Name: Pseudomonas aeruginosa itibaren MexAB dışa atım pompa in vitro olarak incelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-17T21:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Keşfedin MexAB dışa atım pompasının lipozomlarda yeniden yapılandırma yöntemiyle in vitro aktivitesini. Pseudomonas aeruginosa'da antibiyotik direnci mekanizmalarını anlamak için bu protokolü kullanın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Agence Nationale de la Recherche (proje ANR-2010-BLAN-1535) tarafından ve Bölge Ile-de-France (DIM-Malinf 110058) bir hibe ile desteklenmiştir.

1.. Protein Üretimi ve Saflaştırılması <ol><li> Mexa, Pseudomonas aeruginosa&#39;dan MexB <ol><li> , Bir E. Mexa ve MexB genleri barındıran plasmidleri Transform coli üretim suşu (örneğin C43 DE3). LB agar levhalar ortam, uygun antibiyotik ile takviye edilmiştir. O / N Önlüktür aşılamak için tek bir koloni seçin. Ertesi sabah, LB 1 L ön kültür aşılamak ve çalkalanarak (240 rpm) 37 ° C&#39;de büyür. </li><li> Hücreler üstel faz ulaştığında (OD 600 = 0.6-0.8) 1 mM IPTG ile neden. Ajitasyon altında 30 ° C&#39;de 2-3 saat boyunca indüksiyon yapın. </li><li> Santrifüj hücreleri (20 dakika boyunca 9,000 x g) ve 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCI 150 mM olarak tekrar süspansiyon. </li><li> Bir Fransız basını (10,000 psi, 4 geçişi) kullanarak hücreleri bozar. 20 dakika boyunca 9,000 x g de santrifüj ile bozulmamış hücreler ve cisimciği atın. </li><li> 100.000 xg ve r Pelet membranlar 1 saat30 ml Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 20 gliserol (a / h), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl, her pelet esuspend. </li><li> BCA kolorimetrik deneyi kullanılarak toplam membran protein konsantrasyonu belirlenir ve bu, deterjan şekilde belirlenen bir son hacim içinde% 2 dodesil maltoside (DDM) ile zarları O / N çözündürülmesi: protein (a / a) 1:1.5. </li><li> Non çözündürülmüş ve toplanmış malzemenin atmak için 1 saat boyunca 100,000 x g&#39;de Ultrasantrifüj. </li><li> Bir nikel reçinesi (Mexa saflaştırma) ya da Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 5 gliserol ile dengelenmiş bir kobalt reçinesi (MexB saflaştırma) ile 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe supernatant (ağ / h), 10 mM imidazol, NaCl 500 mM, DDM% 0.2. </li><li> Boş bir sütunun içindeki reçineyi dökün. Sayesinde Akışı toplayın. </li><li> Daha sonra Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 20 gliserol (a / h), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl,% 0.2 DDM, Bis-Tris 10 mM, pH 6, gliserol, 25 ml ile 50 ml reçine yıkayın % 5 (ağ / h), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl,% 0.2 DDM. </li><li> P Zehir20 mi Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 5 gliserol (ağ / h), 300 mM imidazol, 500 mM NaCl,% 0.2 ile DDM K&#39;e. </li><li> Bir imidazol içermeyen tampon maddesi ile dengelenmiş bir tuz giderme kolonu üzerinde 3 ml ve yüke göre aşağı bir ultrafiltrasyon cihazı ile protein konsantre edilir. Sadece daha önce sulandırma (aşağıya bakınız), çözünür proteinler lipid ve çözülmeyen proteinlerin kurtulmak için (20 dakika boyunca 100,000 xg) Ultrasantrifüj. Daha sonra 0.3 ml yeniden protein konsantre edin. </li></ol></li><li> Halobacter salinarium dan bacteriorhodopsin <ol><li> 4 M NaCl, MgSO 4 150 mM, 10 mM sitrat, 30 mM KCl, maya özütü 5 g / L, pepton ve 5 g / L ihtiva eden bir likit büyüme ortamı içinde 10 gün boyunca 37 ° C&#39;de aydınlatma altında Halobacter salinarium hücrelerin büyümesine </li><li> Iyonu giderilmiş suya karşı diyaliz hücreleri bozabilir. </li><li> Bir% 30-40 üzerinde mor membran (ağ / hac) sakroz