Name: Monoklonal Antikorlar TG30 ve GCTM-2 Kullanılarak Hücre Yüzey Antijenlerinin Tespiti ile İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Zenginleştirilmesi ve Temizlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Öğrenin, TG30 ve GCTM-2 monoklonal antikorları ile FACS kullanarak insan embriyonik kök hücrelerini zenginleştirme ve temizleme yöntemini. Bu teknik, plüripotent hücreleri farklılaşmış hücrelerden ayırarak kök hücre biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HESC hatlarının sağlanması için Monash Üniversitesi'ndeki StemCore tesisine ve FACS hizmetleri için Monash Üniversitesi'ndeki FlowCore tesisine teşekkür ederiz. Bu çalışma Avustralya Kök Hücre Merkezi, Yeni Güney Galler ve Victoria Hükümeti Kök Hücre Araştırma Hibe Programı'ndan ALL'ye yapılan araştırma hibeleri ile desteklendi. ALL, Kök Hücre Bilimi, Kök Hücreler Avustralya'daki Avustralya Araştırma Konseyi (ARC) Özel Araştırma Girişimi'nin Ortak Araştırmacısıdır.

Aşağıdaki protokol, Monash Üniversitesi'ndeki (Melbourne) StemCore tesisi tarafından sağlanan hESC-MEL111 standart toplu kültürler kullanılarak gerçekleştirildi. Bu hücre hattı rutin olarak bFGF destekli hESC /KOSR ortam7'deki mitotik olarak inaktive fare embriyonik fibroblastlar (MEF' ler) tabakası üzerinde kültürlenmiştir ve her 5-7 gün8gün enzimatik ayrışma (Kollajenaz) ile korunur. 75 cm2 (T75) şişelerde ~%80 izdiahgaha kadar yetişen hESC kültürleri bu protokol için giriş popülasyonu olarak kullanılmaktadır. Aşağıda açıklanan tüm hücre manipülasyon prosedürleri HEPA filtreli sınıf II biyo-güvenlik kabininde aseptik koşullar altında yapılmalıdır.
Bir TG30/GCTM-2 FACS tahlilini gerçekleştirmeden iki gün önce, FACS sonrası kurtarılan hücrelerin yeniden şekillendirilmesi için kullanılacak T75 kültür plakalarını (bölüm 1'de açıklanmıştır) hazırlayın (bölüm 4'te açıklanmıştır).
1. MEF'lerin Tohumlama ve MEF Şartlı Orta Hazırlanması
1.1 GÜN -2: MEF'lerin T75 şişelerine kaplaması
<ol><li>Pipet her T75 şişesine 10 ml% 0.1 w / v jelatin ve yüzeyi eşit şekilde kaplamak için eğilin.</li>
	<li>Biyogüvenlik kabininde oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Aspirat jelatin çözeltisi.</li>
	<li>Şişeye 20 ml MEF-orta ekleyin ve bir hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca 37 °C/% 5 CO2'ye ön denge ekleyin.</li>
	<li>Plaka, mef'leri aşağıdaki yoğunluklarda hazırlanan şişelere mitottik olarak inaktive etti. 1/3 MEF yoğunluklu tohum için 1,4 x 104 hücre/cm2 (T75= 1 x 106 MEF). Tam yoğunluklu MEF tohumu için 5,3 x 104 hücre/cm2 (T75 = 4 x 106 MEF).</li>
</ol>Not: γ ışınlama ile mitotik olarak inaktive edilmiş MEF'leri rutin olarak kullanıyoruz. γ ışınlanmış MF'lerin hazırlanması için bir protokol Michalska12'de bulunabilir.
<ol start="6"><li>Kuluçka, mef kültürlerini bir gecede %37 °C/5 CO2'de ışınladı. 1/3 şişeler MEF-orta değişim olmadan 1-4 gün kuluçkaya yatırılabilir. Bu şişeler FACS sonrası hücrelerin yeniden sıçraması için kullanılır (protokol 4'te olduğu gibi). Tam MEF şişeleri, 1.2 adımında aşağıdaki gibi CM oluşturmak için bir gecede inkübe edilir.</li>
</ol>1.2 GÜN -1: MEF şartlandırılmış ortamın hazırlanması (CM)
<ol><li>Tam MEF T75 şişelerinden MEF-medium'u aspire edin.</li>
	<li>T75 şişe başına 5 ng/ml insan FGF-2 ile desteklenmiş önceden dengelenmiş 25 ml hESC/KOSR ortamı ekleyin. 24 saat boyunca %37 °C/%5 CO2'de kuluçkaya yatır.</li>
	<li>MEF şartlandırılmış ortamı (CM) steril bir doku kültürü tüpüne toplayın, 10 ng/ml insan FGF-2 ile taze takviye CM ve 0,22 μm poliethersülfon filtre kullanarak filtreleyin.</li>
	<li>Ek CM üretmek için, aynı MEF kültüründe her gün 1.2.2 ve 1.2.3 adımlarını bir hafta boyunca yineleyin.</li>
</ol>Bir TG30/GCTM-2 tahlilinin yapıldığı gün, 1/3 MEF T75 şişelerindeki MEF-medium'u CM ile değiştirin ve aşağıda açıklandığı gibi prosedürden kurtarılan hESC veya hESC türev hücrelerinin tohumlanından önce en az 30 dakika boyunca ön aşındırın. CM taze olarak kullanılır veya 2 haftaya kadar 4 °C'de saklanır. CM, elimizde olduğu gibi bu protokolde de kullanılır ve facs sonrası hücrelerin uygulanabilirliğini koşulsuz ortamlara göre arttırır (sonuçlar gösterilmez).
2. TG30/GCTM-2 FACS Tahlilinin Gerçekleştirilmesi: hESC Toplu Kültürlerinin Tek Hücreye Ayrıştırması
Not: 4 °C'de Önseziye %20 FBS/DMEM-F12 ortamı.
<ol><li>hESC/KOSR medyasını kültürlü bir hESC hattına sahip iki T75 şişesinden epire edin.</li>
	<li>Her T75'teki hücreleri 10 ml DPBS ile durulayın ve çıkarmaya hazırlayın.</li>
	<li>Her T75 şişesine 3 ml TrypLE Express ayrıştırma çözeltisi ekleyin. 5 dakika boyunca %37 °C/%5 CO2'de kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Hücrelerin tamamen yerindenmasını sağlamak için şişelerin yan tarafını çarpın. Mikroskop altında kontrol edin. Hücreler kolayca yerinden çıkarmazsa, 37 °C/5% CO 2'de 2-3 dakika daha kuluçkayayaslanın.</li>
	<li>Her T75 şişesine 10 ml%20 FBS/DMEM-F12 (4 °C'de tutulur) ekleyin. Steril bir 10 ml pipet kullanarak, ayrışmış hücreleri şişe duvarına karşı birkaç kez hafifçe üçleerek ağırlıklı olarak tek hücreli süspansiyon elde edin.</li>
	<li>50 ml steril polipropilen tüp üzerine 70 μm hücre süzgeç yerleştirin. İki T75 şişesinden birikmiş hESC tek hücreli süspansiyonları süzgeçten geçirmek için steril 10 ml pipet kullanın.</li>
	<li>Hücre süzgecini atın, tüp kapağını değiştirin ve havuza alınan hESC süspansiyonunu 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve peleti % 10 ml 20 FBS/ DMEM-F12'de (4 °C'de ön-önseziye) hafifçe yeniden dirilterek hücreleri yıkayın.</li>
	<li>2 dakika boyunca 1.000 x g'da ikinci bir santrifüj gerçekleştirin.</li>
	<li>Süpernatantı atın, %10 ml 20 FBS/DMEM-F12 (4 °C'de önlük) ekleyin ve hücreleri yeniden canlandırmak için hafifçe üçleme ekleyin. 50 ml'lik tüpü buza yerleştirin. Bu tüp aşağıda açıklanan Sort Sample immünostaining prosedürü için kullanılacaktır.</li>
	<li>Hemotositometre kullanarak hücre sayısı sayımı için hESC tek hücreli süspansiyonun 20 μl'sini (adım 2.10) alın. T75 şişesi başına 10-15 milyon hücre verimi beklemelisiniz.</li>
</ol>Not: FBS, protokolün bu bölümünde FACS sonrası hücre canlılığını artırmak için kullanılır.
3. Hücre Yüzey Antijenlerinin İmmünofluoresan Boyanma TG30 ve GCTM-2
<ol><li>1,5 ml'lik altı mikrosantrifüj tüpünün her birine hESC tek hücreli süspansiyonun (adım 2,11'den) Aliquot 150 μl (~100,000 hücre). Bu altı aliquot, FACS makinesindeki tahlilleri kalibre etmek için gereken boyama kontrolleri için kullanılacaktır. Kalan ~9 ml hücre süspansiyonu, Tablo 1 ve 2'yegöre, TG30 ve GCTM-2'nin tespiti için ayrışmış kültürün koine edileceğini Sıralama Örneğiniz olacaktır.</li>
	<li>%20 FBS/DMEM-F12'de primer antikorların bağlama reaksiyonlarını gerçekleştirin. Son reaksiyon hacimleri Sıralama Örneği için ~9 ml ve kontroller için 200 μl olmalıdır. birincil antikorlar olarak izotip kontrollerini dahil edin. Tüpleri yatay olarak buza yerleştirin ve sallanan bir platformda 30 dakika hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Santrifüj birincil antikor reaksiyonları 2 dakika boyunca 1.000 x g'da.</li>
	<li>Üstnatantı atın ve peleti Sıralama Örneği için %20 FBS/DMEM-F12 (4 °C'de önlüklü) ve kontroller için 200 μl olarak yeniden oluşturarak hücreleri yıkayın.</li>
	<li>2 dakika boyunca 1.000 x g'da ikinci bir dönüş gerçekleştirin.</li>
	<li>%20 FBS/DMEM-F12'de sekonder antikorların bağlama reaksiyonlarını gerçekleştirin. Son reaksiyon hacimleri Sıralama Örneği için 2,5 ml ve kontroller için 200 μl olmalıdır. Pe-anti-mouse CD90.2 reaksiyon tüpünü bu aşamada hazırlayın. Tüpleri yatay olarak buza yerleştirin ve sallanan bir platformda 30 dakika hafifçe karıştırın.</li>
</ol>Not: Bu kuluçka süresi boyunca, CM toplamak ve bölüm 1.2'de olduğu gibi CM ile 1/3 MEF T75 şişeleri hazırlamak uygundur.
<ol start="7"><li>Santrifüj sekonder antikor reaksiyonları 2 dakika boyunca 1.000 x g'da.</li>
	<li>Üstnatantı atın ve peleti Sıralama Örneği için %20 FBS/DMEM-F12 (4 °C'de önlüklü) ve kontroller için 200 μl olarak yeniden oluşturarak hücreleri İkİ KEZ yıkayın.</li>
	<li>Her yıkamayı takiben 2 dakika boyunca 1.000 x g'da bir dönüş yapın ve tüpleri buza yerleştirin.</li>
	<li>0,3 μg/ml'de propidium iyodür (PI) ile desteklenmiş %20 FBS/DMEM-F12'de süpernatantları atın ve hücre peletlerini yeniden depolayın. Sıralama Örneği için 2-3 ml ve kontroller için 300 μl kullanın.</li>
</ol>Not: Kontrol tüpüne lekesiz hücrelerle PI EKLEMEYİn.
<ol start="11"><li>Her bir hücre süspansiyonunu 5 ml tüp polistiren yuvarlak alt test tüpleriyle birleştirilmiş 35 μm kapaklı hücre süzgecinden geçirmek için bir P1000 mikropipette kullanın.</li>
	<li>Süzgeç kapaklarındaki artık hücre süspansiyonunu zorlamak için 50 g/dk'da santrifüj.</li>
	<li>Tüplerin kenarlarına dokunarak her bir hücre süspansiyonu yeniden dirsin ve buza yerleştirin. Hücreleriniz artık FACS için hazır. Lütfen hemen devam edin.</li>
</ol>4. 75 cm2 (T75) Şişelerde TG30/GCTM-2 Alt Kırılma Hücrelerinin FACS Sonrası Kültürü
<ol><li>Daha önce TG30/ GCTM-2 immünprofiling7için bir FACS makinesinin nasıl kurulacağı hakkında rapor verdik. Prosedür, UYGULANABILIR tek hESC'lerin, MEF'lerden arındırılmış ve P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)ve P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)kapılarında kurtarılmasınısağlar - bkz. Daha sonra kullanılacak hücre alt ihlallerini kurtarmak için önceki raporumuzda olduğu gibi TG30/GCTM-2 FACS için FACS makinesini kurun.</li>
	<li>FACS makinesinden hücre toplamadan önce iki adet 5 ml polistiren yuvarlak alt test tüpünün her birine 1,2 adımda olduğu gibi hazırlanan 1 ml CM ekleyin. Buzun üzerine koy.</li>
	<li>TG30/GCTM-2 FACS kullanarak farklılaştırılmış P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)ve pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücre alt ihlallerinden her biri 400.000 hücreyi kurtarın.</li>
	<li>Toplama tüplerini 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Üstleri aspire edin. Bir P1000 mikroppetörü kullanarak her hücre peletini yeniden kullanmak için 1 ml önkoşüllü 37 °C/5% CO2 CM ekleyin. Her kesir için hücreleri CM ile önceden dengelenmiş 1/3 MEF T75 şişesine tohumlayın (adım 1.2'ye göre hazırlanır)</li>
	<li>Bir hücre kültürü inkübatöründe24 saat boyunca %37 °C/5 CO 2'de kültür.</li>
	<li>CM'yi günlük olarak aspire edin ve yaklaşık iki hafta boyunca yeni hazırlanmış CM (adım 1.2'de olduğu gibi) ile değiştirin. Pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücrelerinin kültürleri bir hafta sonra insan sapı benzeri kolonileri gösterir ve 9-11 günde ~% 80 izdiah eder. P4 kültürleri (TG30Neg-GCTM-2Neg)hücreleri çoğunlukla 11-13 günde izdiah eden fibroblast benzeri bir hücre çimi olarak büyür. Bu aşamada, gerekirse, P4 ve P7 hücre kültürleri, P4 veya P7 alt ihlallerinin ardışık yeniden şekillendirilmesine aracılık eden TG30/GCTM-2 FACS için kullanılabilir (Bkz. Şekil 2 ve 3).</li>
</ol>

