Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, salgılanan bileşiklerin aracılık ettiği ve bakteriyel gen ekspresyonunda değişikliklere yol açan farklı mikroplar arasındaki etkileşimleri belirlemektir. Bu, floresan transkripsiyonel bir raportör içeren bakteri suşunun agar Petri plakaları üzerinde koloniler halinde çevresel mikroplarla kültürlenmesiyle elde edilir. Turuncu daireler, çevresel mikropların kolonilerini temsil eder.

Mavi daireler raportörün kolonileri iken, katı ortamdaki büyüme, bu kolonilerin ürettiği metabolitlerin agar boyunca yayılmasına ve yakındaki raportör kolonilerde gen ekspresyonunu aktive etmesine izin verir. Burada yıldızlarla gösterilen potansiyel isabetler, raportördeki gen ekspresyonunu değiştiren bileşikler salgılayan kolonilerdir. Bu organizmalar, ko-kültür elek plakalarından izole edilir.

Bu potansiyel indükleyiciler, raportörde bakteriyel gen ekspresyonunu değiştiren molekülleri salgılayan organizmalar olduklarını doğrulamak için ikincil bir ekranda yeniden test edilir. Bu yöntem, bacillus subtles'in toprak organizmaları ile biyofilm oluşturan etkileşimleri hakkında bilgi sağlasa da, stafilokok veya pseudomona türlerinde virülans ekspresyonunu etkileyen mikrobiyal etkileşimler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Gerçekten de, teorik olarak, genetik olarak izlenebilir herhangi bir mikropta herhangi bir raportör için gen ekspresyonunu değiştiren mikrobiyal etkileşimleri tanımlamak için uygulanabilir Seçtiğiniz organizma için floresan raportör yapıları oluşturduktan sonra, metin protokolüne göre, toprağı ve konik tüpleri toplamak için bir spatula kullanmadan önce açıkta kalan yüzey toprağının üst 0,5 santimetresini kaldırarak toprağı toplayın, Bir toprak bulamacı yapmak için bir gram toprak başına 10 mililitre oranında% 0.85 steril tuzlu su ekleyin ve bakterileri toprak parçacıklarından çıkarmak için bir dakika boyunca girdap yapın.

Toprak bulamacının bir dakika boyunca çökmesine izin verdikten sonra, üst sulu tabakayı yeni bir tüpe aktarın, raportörü ve toprak örneklerini metin protokolüne göre seyreltin ve her birinden 50 mikrolitreyi tek başına raportör yapısını aktive etmeyecek koşullar altında ko-kültür elek plakalarının merkezine yerleştirin. Ayrıca tek başına bir toprak numunesi ve tek başına bir muhabiri kontrol olarak plakalayın. Her bir plakaya yaklaşık 23 milimetre steril cam boncuk ekleyin ve plakaları tezgah üstünde tutarak ve ileri geri sallayarak hücreleri yayın.

Sıvı emilene kadar döndürürken, plakaları ters çevirin ve boncukları etanol içeren bir atık behere atın. Ko-kültür plakalarını floresan kullanarak inkübe ettikten ve plakanın üstünden başlayarak, plakayı görüş alanı boyunca parlak noktalara doğru yavaşça ileri geri hareket ettirin. Bir tam taramadan sonra, plakayı 90 derece çevirin ve işlemi tekrarlayın.

Bir floresan nokta tespit edildiğinde, parlak alan aydınlatmasını yavaşça açın ve floresanın bir bakteri kolonisi ile ilişkili olup olmadığını belirleyin. Floresan kolonilere yakın floresan olmayan koloniler olacak varsayılan indükleyici organizmaları izole etmek. Bunları görüş alanının ortasına ve flüoresan lambayı açık bırakarak baskın elinizle erişebileceğiniz bir yere yerleştirin.

Floresan koloniyi ve çevresindeki indükleyici organizmaları şekle göre tanımlamak ve konumlandırmak için Brightfield'ı yavaşça açın Bir cam çubuk kullanarak, steril yuvarlak 200 mikrolitrelik jel yükleme ucunu alın ve bir kalem gibi tutun. Çalışma yüzeyinde sabitlemek için dış avucunuzu sahneye yaslayın. Ardından, pipet ucunu plaka yüzeyinin üzerinde tutarak toplama aletini sabitlemek için diğer elinizi elinizin iç baş parmağı tarafına koyun.

Onu görüş alanına taşıyın ve seçmek istediğiniz koloninin üzerinde ortalayın. İpucu odak dışı olacaktır. Elinizin dış kenarını kullanarak pipet ucunu yavaşça toplanacak koloniye doğru döndürün.