gradyanı (17 saat boyunca 100,000 x g) saflaştırılır. </li><li> % 2 octylgluc ile zar süspansiyonu çözünürleştirilir37 ° C (: protein oranı, 2:01 (a / a) deterjan de membran tekrar süspansiyon için çözündürme için hacim) 24 saat boyunca oside. Ε (570 nm) = 54000 M-1cm-1 ile çözündürülmüş BR konsantrasyonunu tahmin. Sadece daha önce sulandırma (aşağıya bakınız), lipidler ve çözülmeyen proteinlerin kurtulmak için çözündürülmüş BR (20 dakika boyunca 100,000 xg) Ultrasantrifüj. Not: yerel Zarlar doğal çok daha fazla saflaştırma gerekli br zenginleştirilmiştir. </li></ol></li></ol> 2. Proteoliposomes hazırlanması <ol><li> Lipozom sistemi: bir cam beher içinde kloroform ile (25 mg / ml) içinde çözülmüş DOPC 400 ul koyun ve bir toz olarak saklanır kolesterol 1,5 mg ekleyin. Bir cam kap içinde, en az 1 saat boyunca azot ya da sadece bir vakum buhar altında manipülasyon önce onları kurutun. DOPC: kolesterol mol oranının 3.3:1 olduğunu. <ol><li> Bu kuruduktan sonra, 25 mM HEPES pH 7, 1 ml ile lipitleri hidratK 2 SO 4 100 mM, 2 mM MgCl2, 2 mM pyranine. Süspansiyon bu aşamada bulanık görünmelidir. </li><li> 37 ° C&#39;de 10 dakika için çözüm ısıtın 30 saniye darbe, oda sıcaklığında 30 saniye aralık döngüsü ile 40 W da 10 dakika için sonikasyon. Süspansiyon bu aşamada net görünmelidir. </li><li> Lipozomların bir tek dağılımlı popülasyonu elde etmek için, ekstrüzyon, iki döngü yapabilir ve her bir döngü için, en az 11x filtreden lipozom süspansiyonu geçmektedir. İlk çevrim için, 200 nm&#39;lik bir zar gözenek boyutuna kullanımı ve ikinci çevrim için, 100 nm&#39;lik bir zar gözenek boyutu kullanın. Dinamik ışık saçılım ölçümleri, süspansiyonun homojenliğini kontrol etmek için bu aşamada gerçekleştirilebilir. </li></ol></li><li> Protein şirketleşme İlke: zar proteinleri deterjanların çözündürücü etkisi sayesinde Lipozomlar içinde yeniden edilebilir. Deterjan-çözünebilir lipozomlar p-çözünür deterjan zar proteini ve oluşumu ile kuluçkalanırroteoliposomes polistiren boncuklar 9 deterjan hızla ortadan kaldırılması ile tetiklenir. <ol><li> Triton X-100 (son% 0.56) içinde 28 mg eklenir ve 4 ° C (çözünürleştirme sıcaklık, protein çalışılmaktadır adapte edilebilir) de O / N inkübe edin. </li><li> Çözündürülmüş lipozomlara deterjan-çözünür protein (BR, MexB ve Mexa) ilave edin ve 4 ° C&#39;de 15 dakika inkübe Lipidler / MexB = 20, MexB / Mexa = 2.5 ve lipidler / BR = 30: Aşağıdaki oranlarda (ağırlık / ağırlık) seviyesinde çözündürülmüş lipozom süspansiyonuna proteinleri ekleyin. </li><li> (Saflaştırılmış protein ile eklenmiştir deterjan içeren deterjan toplam ağırlığı göz önüne alındığında w / w,) deterjan oranı ve yumuşak altında oda sıcaklığında (nedeniyle BR) karanlıkta 5 saat, inkübe edilir: a 30:1 boncuk polistiren boncuk ekleyin karıştırıldıktan. Bundan önce prosedüre, metanol ve etanol inkübasyon ile Biobeads etkinleştirmek ve yaygın olarak, su ile yıkayın. </li><li> , Bir PD-10 kullanılarak proteoliposomes protein ve serbest alt tabakaları arındırınHEPES, 25 mM pH 7, K 2 ile dengelenmiş tuz alıcı sütun SO 4 100 mM ve 2 mM MgCI2. </li><li> Kadar 2-3 hafta boyunca karanlıkta 18 ° C &#39;de proteoliposomes saklayın. </li></ol></li><li> Sükroz gradyanı üzerinde yeniden oluşturma etkinliğinin değerlendirilmesi. MexB ve BR hem lipozomlarda yeniden olup olmadığını kontrol etmek için, bir süreksiz sukroz gradient proteoliposome süspansiyon arındırmak. <ol><li> Yavaşça sakaroz beş tabakalı bir gradyanı üzerinde proteoliposomes yerleşmek (% 60,% 20,% 10,% 5 ve% 2.5 ağ / h). </li><li> (Minimal hızlanma ve yavaşlama oranları ile) 100,000 xg&#39;de 17 saat Ultrasantrifüj. </li><li> Dikkatlice çeşitli