<ol><li>Pera, M. F., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+regulation+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrinsic regulation of pluripotent stem cells.</a> Nature. 10 (7299), 713-720 (2010).</li>
<li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Metab.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li>
<li>Miura, K., Okada, Y., Aoi, T., Okada, A., Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+safety+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).</li>
<li>Polanco, J. C., Laslett, A. L. Safety Assessment of Reprogrammed Cells Prior to Clinical Applications: Potential Approaches to Eliminate Teratoma Formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolanco%2C+JC+%22Pluripotent+Stem+Cells%22">Pluripotent Stem Cells</a>. Lenka, N. , InTech. (2013).</li>
<li>Laslett, A. L., Grimmond, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+analysis+of+early+lineage+commitment+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional analysis of early lineage commitment in human embryonic stem cells.</a> BMC Dev. Biol. 7, 12(2007).</li>
<li>Kolle, G., Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+embryonic+stem+cell+surface+markers+by+combined+membrane-polysome+translation+state+array+analysis+and+immunotranscriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling.</a> Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).</li>
<li>Zhou, Q., Chy, H., Laslett, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+defined+human+embryonic+stem+cell+populations+for+transcriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of defined human embryonic stem cell populations for transcriptional profiling.</a> Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1B 7(2010).</li>
<li>Stem Cell Protocols - WiCell. , WiCell. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.wicell.org/home/support/stem-cell-protocols/stem-cell-protocols.cmsx">http://www.wicell.org/home/support/stem-cell-protocols/stem-cell-protocols.cmsx</a> (2013).</li>
<li>Fong, C. Y., Peh, G. S., Gauthaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+SSEA-4+and+TRA-1-60+labelled+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+from+a+heterogeneous+cell+population+using+magnetic-activated+cell+sorting+%28MACS%29+and+fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Separation of SSEA-4 and TRA-1-60 labelled undifferentiated human embryonic stem cells from a heterogeneous cell population using magnetic-activated cell sorting (MACS) and fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> Stem Cell Rev. 5, 72-80 (2009).</li>
<li>Schriebl, K., Satianegara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+removal+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+using+magnetic+activated+cell+sorting+followed+by+a+cytotoxic+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Selective removal of undifferentiated human embryonic stem cells using magnetic activated cell sorting followed by a cytotoxic antibody.</a> Tissue Eng. Part A. 18, 899-909 (2012).</li>
<li>Adewumi, O., Aflatoonian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat. Biotechnol. 25, 803-816 (2007).</li>
<li>Michalska, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+mouse+embryonic+fibroblasts+and+preparation+of+mouse+embryonic+feeder+layer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of mouse embryonic feeder layer cells.</a> Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1C 3(2007).</li>
<li>Hough, S. R., Laslett, A. L., Grimmond, S. B., Kolle, G., Pera, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuum+of+cell+states+spans+pluripotency+and+lineage+commitment+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A continuum of cell states spans pluripotency and lineage commitment in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 4, e7708(2009).</li>
<li>Filipczyk, A. A., Laslett, A. L., Mummery, C., Pera, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+is+coupled+to+changes+in+the+cell+cycle+regulatory+apparatus+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation is coupled to changes in the cell cycle regulatory apparatus of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 1, 45-60 (2007).</li>
<li>Polanco, J. C., Ho, M. S. H., Wang, B., Zhou, Q., Wolvetang, E., Mason, E., Wells, C., Kolle, G., Grimmond, S. M., Bertoncello, I., O'Brien, C., Laslett, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unsafe+human+IPSC+lines+using+a+robust+surrogate+assay+for+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of unsafe human IPSC lines using a robust surrogate assay for pluripotency.</a> Stem Cells. 31 (8), 1498-1510 (2013).</li>
<li>Sharpe, M. E., Morton, D., Rossi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclinical+safety+strategies+for+stem+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nonclinical safety strategies for stem cell therapies.</a> Toxicol. Appl. Pharmacol. 262 (3), 223-231 (2012).</li>
</ol>