Toplama aletini döndürmeden ucun diğer kaç koloniye temas ettiğini en aza indirmeye çalışarak çok hafifçe dokunun. Ucu taze bir tabağın bir bölümüne sürün. Kolonileri topladıktan sonra, plakaları tahlil yönergelerine göre inkübe edin.

Koloniler görünür olduğunda, plaka üzerinde tek veya birden fazla organizma türünün büyüyüp büyümediğini belirlemek için bir stereoskop kullanın Her morfo türünü taze bir tabağa yeniden çizin ve büyüyene kadar kuluçkaya yatırın. Varsayılan indükleyicilerin gerçek indükleyiciler olup olmadığını test etmek için, raportörün çimlerini ve floresan olmayan ebeveyn suşlarını hazırlayın. Plakalar kuruduktan sonra, test kolonilerinden hücreleri toplamak için steril kürdan kullanın.

Boş bir tabağa ve ardından iki çim tabağına yamalayın. Alternatif olarak, resus, varsayılan indükleyici organizmaları steril bir plastik veterinerde bir mililitre sıvı ortamda askıya alın ve her süspansiyonun OD'sini normalleştirdikten sonra süspansiyonların OD 600'ünü ölçün, her süspansiyonun bir mikrolitresi olan 0.5 noktalık bir OD 600'e ulaşmak için üç plakanın her birine. Son olarak, organizmaların büyümesine izin verdikten sonra, floresan raportör suşunu aktive eden, ancak ebeveyn kontrol suşunu aktive etmeyen varsayılan indükleyici organizmaları tanımlamak için bir diseksiyon mikroskobu altında floresan kullanın.

Buradaki ekran, bir floresan transkripsiyonel raportör kullanılarak biyofilm matrisinin yapısal bir bileşeninin gen ekspresyonunu b inceliğinde değiştiren bileşikleri salgılayan toprak organizmalarını tanımlamak için kullanıldı. İdeal olarak, her bir ko-kültür plakası, yakın aralıklı bireysel koloniler olan toprak kolonilerine bire bir oranında raportör içermelidir. Burada, kahverengi daireler olarak gösterilen toprak kolonilerine göre mavi daireler olarak gösterilen yüksek bir raportör koloni oranına sahip olmanın, ko-kültür plakalarından gerçek indükleyici organizmayı belirlemede güveni nasıl artırdığını gösteriyoruz.

İndükleyici toprak organizmaları, muhabiri aktive eden bileşikler salgılar. Yıldızlarla gösterilen diğer varsayılan indükleyicilerden kırmızı ile gösterilen gerçek indükleyicilerin tanımlanmasını kolaylaştıran, daha yüksek raportör / toprak oranı ile plaka üzerinde birden fazla raportör kolonisi indüklenecektir. Besin içeriği, büyüme kolonisi oluşumunun derecesini kontrol ederken, aşının seyreltilmesi, ortaya çıkan kolonilerin uygun şekilde dağılıp dağılmadığını belirler.

Bu ko-kültürde görüldüğü gibi, görüntü B incelikleri, topraktan gelen çok sayıda mikroba yanıt olarak bir floresan biyofilm matrisi üretir. İncelediğimiz topraklar için, Ptap A YFP matris muhabiri için yüksek bir isabet oranına sahiptik. Bu, benzer ekranlardan elde edilen yayınlanmamış sonuçlarımızın aksine.

Sporülasyon ve yetkinlik kullanılarak muhabirler çok azdı veya hiç isabet tespit edilmedi. Bu nedenle, farklı hücre tipleri için HI oranları oldukça değişkendir ve önceden tahmin edilmesi zor olabilir. Burada, potansiyel indükleyici kolonilerin izolasyon için seçilmesinden önce ve sonra iki ko-kültür ekran plakası örneği gösterilmiştir.

Hem yama hem de nokta yönteminden elde edilen negatif ve pozitif sonuçlar burada gösterilmektedir ve ikincil ekranımızda incelenen kolonilerin yaklaşık% 50'si gerçek pozitiftir. Bu prosedürü takiben, ek soruları yanıtlamak için başka yöntemler de gerçekleştirilebilir, örneğin indükleyici organizmanın filogenetik kimliğini belirlemek için 16 s SR DNA dizilimi veya aktif bileşiğin kimyasal kimliğini belirlemek için NMR'de HPLC kütle spektrometresi kullanmak.