gradyan fraksiyonları (sükroz her katman arasında özellikle arayüzler) toplamak ve Coomassie boyama ya da Batı lekeleme ile SDS-PAGE (% 10) üzerinde analiz. Katılmayan, deterjan-çözünür proteinler en üstünde bulunan ise kümelenen proteinlerin, tüpün alt kısmında bulunantüpü. Proteoliposomes ve lipozomlar, kendi iç yoğunluğuna karşılık gelen sükroz arabirimleri bulunur. Boş lipozomlar proteoliposomes daha Degradede öteye kurtarıldı. </li></ol></li></ol> 3. Floresan ölçümü <ol><li> Dual dalga boyu ölçümleri için izin veren bir spektrofotometreyi (Xe lambası, 150 W) ile 25.0 ° C &#39;de flüoresan ölçümlerini gerçekleştirir. Alternatif aydınlatma dönemleri (550 Nm / 550 nm uyarma / emisyon dalga boyları ile BR etkinleştirmek için) ve pyranine floresan ölçmek için 2 saniye boyunca 455 nm / 509 nm uyarma / emisyon dalga boylarında floresans ölçümleri. 5 nm uyarma ve emisyon bant genişlikleri ayarlayın. Bir ters zar potansiyeli ΔΨ oluşumunu önlemek için 50 nM valinomycin mevcudiyetinde ölçümleri yapın. Not: Aslında, BR proton pompalar, çünkü dışarıda daha lipozom içinde daha olumlu ücretleri vardır. Bu ücretgradyan bir K + iyonofor seçici olan, valinomycin ile iptal edilebilir. Bir kez lipozomlar, süspansiyon valinomycin ilave bir hidrofobik molekül olarak, lipozom zarı içine yerleştirin pasif olarak K + taşıma ve bu nedenle, membran potansiyeli ΔΨ buharlaşır. </li></ol>

<ol><li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us%3F+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li>
<li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li>
<li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li>
<li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li>
<li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li>
<li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134(2009).</li>
<li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li>
<li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li>
<li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li>
<li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes%3A+caveats+and+keys%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li>
<li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis%2C+edited+by+iConcept+Press%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li>
<li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li>
</ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Bu membran proteini taşıma test etmek için tasarlanmış bir yeniden oluşturma işlemi tarif eder. Bir kez kurulan, protein sulandırıldıktan prosedürü çok tekrarlanabilir ölçümlere yol açar. Bununla birlikte, protein yeniden yapılandırmak için tam koşullar, bir proteinin diğerine değişecektir. Kadar bakım aşağıdaki parametrelerini optimize alınmalıdır: arıtma (saflık ve toplanan malzemenin yokluğu) i) kalitesi, deterjan eritici aşama (mümkünse ii) verimlilik, düşük cmc deterjan tercih edilmelidir onlar için daha kolay çünkü ) kurtulmak, deterjanın iii) desorpsiyon (bir diyaliz aşaması ile polistiren boncukların kullanımını birleştirmek için ancak bu desorpsiyon oranını, proteinin daha sonraki aktivitesi için kritik bir parametre etkileyebilir Örneğin mümkündür, ref [bakınız 9]), iv) lipid sulandırma (lipid kimyasal doğası, protein oranı, ilave amphiph varlığına lipidiles) çeşitli ve optimize edilmesi gereken kritik parametreler vardır. Ilavesi sıcaklık ve inkübasyon zaman içinde tüm bu sorunları etkiler. Kalite kontrol yeniden oluşturma prosedürü her adımında böylece ilkel olduğu. Bu, hızlı bir geri dönüşlü ve sadece mikromolar arasındaki bir konsantrasyonda örnek 20 ul gerektirdiğinden Bu açıdan bakıldığında, ışık dağılımı