Açıklayacak bir şey yok.

Klinik bağlamda, farklılaştırılmış somatik hücre tipleri transplantasyon ve terapötik uygulamalar için son istenen ürün olup, hPSC bu somatik hücreleri veya laboratuvardaki atalarını üretmek için kendi kendini yenileyen ve ölçeklenebilir bir kaynaktır. Teratoma oluşumu için doğal bir potansiyele sahip artık farklılaşmamış hESC'lerin varlığı, hastalara nakil için hESC türevi somatik hücreler düşünüldüğünde bir güvenlik riskidir. Bu ve hücre tedavisi ile ilgili diğer risklerin gözden geçirilmesi için lütfen Sharpe ve ark. 16 Bu nedenle, bu tür uygulamaları gerçekleştirmek için, araştırmacıların aynı zamanda pluripotent kök hücre içermeyen hedef hücre popülasyonları oluşturmayı hedeflemeleri zorunludur. Bu amaçla, burada TG30/GCTM-2 FACS metodolojimizi kullanarak, farklılaşan bir hücre popülasyonunda pluripotent hücrelerin (TG30Hi-GCTM-2Hi)varlığını izlemenin ve FACS sonrası zenginleştirilebilen ve yeniden şekillendirilebilen uygulanabilir hESC-farklılaştırılmış türevler elde etmenin mümkün olduğunu gösteriyoruz. Protokolümüzün tek geçişi ile %100 pluripotent kök hücre içermeyen numuneler elde etmek mümkün olmasa da zenginleştirilmiş hESC türevleri yeniden şekillendirilebilir ve ardışık geçtikten sonra %100 somatik hücre saflığı elde edilir. FACS sonrası genişleme için somatik hücrelerin gösterilmiş canlılığı, potansiyel transplantasyon tedavileri için uygun yeterli sayıda hücrenin üretilmesine de olanak sağlamaktadır.
Bu pilot çalışmanın cesaret verici sonuçları, birkaç insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) hattı15ile karşılaştırmalı bir çalışmada TG30/ GCTM-2 protokolümüzü kullanarak daha kapsamlı bir araştırma yapmamızı istedi. Bu çalışmada, TG30/GCTM-2 FACS protokolümüz kullanılarak elde edilen pluripotent kök hücre içermeyen örneklerin bağışıklıktan yoksun farelere nakledildiğinde teratom üretmediğini tespit ettik. Bu nedenle, bu in vitro protokolün kullanımıyla, pluripotent TG30Hi-GCTM-2Hi hücrelerinden arındırılmış olduğu belirlenen erken evre farklılaşma hücre kültürlerinin teratomageliştirmediğini güvenle belirtebiliriz vivo . Bu, hPSC türevi hücrelerin klinik uygulamalarda kullanılmadan önce teratom oluşumu riskini ortadan kaldırmak için potansiyel bir yaklaşım sağlayarak testimizin sağlamlığını güçlü bir şekilde desteklemektedir.
Tersine, TG30/GCTM-2 FACS testinin, bu iki yüzey antijeninin (TG30Hi-GCTM-2Hi)yüksek düzeyde ekspresyosuna sahip pluripotent hücre popülasyonu almak için kullanılabileceğini de gösteriyoruz. Önceki çalışmalar, TG30Hi-GCTM-2Hi hücrelerinin OCT4hi ekspresyasyonu ile en yüksek korelasyonu sergilediğini ve en yüksek hESC benzeri koloni sayısını oluşturduğunu göstermiştir5,6,13,15. Bu nedenle pluripotency ağının TG30Hi-GCTM-2Hi ekspresyon hücrelerinde maksimum seviyelerinde aktive olmasının nedeni budur. TG30/GCTM-2 FACS protokolümüzü kullanarak ve P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücrelerini alarak zenginleştirilmiş canlı hESC kültürlerinin büyük ölçekli saflaştırılmasına izin verebileceğini düşünüyoruz.
Sonuç olarak, burada, HESK'lerin hem tasfiyesi hem de zenginleştirilmesi için yüzey antijenleri TG30 ve GCTM-2'nin birleşik ifadesine dayanan FACS tahlillerimizin potansiyelini gösteriyoruz. HPSC'lerin yönlendirilmiş farklılaşmasına yönelik protokollerle gelecekteki çalışmaların da bu potansiyel konusunda bilgilendirici olması muhtemeldir. Farklılaştırılmış hESC türevlerinin zamansal olarak TG30 (CD9) veya GCTM-2'yi ifade ettiği bazı tahlillerde, bu iki antikorun pluripotent hücrelerini testte belirli bir zaman noktasında farklılaşmış bir popülasyondan arındırmak için uygun veya yeterli olmayabileceğinin farkındayız6. Bu nedenle, bazı farklılaştırılmış hücre tipleriyle çapraz reaksiyonun olası sınırlamasının üstesinden gelmek için canlı hESK'leri özellikle tanıyan yeni antikorlar bulmaya ihtiyaç vardır.

