif GCT M iki negatif farklılaşmış hücre için zenginleştiğini göstermektedir. İlk geçişte TG 30 yüksek GCT M iki yüksek hücrenin küçük bir popülasyonu tespit edilir, ancak sonunda daha fazla paketleme ile kaybolur ve geriye sadece pluripotent kök hücre içermeyen örnekler kalır.

Burada, 14 gün sonra farklılaşmış TG 30 negatif GCT M iki negatif hücrenin çiminin tipik morfolojisi gösterilmektedir. 14 gün sonra görülen sporadik HESC benzeri kolonilerin, büyük olasılıkla kirletici TG 30 yüksek GCT M iki yüksek hücre tarafından üretilen TG 30 negatif GC TM iki negatif hücre ile karıştığını unutmayın. Bunun sadece nadiren meydana geldiğini ve bu testi kullanan önceki gözlemlere dayanan ilk olay sonrası pasajda, TG 30 yüksek GCTM iki yüksek hücrenin toplanması ve kültürünün, pluripotent HSC'ler oluşturan koloni için zenginleştirilmesi beklenmektedir.

Bu nedenle, akış sitometrisi ile sıralandıktan sonra pluripotent TG 30 yüksek GCTM iki yüksek hücrenin ardışık paketlenmesi de bu temsili kültürlerde araştırıldı, hücreler TG 30 ve G CT M iki kullanılarak faksla sıralandı ve her geçişte sadece TG 30 yüksek G CTM iki yüksek hücrenin yerini aldı. Bu şekilde, hücrelerin çoğunluğunun, TG 30 negatif G CTM iki negatif hücrenin küçük bir yüzdesini ayırt etme ve yeniden oluşturma kapasitesini koruyan zenginleştirilmiş bir pluripotent hücre popülasyonunu gösteren pluripotent hücre ile ilişkili alt fraksiyonlarda bulunduğu gözlendi. Ayrıca, TG 30 yüksek G CTM iki yüksek sıralanmış hücrenin ardışık kültürleri, geçiş sonrası çok sayıda HESC benzeri koloni sergiler ve aynı zamanda pluripotens durumunun korunmasını da gösterir.

Bu prosedürü denerken, sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için her seferinde kullanmadan önce faks makinesini kalibre etmeyi unutmamak önemlidir. Mikrodiziler, tüm genom dizilimi veya teratomlar gibi diğer yöntemler, bu hücreler geliştirildikten sonra gerçekten pluripotent midir gibi soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, indüklenmiş pluripotent kök hücreler alanındaki araştırmacıların, insan embriyonik kök hücrelerine kıyasla bu hücrelerin güvenliğini ve stabilitesini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, periet hücreleri için zenginleştirme yapmak amacıyla insan enbr kök hücrelerinin karışık kültürlerinin nasıl dikkatli bir şekilde hazırlanacağını ve boyanacağını iyi anlamış olmalısınız. İnsan hücreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven giymek ve güvenlik kabini ile ikinci sınıf ile çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.