çok uygun bir yöntemdir. Nitel (protein gerçekten lipozom zarı içine gömülü) yanı sıra, kantitatif (kaç protein bir lipozom içinde): proteoliposomes oluşturulmaktadır kez sulandırma sistematik doğrulama doğru yol açar, çünkü, sukroz gradyanlı çok yardımcı aynı zamanda. İkincisi tam protein ve lipid konsantrasyonlarının ölçülmesi ile ele alınacaktır. Bizim deney alt-tabakanın kendisinin titre bağlı değildir ve bu olası suni pasif difüzyon ile ilgili rahatsızlık hususlar önler<html> nedeniyle zarlarında hidrofobik bölümleme için molekülü. Tahlil izleme pH değişiklikleri için güvenilir ve kantitatif prob olarak pyranine özelliklerini kullanır. Bizim sonuçlar proton degrade oluşumu 10 valinomycin kullanılarak gerçekleştirildi başka bir prosedür ile elde edilen sonuçlar ile uyum içindedir, ama daha sağlam ve tekrarlanabilir gradyan 11 verir. Buna ek olarak, sadece hassas proton gradyan (daha fazla detay için Verchere et al. 12) tamponun konsantrasyonu değiştirilerek, ayarlanabilir. Bir kontrol ölçümü birinci alt madde yokluğunda gerçekleştirilir prosedürde (bu proteinin aktivitesi pasif erişim sağlar). Alt-tabaka, aynı küvet içinde eklendikten sonra gerçek zar proteini taşıyıcı aktivitesi ölçülür. Deney gerçek olmayan, belirsiz, yüzey kaynaklı bir sonuç olarak kabul edilebilir, çünkü bu gerçekten bir varlıktır. örnek aydınlatıcı reaksiyon. Otomasyon ve paralelizasyon proteoliposome büyük bir parti hazırlarken oluşacak tetikler çünkü ent &quot;&gt; protokol, yüksek-orta verim (örneğin 96-kuyu ölçümleri) automatization adapte olabilir, ve bir 96 yılında hacimde dağıtma -kuyu plaka. Substratlar (ve aynı zamanda muhtemel inhibitörler) ilave edilir ve 45 dakika süreyle karanlıkta inkübe edildikten sonra plaka, bir mikroplaka okuyucusu üzerinde aydınlatma / pyranine floresan ölçüm döngüsüne tabi olacaktır. Protokolü hakkında ek bilgi için, okuyucular Verchere ark okumaya davet ediyoruz. 12,13

Yekpare zar proteinleri, ökaryotik genomlarında kodlanan genlerin kadar% 30 temsil eder. Bunlar kapı tutma (reseptörler), besin, iyonlar ya da zararlı bileşikler (taşıyıcılar) taşıma veya tüm canlı hücreleri 1 arasında membran bilayers (kanal) karşısında geçirgenliği korumak gibi çok önemli rolleri paylaşın. Akış antibiyotik tedavisinin 2 karşı direnç ve merkezi bir role sahip pompalar. Gram-negatif bakteriler ise bir dış zar ile korunmaktadır Pseudomonas aeruginosa, akış taşıyıcıları MexB, iç zar bulunan akış pompa, Mexa, periplazmik protein ve öprm ile birlikte çalışır üçlü sistemler, bir olarak düzenlenir dış zar kanalı. Sitoplazmik iç zar proteini geniş substrat spesifikliği olan bir enerji-bağımlı bir pompa görevi görür. Üçüncü bir periplazmik boşlukta bulunan ve bütün kompleksi stabilize düşünülmektedir ise dış zar protein porini gibi davranır <skadar&gt; 3. Aşağıda, Mexa MexB montajı için bir işlevsel tahlili tasarımına odaklanır. Yapısal bilgi Escherichia coli 4-7 homolog protein AcrB X-ışını tayin son 5 yıldır sayesinde üzerinde birikmiş. Açıkça bu taşıyıcı için işlevsel bir test tasarımı, dinamik ve kinetik verileri ile çift bu tür bilgilerin, önemli olmasına rağmen gerçek bir meydan okuma 8&#39;dir. Gerçekte, bu zar proteinleri, bir zar ortamda muhafaza edilmesi ve kapalı bir bölme elde edilecek alt-tabakanın bir vektörel taşınması için muhafaza edilmelidir. Proteoliposomes içine membran proteinlerinin Sulandırılması yoğun (Rigaud ve Levy 9) sunulan ve gözden geçirilmiştir. Bu protokoller lipozom zarı boyunca tabakaları izleyerek, örneğin zar proteinleri aktivitesinin izlenmesi için izin verir. Bu durumda sınırlamalar a kaynaklanantitrasyon substratların vailability (floresan