HPSC (hPSC) insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (hIPSC) içerir. HPSC, "pluripotency" olarak bilinen yeteneklerini kaybetmeden uygun kültür koşullarında süresiz olarak kendini yenileyebilir. Pluripotency, bir hücrenin üç embriyonik mikrop hücre katmanının her birinin hücrelerini temsil etmesi de dahil olmak üzere esasen herhangi bir somatik hücre soyuna farklılaşma potansiyeli olarak tanımlanır. hPSC'nin dikkat çekici potansiyeli, terapötik seçenekler de dahil olmak üzere çok çeşitli hücre tabanlı uygulamalar için bir araç sağlar. Örneğin, kalp yetmezliği, omurga yaralanmaları, diyabet, Parkinson hastalığı, bazı kanserler ve diğer klinik patolojilerde olduğu gibi, insan vücudundaki hücrelerin normal işlevselliğinin tehlikeye girdiği hücre ölümü ve dejenerasyon içeren bozukluklar vardır. Bu durumlara maruz kalan hastalar, laboratuvarda hPSC'den elde edilen sağlıklı ve fonksiyonel somatik hücrelerin nakledilmesiyle potansiyel olarak tedavi edilebilir. Bununla birlikte, mevcut hPSC farklılaşma protokolleri% 100 verimli değildir ve farklılaştırılmış hedef ve hedef dışı hücre türlerinin yanı sıra farklılaşmaya uğramamış artık hPSC'lerin bir karışımını verir, bunun yerine kendi kendini yenilemeye devam eder1-3. Hastalara nakli amaçlanan hPSC türevli somatik hücrelerin bir örneğinde az sayıda hPSC'nin bile bulunması, bu hücrelerin doğası gereği üç embriyonik mikrop tabakasının dokularını oluşturmak için ciddi bir klinik risk oluşturmaktadır, potansiyel olarak teratoma olarak bilinen bir tümör türü oluşturabilir. Bu nedenle hastalara nakil için sadece pluripotent kök hücre içermeyen olduğu belirlenen hedef hücre popülasyonları güvenli olarak kabul edilebilir. Farklılaşmadan sonra artık hPSC'lerin temizlenmesini potansiyel olarak gerçekleştirmek için bildirilen çeşitli yaklaşımlar vardır (inceleme için bkz: Polanco ve Laslett4). Daha önce pluripotent kök hücreleri tanımlamak ve hESC hatlarının kültürlerinde erken farklılaşma aşamasına geçen hücrelerden ayırt etmek için floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile birleştirilmiş monoklonal antikorların TG30 (CD9) ve GCTM-2'nin kullanımını bildirdik5-7.
Hücre yüzeyi antijenlerini tespit etmek için antikor kullanmanın bir avantajı, hedef hücrelerin genellikle antikor bağlama ve/ veya etiketlemeden sonra uygulanabilir olmasıdır. Bu nedenle, hedef hücreler antikor etiketlemesinden sonra toplanabilir ve transplantasyondan önce genişleme ve daha fazla uygulama için yeniden şekillendirilebilir. HPSC'de ifade edilen hücre yüzeyi antijenleri için bir uyarı, pluripotent evreye özel olmadıkları ve çoğu durumda gelişim sırasında zamansal olarak yeniden ifade edildikleri ve bu nedenle bazı farklılaştırılmış hücre tiplerinde tespit edilecekleridir. Bu nedenle, amaç insan pluripotent hücrelerini tespit etmek ve hPSC türevi hücrelerin bir örneğinden temizlemek için antikor kullanmaksa, seçilen antikorlar da transplantasyon için amaçlanan spesifik farklılaştırılmış hücre tipleri üzerinde antijenlerle reaksiyona almamalıdır. Ne yazık ki, canlı hPSC 4'tehücre yüzeyi işaretleyicilerini tespit eden sınırlı sayıda antikor vardır. Ek olarak, birkaç çalışma, tek bir hücre-yüzey işaretleyicisinin tespitinin tüm hPSC'yi ortadan kaldırmak için yeterli olmadığına işaret etti, tüm hPSC pluripotent subpopulations ortadan kaldırmaya yönelik herhangi bir girişimin, hPSC 9-10tarafından ifade edilen farklı epitopları tespit eden iki veya daha fazla antikor kullanan yöntemlere dayanması gerektiğini öne sürdü. Yukarıda bahsedildiği gibi, insan nakli için sadece pluripotent kök hücre içermeyen hücre popülasyonları olarak belirlenebilecek hPSC türevi hücreler uygundur. Antikor aracılı hücre sıralama teknolojisinden tek bir geçişle bu katılık seviyesine ulaşmak sağlanamayabilir. Pluripotent kök hücre içermeyen örnekleri kesin olarak elde etmek için farklılaştırılmış hedef hücrelerin zenginleştirilmiş popülasyonunun yeniden şekillendirilmesi ve sonraki hücre sıralama turları gerekebilir.
Laboratuvarımızda, canlı pluripotent hücrelerin tespiti için TG30 (CD9) ve GCTM-2 olmak üzere iki hES hücre yüzeyi antikorlarını kapsamlı bir şekilde karakterize ettik. Çalışmalarımız, hem TG30 hem de GCTM-2'nin kombine tespitinin hESC hatlarında kanonik pluripotency ile ilişkili genlerin ekspresyonu ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu göstermiştir 5-7. TG30/GCTM-2 FACS immünprofiling sürekli olarak hESC kültürlerinin TG30/GCTM-2 ekspresyonunun nicel sürekli gradyanını oluşturduğunu göstermiştir 5-7. Bu TG30/GCTM-2 gradyanın içinde keyfi olarak dört hücre popülasyonu (P) oluşturduk: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (T)G30Düşük-GCTM-2Düşük), P6 (TG30Orta-GCTM-2Orta)ve P7 (TG30Hi-GCTM-2Merhaba) 5-7. Bu P4, P5, P6 ve P7 hücre popülasyonlarını karakterize etmek, P6 ve P7 alt ihlallerinin çok sayıda pluripotency ile ilişkili geni ifade ettiğini ve FACS 2-3sonrası yeniden şekillendirildiğinde etkili bir şekilde kök benzeri koloniler oluşturduğunu göstermiştir. Öte yandan, P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)hücreleri çok sayıda farklılaşma işaretleyicisini ifade eder ve tipik olarak hESC hatlarının 5-6kültürlerinin genişlemesinde meydana gelen kendiliğinden farklılaşmış hücre tiplerini oluşturur. Erken evre farklılaşmasından sonra artık hPSC'lerin seçici olarak ortadan kaldırılması ve ayrıca pluripotent kök hücre popülasyonlarının zenginleştirilmesi için TG30/GCTM-2 FACS'imizin potansiyelini test etmeye karar verdik. Aşağıda açıklanan protokol, pluripotent P7'nin (TG30Hi-GCTM-2Hi)temizlenmesini gerçekleştirmek için FACS sonrası farklılaştırılmış P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)hücrelerinin nasıl toplandığını ve yeniden şekillendirildiğini göstermektedir. Ayrıca, pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücrelerinin, daha sonra farklılaşma testlerinin verimliliğini ve tutarlılığını potansiyel olarak artırmak için tanımlanmış bir girdi popülasyonu olarak kullanılabilecek zenginleştirilmiş bir pluripotent hücre kültürü elde etmek için toplanması ve yeniden şekillendirilmesini de açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11320082</td><td>Uzun Adı: Dulbecco'nun Modifiye Kartalı Orta:Besin Karışımı F-12</td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10828028</td><td>Uzun Adı: Nakavt Serum Değişimi</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050061</td><td>Uzun Adı: GlutaMAX takviyesi</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11140050</td><td>Uzun Adı: MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi</td></tr><tr><td>Merkaptoetanol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21985023</td><td>Uzun Adı: 2-Merkaptoetanol</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190250</td><td>Uzun Adı: Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini, kalsiyum yok, magnezyum yok</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12604039</td><td>Uzun Adı: TrypLE Express (1x), Fenol Kırmızısı</td></tr><tr><td>AF-488</td> <td>yokYaşam Teknolojileri</td><td>A21131</td><td>Uzun Adı: Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG2a</td></tr><tr><td>AF-647</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21238</td><td>Uzun Adı: Alexa Fluor 647 keçi anti-fare IgM</td></tr><tr><td>PE-anti IgG2a</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P21139</td><td>Kısa Adı: R-Phycoerythrin Keçi Anti-Fare IgG2a (&gamma; 2a) Eşlenik</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11965-092</td><td>Uzun Adı: Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı, yüksek glikozlu</td></tr><tr><td>Kalem/Strep</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>Uzun Adı: Penisilin-Streptomisin, Sıvı</td></tr><tr><td>Damıtılmış Su</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15230-089.</td><td>Uzun Adı: Steril Damıtılmış Su</td></tr><tr><td>PI</td><td>SIGMA</td><td>P4864</td><td>Uzun Adı: Propidyum iyodür çözeltisi</td></tr><tr><td>FBS</td><td>SIGMA</td><td>12203C</td><td>Uzun Adı: Fetal Sığır Serumu</td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>SIGMA</td><td>G-1890</td><td>Uzun Adı: Domuz derisinden elde edilen jelatin</td></tr><tr><td>İnsan FGF-2</td><td>Millipore</td><td>GF003AF-100UG</td><td>Uzun Adı: Fibroblast Büyüme Faktörü baz, insan rekombinant, hayvansız</td></tr><tr><td>Filtre 0.22 & mu; m</td><td>Millipore SCGPU02RE</td><td></td><td>Uzun Adı: Stericup-GP, 0.22 &mu; m, polietersülfon, 250 ml, radyo-sterilize 70</td></tr><tr><td>& mu; m Hücre Süzgeci</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td>Uzun Adı: 70 &mu ile hücre süzgeci; m Naylon ağ</td></tr><tr><td>35 & mu; m Kapak hücre süzgeci, 5 ml tüp</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>Uzun Adı: 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı test tüpü, hücre süzgeci kapaklı (35 &mu; m)</td></tr> <tr><td>5 ml Polistiren yuvarlak tabanlı test tüpü</td><td>Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>Uzun Adı: 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı test tüpü, steril</td></tr><tr><td>IgG2a İzotip Kontrolü</td><td>Becton Dickinson</td><td>554126</td><td>Uzun Adı: Saflaştırılmış Fare IgG2a, &kappa; İzotip Kontrolü</td></tr><tr><td>IgM İzotip Kontrolü</td><td>Becton Dickinson</td><td>553472</td><td>Uzun Adı: Saflaştırılmış Fare IgM, &kappa; İzotip Kontrolü</td></tr><tr><td>PE-CD90.2</td><td>Becton Dickinson</td><td>553014</td><td>Uzun Adı: PE Sıçan Anti-Fare CD90.2</td></tr><tr><td>8 tepeli kalibrasyon</td><td>Becton Dickinson</td><td>559123</td><td>Uzun Adı: Gökkuşağı Kalibrasyon Parçacıkları (8 tepe)</td></tr><tr><td>50 ml steril Polipropilen tüp</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Uzun Adı: 50 ml Konik tabanlı polipropilen tüp, Steril</td></tr><tr><td>T75 şişe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>Uzun Adı: CELLSTAR Filtre Kapağı Hücre Kültürü 75 cm2 Şişeler</td></tr><tr><td>TG30</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB4427</td><td>Uzun Adı: TG30 Antikor, klon TG30</td></tr><tr><td>GCTM-2</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB4346</td><td>Uzun Adı: GCTM-2 ticari olarak mevcut değildir, ancak TG343 ve eşdeğer monoklonal antikor</td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 4. Malzemelerin ve reaktiflerin listesi</td></tr><tr><td>FACS makinesi</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>FACSVantage SE ile FACSDiva seçeneği</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX71<</td></tr><tr>td colspan="4">Tablo 5. Ekipman listesi.</td></tr></tbody></table>

monoklonal antikorlar tg30 ve gctm-2 kullanılarak hücre yüzey antijenlerinin tespiti ile İnsan embriyonik kök hücrelerinin zenginleştirilmesi ve temizlenmesi

Enrichment and Purging of Human Embryonic Stem Cells by Detection of Cell Surface Antigens Using the Monoclonal Antibodies TG30 and GCTM-2

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) süresiz in vitroolarak kendini yenileyebilir ve uygun ipuçları ile potansiyel olarak tüm somatik hücre soylarına farklılaşmak için indüklenebilir. Farklılaştırılmış hESC türevleri, çeşitli hücre dejeneratif hastalıkların tedavisinde transplantasyon tedavilerinde potansiyel olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, hESC farklılaşma protokolleri genellikle farklılaştırılmış hedef ve hedef dışı hücre tiplerinin yanı sıra artık farklılaşmamış hücrelerin bir karışımını verir. Farklılaştırılmış hESC türevlerinin laboratuvardan kliniğe çevirisi için, farklılaşmamış (pluripotent) ve farklılaştırılmış hücreler arasında ayrım yapabilmek ve bu popülasyonları ayırmak için yöntemler üretebilmek önemlidir. HESC türevi somatik hücre tiplerinin güvenli uygulaması ancak pluripotent kök hücre içermeyen popülasyonlarla gerçekleştirilebilir, çünkü artık hESC'ler transplantasyondan sonra teratom olarak bilinen tümörlere neden olabilir. Bu amaçla, burada pluripotent TG30Hi-GCTM-2Hi hESC'lerin pozitif seçim kullanılarak tanımlanması için floresan aktif hücre sıralama (FACS) yoluyla monoklonal antikorlar TG30 (CD9) ve GCTM-2 ile ilişkili hücre yüzey antijenlerini tespit etmek için bir metodoloji açıklıyoruz. TG30/GCTM-2 FACS metodolojimiz ile negatif seçim kullanarak, çok erken evre farklılaşma geçiren popülasyonlarda farklılaşmamış hESC'leri tespit edebildik ve temizleyebildik (TG30Neg-GCTM-2Neg). Daha sonraki bir çalışmada, TG30/GCTM-2 FACS protokolümüz kullanılarak seçilen farklılaştırılmış TG30Neg-GCTM-2Neg hücrelerinin pluripotent kök hücre içermeyen örnekleri, bağışıklık sistemi zayıf farelere nakledildikten sonra teratom oluşturmadı ve protokolümüzün sağlamlığını destekledi. Öte yandan, TG30/GCTM-2 FACS aracılı ardışık zenginleştirilmiş pluripotent TG30Hi-GCTM-2Hi hESC'ler in vitro veya içsel pluripotency kendi kendini yenileme yeteneklerini etkilemedi. Bu nedenle, TG30/GCTM-2 FACS metodolojimizin özellikleri, farklılaşma tahlilleri için girdiler olarak yüksek oranda zenginleştirilmiş hPSC popülasyonları elde etmek ve potansiyel olarak tümörojenik (veya artık) hESC'yi türev hücre popülasyonlarından kurtarmak için hassas bir test sağlar.