radyoaktif, vb.) ve çoğu zaman alt-tabakalar, bu hidrofobik olan ve ne olursa olsun taşıyıcı varlığı zarlarını geçme eğilimi gerçeğinden. Bir alternatif olarak, bir ulaşım bir sonucu olarak meydana gelen kimyasal değişikliklere duyarlı bir raporlama boya spektroskopik varyasyonları takip edebilirsiniz. Yukarıda belirtildiği gibi, protonlar MexB ile taşıma enerji. Bu nedenle, uygun bir seçenek proton güdümlü alt-tabaka taşıma nedeniyle pH değişimleri izlemek için bir pH-duyarlı bir raporlama boyanın spektroskopik varyasyonları izlemektir. Bir flüoresan boyanın seçimi alt-tabakanın hidrofobik doğası nedeniyle herhangi bir suni önler. Ek bir zorluk, bir proton degrade kuşaktır. Birçok protokol literatürde bulunabilir. Bunlar arasında, valinomycin tekniğinin kullanımı yaygın ama biz 10-11 gerçekleştirmek için sıkıcı olduğunu göstermiştir. Üstelik olduğutekrarlanabilir değil ve geri dönüşümlü değildir. Biz, bakteriyorodopsin (BR), Halobacter salinarium bir ışık ile aktive olan proton pompası, halofilik deniz Gram-negatif aerobik zorunlu arke kullanımına başvurmuştur. Bu protein aydınlatma üzerine, BR lipozomların içine proton pompaları ve bu nedenle, alt tabakanın 12-13 taşımak için ihtiyaç duyulan proteini ile (iç asidik) ΔpH oluşturur MexB ile lipozomlara coreconstituted ve kapanır.

<table><tbody><tr><td>DOPC (1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin)</td> <td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93427</td><td></td></tr><tr><td>Valinomisin</td><td>İnvitrojen</td><td>V-1644</td><td></td></tr><tr><td>Piranin (8- hidroksipiren-1,3,6-trisülfonik asit)</td><td>İnvitrojen</td><td>H-348</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Dodesil-&beta;-D-maltopiranosid)</td><td>Affymetrix</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>Ekstruder kiti (ekstrüder, Hamilton gaz geçirmez şırıngalar)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbanlar</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac Kromatografi boş kolon</td><td>Biorad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Tuzdan arındırma kolonları</td><td>Bio-Rad</td><td>54805</td><td></td></tr><tr><td>Dinamik ışık saçılma cihazı</td><td>Wyatt Teknolojisi</td><td>DynaPro NanoStar</td><td></td></tr><tr><td>Florometre JASCO FP-6200</td><td>JASCO</td><td>6816-J002A</td><td></td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa itibaren mexab dışa atım pompa in vitro olarak incelenmesi

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

Membran protein taşınmasını izlemek için güvenilir araçlar için gelişmekte olan bir bilimsel ihtiyaç vardır. Bu taşıma onların aktivitenin kesin bir inceleme sağlayan bir biyo-taklit ortamında Gram-negatif bakteriler Pseudomonas aeruginosa&#39;dan akış pompaların yeniden oluşturulması için gelen bir yöntem sunuyoruz. Üç önkoşulları yerine getirilmesi: bir lipidik çevre, ulaşım için uygun bir dizin kullanımı, ve bir proton degrade nesil bölmeleştirme. Membran protein taşıyıcı birlikte bakteriyorodopsin, sağlam hem de ters çevrilebilir ve ayarlanabilir bir proton derecesi üreten bir ışık ile aktive olan proton pompası ile lipozomlara sulandırılır. Proteinin etkinliği pyranin, pH değerine bağımlı bir floresan sonda kullanarak, lipozom içinde meydana gelen pH varyasyonlarından çıkarılır. Bir adım adım prosedür zar proteini saflaştırılması, lipozom formasyonu, protein yeniden oluşturulması, ve bir taşıma tanımlamaknalysis ele alınmaktadır. Onlar özellikle, bir taşıyıcı RND için tasarlanmış olmakla birlikte, tarif edilen yöntemler, potansiyel olarak proton gradyanı ile enerji başka bir membran protein taşıyıcı ile kullanım için adapte edilebilir.