Pluripotent kök hücre içermeyen hESC türevleri P4 (TG30 Neg -GCTM-2Neg)alt ihlalinden hücrelerin ardışık olarakgeçmesiyleelde edilebilir.
Önceki raporlar, hESC standart kültürlerinde, pluripotency5,6,13ile ilişkili genlerin bir ifade gradyanını sergileyen bir alt nüfus karışımının bir arada bulunduğunu ortaya çıkarmıştır. TG30 (CD9) ve GCTM-2 gibi hücre yüzeyi antijenlerinin kombine tespiti, kök hücre belirteçleri ve soyuna özgü transkripsiyon faktörlerinin ifade edilmesiyle belirtildiği gibi, pluripotent aşamada ve erken farklılaşmanın çeşitli aşamalarında bir dizi hücre alt kümesinin ayırt edilmesine izin verir5,6,13. Önceki raporlara uygun olarak, bu çalışma için kullanılan hESC-MEL1 hattında P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)ve P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücrelerini ayırt edebildik (Şekil 1). Bu sonuçla, aşağıda açıklanan çalışmalarda daha fazla kültür için farklılaştırılmış P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)hücreleri ve pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücrelerini toplamaya devam ettik.
Olumsuz bir seçim yaklaşımı kullanarak, farklılaşmamış HESC'leri çok erken evre farklılaşma geçiren hücre popülasyonlarından arındırıp temizleyemeyeceğimizi araştırdık (TG30Neg-GCTM-2Neg). Yaklaşık iki hafta boyunca facs sonrası ardışık olarak kültürlenen ve her pasajda sıçramadan önce TG30/GCTM-2 FACS kullanılarak yeniden analiz edilen tanımlanmış sayıda P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)hücresi kullandık. Sonuçlar, TG30Neg-GCTM-2Neg için zenginleştirilmiş P4 alt ihlalinin ardışık geçişten sonra hücre tiplerini farklıleştirdiğini ve ilk pasajda P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) hücrelerinin küçük bir varlığının(Şekil 2A, Pasaj 1) daha fazla geçtikten sonra kaybolduğunu ve pluripotent kök hücre içermeyen örnekler haline geldiğini göstermiştir (Şekil 2A, Geçiş 3).
Pluripotent hESC hücrelerinin zenginleştirilmesi, TG30Hi-GCTM-2Hi hücrelerinin toplanması ile elde edilebilir.
Bu tahlil kullanılarak yapılan önceki gözlemlere dayanarak, hESC kolonileri oluşturması gereken P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücrelerini toplayarak pluripotent hESC'lerin zenginleştirilmesini beklerdik. Bu nedenle, pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücrelerinin TG30/GCTM-2 FACS aracılı ardışık geçişini de araştırdık. Bu P7 kültürlerinde her pasajda hücrelerin yeniden sıçramadan önce TG30/GCTM-2 FACS immünprofilingi yapıldı ve sadece P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücreleri yeniden şekillendirildi. Bu şekilde, hücrelerin çoğunluğunun pluripotency (P6 ve P7) ile ilişkili subfractions'ta bulunduğunu gözlemledik, bu da P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)hücrelerinin küçük bir yüzdesini ayırt etme ve üretme kapasitesini koruyan pluripotent hücrelerin zenginleştirilmesini gösteriyor (Şekil 3A). Ayrıca, P7 hücrelerinin kültürleri pas geçme sırasında çok sayıda hESC benzeri koloni göstermiştir (Şekil 3B), ayrıca pluripotency durumunun korunmasını gösterir.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig1.jpg"> Şekil 1. TG30/GCTM-2 FACS alt ihlallerini elde etmek için temsili sıralama stratejisi. (A): Ayrışmış hES hücre süspansiyonları tek hücreli olarak sıralanır ve potansiyel kümeler veya çiftler yükseklik ve alan (FSC-H ve FSC-A) için ileri dağılım ile kaplanır. (B): Olası döküntüler FSC-A ve SSC-A ile kaldırılır ve yalnızca sağlam hücreler daha fazla sıralanır. (C): Dayanılmaz hücreler propidiyum iyodür (PI) floresan (FSC-A ve FL3-A) temel alınarak dışlanır. (D): MEF besleyici hücreler, fare CD90.2-PE (FL2-A ve SSC-A) ifadesine göre negatif seçimle kapatıldı. (E): MEF besleyicilerden arındırılmış izole edilebilir hESC fraksiyonu nihayet P4 (TG30 Neg -GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)ve P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celplerine kesirlenir. Negatif kapı (TG30Neg-GCTM-2Neg, P4 olarak adlandırılır) etkilenmemiş hücreler için arka plan otoflüoresansına ve ayrıca izotip kontrollerine göre ayarlanmıştır. (F): TG30/GCTM-2 akış sitometri analizine özgü farklı kapılı alt nüfusların yüzdeleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig1large.jpg" target="_blank">Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig2.jpg"> Şekil 2. HESC-MEL1 hattından kendiliğinden farklılaştırılmış P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)hücrelerinin ardışık kültürlerini temsil eder. (A): TG30 ve GCTM-2 hücre yüzey belirteçlerinin algılanan ifade düzeyine göre ayırt edilen hücrelerin (P4, P5, P6 ve P7) kapılı alt kümelerini gösteren temsili TG30/GCTM-2 FACS çizimleri. P4 (TG30 Neg -GCTM-2Neg)immünprofiling sergileyen 400.000 hESC türevinin ilk popülasyonu hESC-MEL1 hattının toplu kültürlerinden toplanır. Bu P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)hücreleri, T75 şişelerinde hESC yenilenmesini destekleyen koşullarda, izdiliğe ulaşana kadar (11-13 gün) facs sonrası ardışık olarak geçilir. Her pasajdan önce, TG30/GCTM-2 FACS sadece P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)farklılaştırılmış hücre tiplerini toplamak ve yeniden şekillendirmek için gerçekleştirilir. (B): 14 gün sonra farklılaştırılmış P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)hücrelerinin çimlerinin tipik morfolojisi. (C): Sadece 1. geçitteki P4 (TG30 Neg -GCTM-2Neg)hücrelerinin çimleriyle içiçe geçen 14 gün sonra görülen sporadik hESC benzeri koloniler, büyük olasılıkla P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücrelerinin kirlenmesiyle oluşur. Ölçek çubuğu = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig2large.jpg" target="_blank">Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig3.jpg"> Şekil 3. hESC hatlarından türetilen P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücreleri, içsel pluripotent özelliklerini kaybetmeden FACS sonrası ardışık olarak geçiş yapılabilir. TG30 ve GCTM-2 ifade düzeyine göre hücrelerin (P4, P5, P6 ve P7) ayırt edilmiş alt kümelerini gösteren farklı ardışık pasajların temsili TG30/GCTM-2 FACS immünprofilizasyonu. (A): P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)özelliklerini gösteren 400.000 hücreden oluşan başlangıç popülasyonu, hESC-MEL1 hattının toplu kültürlerinden alınır. Pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücreleri, ~%80 izdiliteye (9-11 gün) ulaşana kadar T75 şişelerinde hESC yenilenmesini destekleyen koşullarda FACS sonrası ardışık olarak geçilir. TG30/GCTM-2 FACS immünprofiling her pasajda hücrelerin yeniden sıçramadan önce gerçekleştirilir ve sadeceP7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücreleri yeniden şekillendirilir. Sonuçlar, P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücrelerinin pluripotent özelliklerini daha sonraki pas geçme ile muhafaza ettiğini göstermektedir, (TG30Hi-GCTM-2Hi)ifadesinin korunması, hESC benzeri kolonilerin oluşturulması (B'degösterilmiştir) ve FACS gradyanlarının her birinde farklılaştırılmış P4'ün (TG30Neg-GCTM-2Neg)küçük bir kısmının yeniden kapsüllenmesinden çıkarılacağı gibi farklılaşma yeteneğini korumak dahil. Ölçek çubuğu = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig3large.jpg" target="_blank">Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Örnek (reaksiyon hacimleri)</td>
			<td>Birincil Antikor</td>
			<td>İkincil Antikor</td>
			<td>PE Sıçan Anti-Fare CD90.2 b</td>
			<td>Propidium İyodür c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Örneği Sırala (birincil ABs için ~9 ml, ikincil ABs için 2,5 ml)</td>
			<td>(TG30 + GCTM-2) bir
</td>
			<td>AF 488 keçi anti-fare IgG2a + AF 647 keçi anti-fare IgM</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kontrol-1: TG30 (200 μl)</td>
			<td>TG30</td>
			<td>AF 488 keçi anti-fare IgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kontrol-2: GCTM-2 (200 μl)</td>
			<td>GCTM-2</td>
			<td>AF 647 keçi anti-fare IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kontrol-3: Fare karşıtı CD90.2 (200 μl)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kontrol-4: Fitoerythrin (PE) (200 μl)</td>
			<td>Fare IgG2a izotip</td>
			<td>R-phycoerythrin keçi anti-fare IgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kontrol-5: Fare İmmünoglobulin izotip (200 μl)</td>
			<td>Fare IgG2a izotip + IgM izotip</td>
			<td>AF 488 keçi anti-fare IgG2a + AF 647 keçi anti-fare IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kontrol-6: Lekesiz hücreler (200 μl)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. FACS sıralama için örnek ve denetimleri sıralayın. bir Sort numunesi TG30 ve GCTM-2 antikorları ile aynı anda immünostain edilir. b PE-anti-mouse CD90.2, FARE HÜCRELERINI TANıMAK VE FACS14sırasında HESC'lerden MED'leri kaldırmak için kullanılır. c Dayanılmaz hücreler, 0,3 μg/ml'lik son konsantrasyonda propidium iyodür kullanılarak dışlanır. Reaktif eklendi (+), reaksiyon tüpüne (-) eklenmedi.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>antikor </td>
			<td>ev sahibi</td>
			<td>Izotip</td>
			<td>Çalışma seyreltme</td>
		</tr>
<tr>
<td>TG30 (1,4 mg/ml)</td>
			<td>fare</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>GCTM-2 (hibridoma süpernatant)</td>
			<td>fare</td>
			<td>ıgm</td>
			<td>1:5 ~ 1:10 a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF 488 keçi anti-fare IgG2a</td>
			<td>keçi</td>
			<td>Çok kavunal</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF 647 keçi anti-fare IgM</td>
			<td>keçi</td>
			<td>Çok kavunal</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-phycoerythrin (PE) keçi anti-fare IgG2a</td>
			<td>keçi</td>
			<td>Çok kavunal</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fare karşıtı CD90.2</td>
			<td>sıçan</td>
			<td>IgG2b</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Saflaştırılmış Fare IgG2a, φ İzotip Kontrolü</td>
			<td>fare</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Saflaştırılmış Fare IgM, φ İzotip Kontrolü</td>
			<td>fare</td>
			<td>ıgm</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. FACS sıralama için antikor detayları ve seyreltmeler. a HESC'lerin hücre yüzeyinde GCTM-2'nin son derece yüksek ekspresyonu nedeniyle bu antikorla doygunluğa ulaşmak mümkün değildir. Her bir GCTM-2 hibridoma süpernatantı, hESC'lerle benzer sonuçlar elde etmek ve aşırı lekelenmeyi önlemek için standart bir kontrole veya önceki bir toplu işleme karşı titratlanmalıdır.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Ortamın adı</td>
			<td>kompozisyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>hESC/KOSR ortamı</td>
			<td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta:Besin Karışımı F-12 (DMEM/F-12) ile desteklenmiş %20 Nakavt Serum Replasmanı (KOSR), 2 mM GlutaMAX, %1 MEM Gereksiz Amino Asitler, 0.1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ml insan fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF-2) ve Pen/Strep 1x'te.</td>
		</tr>
<tr>
<td>MEF ortamı</td>
			<td>Dulbecco Modifiye Kartal Orta, yüksek glikoz (DMEM) ile desteklenmiş 10% Fetal Sığır Serumu (FBS), 2 mM GlutaMAX ve Pen / Strep 1x.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3. Kültür medyasının bileşimi.