Bu analiz, bir proton gradyan oluşturulur sırasında zamanın bir fonksiyonu olarak floresans izleme pyranine oluşur. Bu amaç için, numuneler (tetiklenir BR tarafından nedenle proton pompalama) aydınlatma alternatif tabi tutulur ve daha sonra uyarma ve emisyon dalga boyları kullanılarak pyranine ölçümü floresan (ex λ = 455 nm ve 509 nm λ em =). Şekil 1, bu BR tarafından üretilen proton gradyan geri doğrulayarak, Mexa / MexB yokluğunda, yöntemle elde edilen bir temsili kontrol göstermektedir. Asidifikasyon bir devir sonra proteoliposomes protonlar (proton konsantrasyon gradyanı aşağıdaki lipid çift tabakaları üzerinde yavaşça ve pasif olarak yaygın) pompalama durdurmak için BR için sırayla 45 dakika boyunca karanlıkta tutulur. Bu geri kazanım süresinden sonra, BR aktivasyonu sadece yine aynı süspansiyon aydınlatarak, mümkündür. Şekil 2,gerçek bir nakil ölçüme karşılık gelir. Protein içermeyen lipozomlar ile bir negatif kontrol, beklendiği gibi, pH (Şekil 2A ve 2B, portakal halkaları) aydınlatma üzerine sabit olduğunu göstermektedir. Ancak, membranlarda br içeren proteoliposomes, bu nedenle lipozom içinde azalır ve dengeli bir pH gradyanı inşa edilmiştir (Şekil 2A ve 2B, mor kareler) bir proton pompa yok. Gri üçgenler ve kırmızı elmas (Şekil 2A), sırasıyla, varlığında, Hoechst 33342 veya yokluğunda, BR ve MexB içeren proteoliposomes içinde pH değerini temsil eder. Biz proton degrade sadece kısmen MexB karşı-ulaşım tarafından harcanmış bir tabaka bağımsız aktivitesini gözlemlemek. Biz MexB bir bazal etkinlik için bu gözlem bağlıyor. MexB aktivitesine Mexa etkisini test etmek için, Mexa (ilk olarak bir alt-tabakanın yokluğunda, sulandırma ilave edildi <stRong&gt; Şekil 2B, mavi elmas). Yine, BR tarafından oluşturulan proton gradyanı sadece kısmen yayılır. Gerçek transport ölçümü aynı numune üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bundan önce, proton gradyan yeniden gerekir ve alt tabaka, protein içinde bağlama sitesi ulaşmak amacıyla süspansiyon içindeki eklenmelidir. Bu amaç için, süspansiyon 45 dakika için alt-tabakanın mevcudiyetinde karanlıkta inkübe edilir. Daha sonra aydınlatma üzerine, bir pompa ile alt-tabaka bir ulaşım sonucu olarak, BR tarafından oluşturulan proton gradyanı hemen tamamen MexAB (Şekil 2B, yeşil üçgen) tarafından yayılan olduğunu görebilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . BR aydınlatma tarafından inşa proton degrade Şekil 1 Tersinirlik: Pyranine flzamanın bir fonksiyonu olarak ölçülür BR proteoliposomes of uorescence. 0-15 dakika kaynaktan, BR ışık aktivasyonunun bir sonucu olarak protonları pompalar. 15-60 dk, proteoliposomes karanlıkta bekletilir; entravsekiler pH ve vezikül pH eşit olana kadar bu süre boyunca, protonlar pasif lipozomlann dışarı hareket ettirin. 60-75 dak, BR hala işlevsel ve aydınlatma üzerine proton pompalar. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> .. Şekil 2, nakliye deneyi: pyranine floresan, zamanın bir fonksiyonu kontrol lipozomlar (turuncu daireler) içindeki A) pH gibi, karşılık gelen pH değişimlerine dönüştürülür, zarda BR (mor kareler) ihtiva eden proteoliposomes içinde pH, pH içinde Hoechst 33342 (kırmızı d olmadan zardaki Br ve MexB içeren proteoliposomes bölgesinin. iamonds), Hoechst 33342 (gri üçgenler) B kontrol lipozomlar (turuncu daireler) içinde) pH ile membran içinde BR ve MexB içeren proteoliposomes içinde pH, zarın (mor kareler) BR ihtiva proteoliposomes içinde pH, pH içinde Hoechst 33342 (mavi karo) olmadan zardaki Br MexB ve Mexa içeren proteoliposomes arasında, Hoechst 33342 (yeşil üçgenler) ile membran içinde BR, MexB ve Mexa içeren proteoliposomes içinde pH.

Biz, Pseudomonas aeruginosa&#39;dan akış pompaları in vitro incelenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, lipozom zarı içinde sağlam, tersinir ve ayarlanabilir proton gradyanının oluşturulması için izin verir ve bu nedenle protomotive güç ile enerji herhangi bir zar proteini için uyarlanabilir olmalıdır.

Pseudomonas aeruginosa itibaren MexAB dışa atım pompa in vitro olarak incelenmesi

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

Bu prosedürün genel amacı, membran proteinlerinin sulandırılmasına dayanan fonksiyonel bir test kullanarak Pseudomonas aosa'dan FLX pump me AB'yi araştırmaktır. Lipozomlarda. Bu, önce zar proteinlerinin aşırı eksprese edilmesi ve saflaştırılması ile gerçekleştirilir, bakteri zar proteinlerinde B ve bakteriyel Rodin karıştırılır, daha sonra zarlardan ekstrakte edilir ve afinite kromatografisi ile saf saflaştırılır.İkinci adım, kurutulmuş bir lipit filmi pürin içeren tampon ile birleştirerek lipozomların hazırlanmasıdır, bu da multilam veziküllerin oluşumuna yol açar. Sonikasyonun ardından, lipozomlar homojen bir lipozom popülasyonu elde etmek için ekstrüde edilir. Daha sonra lipozom çözeltisine deterjan, membran proteinleri ve daha sonra polistiren boncuklar eklenir.Deterjanın hidrofobik kuyrukları, polistiren boncuklar üzerine emilim ekleyerek zar proteinlerinin daha sonra deterjan kayışını gevşetmesine ve lipozom zarına girmesine izin verir. Son adım, kapsüllenmemiş pürinin uzaklaştırılmasıdır Protea lipozomlarını bir tuzdan arındırma kolonunda çalıştırarak, büyük prot lipozomlar, kolonun üst kısmında sarılı kalan kapsüllenmemiş pürinden çok daha hızlı bir şekilde kolonun dibine ulaşır. Sonuç olarak, protal lipozomlar toplanır ve floresanları, bakteriyel opsin'in aydınlatılması üzerine oluşan pH değişikliği yoluyla Mex AB aktivitesini araştırmak için kullanılır.Rodin Effects pompaları, tüm antibiyotik ailelerinden çok çeşitli substratların tanınması ve taşınması nedeniyle antibiyotik direncini destekleyen taşıyıcılardır, membran protein etkileri için yeni ve güvenilir in vitro aktivite testlerine acil ihtiyaç vardır. Taşıyıcı. Gerçekten de, bu tür tahliller, taşınmanın moleküler mekanizmalarında yeni bilgiler sunacak ve yeni potansiyel inhibitör adaylarının farmakolojik taramasına yardımcı olacaktır. Pseudomona gin'den bir karışım, B-O-P-R-M, eFlex Perm karışımına odaklanıyoruz.Bir B ffl pompası karışımı için verimli bir in vitro fonksiyonel test tasarlamak için üç gereksinimi karşılamak için gerekli teknik tavsiyeleri ve yöntemi sunuyoruz, proteinin bir zar içinde oluşturulması, substratın vektörel taşınması için gerekli kapalı bölmenin kullanılması, ince bir baca gösterisi ve substratın adro doğası nedeniyle artefakt etkisinden kaçınan kalıp ve karışım AB için gerekli bir protein gradyanının oluşturulması fonksiyon. Testimizin gücü, bir lipozom zarında AB karışımı ile nstitute bakteri veya VR dediğimiz bir delta pH oluşturmak için tekrarlanabilir bir T etkin ve geri dönüşümlü pro gradyan üretme şeklimizdir. BR, aob salinium allic Marin gram negatif, zorunlu aerobik aans'ın mor zarından saflaştırılmış bir zar proteinidir.Aydınlatıldıktan sonra, bu protein aktif olarak proteinleri pompalar. Bu nedenle, BR, lipozomdaki