Monoklonal antikorlar TG30 (CD9) ve GCTM-2'nin floresan aktif hücre sıralama (FACS) yoluyla hücre yüzeyi antijenlerinin kombine tespiti için pozitif seçim kullanılarak canlı insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC) tanımlanması ve zenginleştirilmesi ve ayrıca hESC'lerin karışık hücre popülasyonundan arındırılması için negatif seçimin kullanılmasını açıklıyoruz.

Monoklonal Antikorlar TG30 ve GCTM-2 Kullanılarak Hücre Yüzey Antijenlerinin Tespiti ile İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Zenginleştirilmesi ve Temizlenmesi

Human embryonic stem cells (hESC) can self-renew indefinitely in vitro, and with the appropriate cues can be induced to differentiate into potentially all ...

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik kök hücre alt kümelerini, TG 30 ve GC TM iki monoklonal antikorun hücre yüzeyi antijen bağlanmasına göre sıralamaktır. Bu, ilk önce insan embriyonik kök hücresinin veya HESC kültürlerinin tek hücreli süspansiyonlara ayrılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, HESC, monoklonal antikorlar, TG 30 ve GCTM iki ile boyanır.Son olarak, hücreler floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması ile ayrılır ve kültüre geri döndürülür. Sonuç olarak, sıralanan hücrelerin koloni oluşturma kabiliyeti, akış sitometrisi ve faz kontrast mikroskobu ile değerlendirilebilir. Bu tekniğin görsel gözlem gibi mevcut yöntemlere göre ana görüntüsü, çok sayıda hücre için hücre bazında objektif bir pluripotentlik ölçümü sağlaması ve bunun embriyonik kök hücrelerin farklılaşmış hücrelerden ayrılmasını kolaylaştırmasıdır.Bu yöntem, kültür koşullarındaki değişikliklerin farklı insan embriyonik kök hücresini ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre dizilerini kantitatif olarak nasıl etkilediği gibi pluripotens alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bugün prosedürü göstermek, laboratuvarımdan araştırma bilim adamları George Zoe Hun Chi ve Bay Wang olacak, Bir Hess tek hücre süspansiyonu yapmak için, kültürlenmiş bir Hess hücre hattı içeren iki T 75 şişesinden Hess Kültür ortamını aspire ederek başlayın. Her şişeyi 10 mililitre DPBS ile yıkayın ve daha sonra her kültürü 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de üç mililitre üçlü E eksprese edilmiş ayrışma çözeltisi ile inkübe edin.Beş dakika sonra, hücreleri yerinden çıkarmak için şişenin yan tarafını çarpın ve ardından mikroskop altında ayrılmayı onaylayın. Daha sonra, steril 10 mililitrelik bir pipet kullanarak her şişeye 10 mililitre soğuk kültür ortamı ekleyin. Ağırlıklı olarak tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için ayrışmış hücreleri şişe duvarına birkaç kez nazikçe tritrate edin.Şimdi Hess hücre yüzey antijenlerini boyamak için hes tek hücreli süspansiyonları 70 mikronluk bir hücre süzgecinden steril 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe havuzlayın. İlk olarak, 150 mikrolitre ortamda yaklaşık 100.000 hücreyi, altı kontrol 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinin her birine yerleştirin. Daha sonra, kontrol tüplerini ve kalan sıralama numunesini, izotip kontrolleri de dahil olmak üzere kültür ortamında sırasıyla 200 mikrolitre ve yaklaşık dokuz mililitre nihai reaksiyon hacimlerinde ilgilenilen birincil antikorlarla inkübe edin.Tüpleri yatay olarak buzun üzerine yerleştirin ve sallanan bir platform üzerinde 30 dakika boyunca hafifçe karıştırın. Hücreleri döndürdükten sonra, süpernatanı atın ve ardından sıralama örneğini 20 mililitre soğuk kültür ortamında ve kontrol örneklerini 200 mikrolitrede yıkayın. Şimdi, sıralama örneğini 2.5 mililitrelik bir son hacimde, soğuk kültür ortamında uygun ikincil antikorlarla inkübe edin ve kontroller, aynı 200 mikrolitrelik bir son hacimde, bu sırada uygun kontrol tüpüne yeni hazırlanmış PE anti-US CD 90.2 antikoru ekleyin.Bir kez daha, tüpleri sallanan bir platform üzerinde 30 dakika boyunca buz üzerinde yatay olarak yavaşça karıştırın. Hücreleri döndürdükten sonra, sıralama örneğini 20 mililitre soğuk kültür ortamında ve kontrolleri 200 mikrolitrede tekrar süspanse edin ve hücreleri ortamda iki kez yıkayın. Sıralama numunesini, propidyum iyodür ile takviye edilmiş iki ila üç mililitre soğuk kültür ortamında ve boyanmamış hücreler hariç kontrollerin her birinde 300 mikrolitrede yeniden süspanse edin.Daha sonra, her bir hücre süspansiyonunu, beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı test tüplerine bağlı 35 mikronluk bir kapak hücre süzgecinden süzün ve süzgeç kapaklarındaki herhangi bir kalıntı hücre süspansiyonunu tüplere zorlamak için tüpleri santrifüjleyin. Ardından, her bir hücre süspansiyonunu yeniden askıya almak için tüplerin kenarlarına hafifçe vurun ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin. TG 30 GCTM iki floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması için akış sitometresini, ayrışmış Hess hücre süspansiyonlarının potansiyel kümeleri ve çiftleri ortadan kaldırmak için tek hücreler olarak kapılanacak şekilde ayarlayın.Daha sonra, yalnızca sağlam hücrelerin sıralanması için ön ve yan saçılma kapıları ile potansiyel kalıntıları temizleyin. Daha sonra canlı olmayan hücreleri propidyum iyodür ekspresyonuna göre hariç tutun. Fare embriyonik fibroblastlarını veya metamfetamin besleyici hücrelerini, fare CD 90.2 pe ekspresyonlarına dayalı olarak negatif seçimle dışarı çıkarın.TG 30 G CTM'yi, boyanmamış hücreler için arka plan otofloresansına ve ayrıca izotip kontrollerine göre iki negatif yürüyüşe ayarlayın. Metamfetamin besleyicilerden arındırılmış izole edilebilir canlı HESC fraksiyonu daha sonra son olarak TG 30 negatif GCT M, iki negatif TG 30 düşük GCT M, iki düşük TG 30 orta GC TM, iki orta ve TG 30 yüksek GCTM iki yüksek alt popülasyona ayrılabilir. Akış sitometresini kurduktan sonra, iki adet beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı test tüpünün her birine bir mililitre metamfetamin şartlandırılmış ortam ekleyin ve bunları buzun üzerine yerleştirin.Daha sonra, farklılaşmış TG 30 negatif GC TM iki negatif ve pluripotent TG 30 yüksek GCTM iki yüksek hücre alt fraksiyonundan her biri 400.000 hücreyi kurtarın. Toplama tüplerini döndürdükten sonra, resus her bir hücre peletini bir mililitre önceden dengelenmiş MEF şartlandırılmış ortamda süspanse eder. Daha sonra, metamfetamin şartlandırılmış ortamdaki her fraksiyondan HESC ile önceden dengelenmiş, üçte bir MEF yoğunluğu T 75 şişesini tohumlayın, hücre kültürlerini 37 santigrat derecede% 5 CO2'de inkübe edin ve ortamı yaklaşık iki hafta boyunca günlük olarak tazeleyin.Pluripotent TG 30 yüksek GCTM iki yüksek hücre kültürleri, bir hafta sonra insan kök benzeri koloniler gösterir ve dokuz ila 11 günde yaklaşık% 80 co akıcılığına ulaşır. TG 30 negatif GC TM iki negatif hücre kültürleri çoğunlukla 11 ila 13 gün içinde ko-akıcılığa ulaşan hücreler gibi fibroblastların bir çimi olarak büyür. Hücre yüzeyi antijenleri TG 30 ve GC TM iki'nin kombine tespiti, pluripotent aşamada ve erken HESC farklılaşmasının çeşitli aşamalarında, kök hücre belirteçlerinin ve soya özgü transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonu ile belirtildiği gibi, bir dizi hücre alt kümesinin ayrımına izin verir. önceki raporlarla uyumlu olarak, TG 30 GC TM iki negatif düşük, orta ve yüksek alt fraksiyonlar, bu çalışma için kullanılan insan embriyonik kök hücre erkek tek hat içinde ayırt edilebilir, burada bir TG 30 GCTM iki akışlı sitometri analizine özgü farklı kapılı alt popülasyonların yüzdeleri burada gösterilen deneyde gösterilmiştir.Tanımlanmış sayıda TG 30 negatif GCT M iki negatif hücre, yaklaşık iki hafta boyunca tasnif edildikten sonra art arda kültürlendi ve daha sonra yeniden kaplamadan önce sadece TG 30 negatif GCT M iki negatif fraksiyonu toplamak için başvuruldu. Her geçişte sonuçlar, başlangıçtaki TG 30 negatif GCT M iki negatif alt fraksiyonun, ardışık paketlemeden sonra TG 30 negatif GCT M iki negatif farklılaşmış hücre için zenginleştiğini göstermektedir. İlk geçişte TG 30 yüksek GCT M iki yüksek hücrenin küçük bir popülasyonu tespit edilir, ancak sonunda daha fazla paketleme ile kaybolur ve geriye sadece pluripotent kök hücre içermeyen örnekler kalır.Burada, 14 gün sonra farklılaşmış TG 30 negatif GCT M iki negatif hücrenin çiminin tipik morfolojisi gösterilmektedir. 14 gün sonra görülen sporadik HESC benzeri kolonilerin, büyük olasılıkla kirletici TG 30 yüksek GCT M iki yüksek hücre tarafından üretilen TG 30 negatif GC TM iki negatif hücre ile karıştığını unutmayın. Bunun sadece nadiren meydana geldiğini ve bu testi kullanan önceki gözlemlere dayanan ilk olay sonrası pasajda, TG 30 yüksek GCTM iki yüksek hücrenin toplanması ve kültürünün, pluripotent HSC'ler oluşturan koloni için zenginleştirilmesi beklenmektedir.Bu nedenle, akış sitometrisi ile sıralandıktan sonra pluripotent TG 30 yüksek GCTM iki yüksek hücrenin ardışık paketlenmesi de bu temsili kültürlerde araştırıldı, hücreler TG 30 ve G CT M iki kullanılarak faksla sıralandı ve her geçişte sadece TG 30 yüksek G CTM iki yüksek hücrenin yerini aldı. Bu şekilde, hücrelerin çoğunluğunun, TG 30 negatif G CTM iki negatif hücrenin küçük bir yüzdesini ayırt etme ve yeniden oluşturma kapasitesini koruyan zenginleştirilmiş bir pluripotent hücre popülasyonunu gösteren pluripotent hücre ile ilişkili alt fraksiyonlarda bulunduğu gözlendi. Ayrıca, TG 30 yüksek G CTM iki yüksek sıralanmış hücrenin ardışık kültürleri, geçiş sonrası çok sayıda HESC benzeri koloni sergiler ve aynı zamanda pluripotens durumunun korunmasını da gösterir.Bu prosedürü denerken, sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için her seferinde kullanmadan önce faks makinesini kalibre etmeyi unutmamak önemlidir. Mikrodiziler, tüm genom dizilimi veya teratomlar gibi diğer yöntemler, bu hücreler geliştirildikten sonra gerçekten pluripotent midir gibi soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, indüklenmiş pluripotent kök hücreler alanındaki araştırmacıların, insan embriyonik kök hücrelerine kıyasla bu hücrelerin güvenliğini ve stabilitesini keşfetmelerinin yolunu açtı.Bu videoyu izledikten sonra, periet hücreleri için zenginleştirme yapmak amacıyla insan enbr kök hücrelerinin karışık kültürlerinin nasıl dikkatli bir şekilde hazırlanacağını ve boyanacağını iyi anlamış olmalısınız. İnsan hücreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven giymek ve güvenlik kabini ile ikinci sınıf ile çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

enrichment-purging-human-embryonic-stem-cells-detection-cell-surface

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tregs bağışıklık sisteminin güçlü bastırıcılar. Bunları tanımlamak için benzersiz yüzey belirteçleri bir eksikliği vardır, dolayısıyla, Tregs tanımları öncelikle fonksiyonel. Burada bir optimize...

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Burada, ayrışmış tek hücrelerin koloni dışı tip tek tabakalı (NCM) büyümesine dayanan insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür protokollerini sunuyoruz. Rho ile ilişkili kinaz inhibitörleri veya laminin izoform 521 (LN-521) kullanan bu yeni yöntem, büyük miktarlarda homojen hPSC'lerin üretilmesi, genetik manipülasyon ve ilaç keşfi için uygundur.

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Fare embriyonik fibroblastı, transkripsiyon faktörleri Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc'nin zorla ekspresyonu ile düşük verimlilikte indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanabilir. Yeniden programlama reaksiyonunun nadir ara ürünleri, hücre yüzeyi yapıcıları Thy-1.2, Ssea-1 ve Epcam'a karşı antikorlarla etiketleme yoluyla izole edilen FACS'dir.

Bir programlayabilme Fare Modeli iPS Hücre araürünler Hücre Yüzey Etiket Aracılı Arıtma

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden hemojenik endotel ve multipotansiyel hematopoietik progenitörlerin verimli indüksiyonunu açıklar.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

Burada, alt uygulamalar ve diğer farklılıklar iyileştirilmesi için kesin endoderm doğru kararlı farklılaştırılmış insan embriyonik kök hücrelerinin saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Yaratılan Endoderm Hücrelerinin Saflaştırılması Hızlı ve Etkin Yöntem

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Primordial germ hücreleri (PGCs) ortak öncüleri sperm ve yumurta vardır. İnsan embriyonik PGCs pluripotent epiblast hücreleri sitokinler etkileşimleri aracılığıyla belirtilir. Burada, biz insan hücreleri transcriptomally embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotency indüklenen pluripotent kök hücreler, PGCs benzeyen inducing bir 13 günlük iletişim kuralı tanımlamak.

Pluripotent kök hücre üretimi insan ilkel Germ hücreli benzeri hücre Embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotent adlı indüklenen

Bu makalede, OP9/DLL1 co-kültür sistemini kullanarak fonksiyonel tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre türetilmiş CD8αβ+ tek pozitif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

Bu video laboratuarımızda rutin tripsin tonlar insan embriyonik kök hücre hatları geçişleri nasıl göstermektedir.

Tripsin ile Pasajlanması tonlar İnsan Embriyonik Kök Hücre hatları

Öğrenin, TG30 ve GCTM-2 monoklonal antikorları ile FACS kullanarak insan embriyonik kök hücrelerini zenginleştirme ve temizleme yöntemini. Bu teknik, plüripotent hücreleri farklılaşmış hücrelerden ayırarak kök hücre biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

Monoklonal Antikorlar TG30 ve GCTM-2 Kullanılarak Hücre Yüzey Antijenlerinin Tespiti ile İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Zenginleştirilmesi ve Temizlenmesi (Video) | JoVE Journal

Monoklonal Antikorlar TG30 ve GCTM-2 Kullanılarak Hücre Yüzey Antijenlerinin Tespiti ile İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Zenginleştirilmesi ve Temizlenmesi

Daha fazla video keşfet