protein ile birlikte oluşturulmuşsa, lipozomun ortadan kaldırılması, lipozomların içindeki proteinleri pompalayan br nedeniyle bir delta pH oluşturacaktır. Saf ve stabil protein materyalinin hazırlanması her şeyden önemlidir.Membran proteininin saflaştırma prosedürü, B'yi daha önce bir film J ovy yayınında ve ayrıca bu videoya eşlik eden metin protokolünde, bir zar protein karışımı A'nın saflaştırılmasının bir açıklamasının da bulunabileceği güzel bir şekilde açıklanmıştır Halabach Salinium'dan bakteri Rodin hazırlamak için, 10 gün boyunca 37 santigrat derecede aydınlatma altında halabach salinium hücreleri yetiştirin. Sıvı bir büyüme ortamında, deiyonize suya karşı diyalize ederek hücreleri parçalayın. Mor zarı %30 ila %40 sükroz gradyanında arındırın.Daha sonra, membran süspansiyonunu% 2 sektal glikozit ile çözündürün. 37 santigrat derecede 24 saat idi. Tüpü alüminyum folyoya sararak ışıktan koruyun.Sulandırmadan hemen önce metin protokolünde listelenen yok olma katsayısını kullanarak çözünmüş bakteri veya dozin konsantrasyonunu tahmin edin. Ultrasantrifüj Lipidlerden kurtulmak ve proteinleri çözündürmek için çözünen bakteriyel opsin. Lipozomları bir cam hoparlörde hazırlamak için, toz halinde depolanan 1.5 miligram kolesterolü tartın ve bir cam beherde kloroformda çözünmüş 400 mikrolitre diol fosfatidilkolin veya DOPC ekleyin, manipülasyondan hemen önce bir cam beherde en az bir saat vakum altında kurutun.Elde edilen DOPC / kolesterol molar oranı 3.3'e birdir. Lipitleri bir mililitre hebes tamponu ile kuruduktan sonra, süspansiyon turid görünmelidir. Bu aşamada, çözeltiyi 37 santigrat derecede 10 dakika ısıtın, alternatif 32. darbe, oda sıcaklığında 32. duraklama döngüsü ile 40 watt'ta 10 dakika sonikat ısıtın, süspansiyon net görünmelidir.Bu aşamada, prosedürün en kritik yönü, lipozomların sıkı ve tek dağılımlı bir süspansiyonunun elde edilmesidir. Bunu yapmak için, ekstra halka cihazını sızıntı olmayacak şekilde ayarlarken son derece dikkatli davranıyoruz. Ayrıca cihazı her kullanımdan sonra çok titiz bir şekilde temizliyoruz.Mono dispers bir lipozom popülasyonu elde etmek için, her döngü için iki döngü ekstrüzyon gerçekleştirin. Lipozom süspansiyonunu filtreden en az 11 kez geçirin. İlk döngü için 200 nanometrelik bir membran gözenek boyutu ve ikinci döngü için 100 nanometrelik bir membran gözenek boyutu kullanın.Bu noktada, süspansiyonun homojenliğini kontrol etmek için dinamik ışık saçılımı ölçümleri yapılabilir. Burada, bu adımın tipik bir sonucu gösterilmiştir. Membran proteinleri, deterjanların çözündürücü etkisinden dolayı lipozomlarda yeniden oluşturulabilir.Çözündürülmüş lipozomlar, deterjanla çözünen zar proteini ve protea oluşumu ile inkübe edilir. Lipozomlar, deterjanın polistiren boncuklarla hızlı bir şekilde elimine edilmesiyle tetiklenir. Proteini dahil etmek için 28 miligram tritton X 100 ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Çözünmüş lipozomlara opsin Mex B ve Mex A bakterileri de dahil olmak üzere deterjanda çözünmüş proteini ekleyin ve dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Önceden etkinleştirilmiş polistiren boncukları ekleyin. 30'a bir arı / deterjan oranı ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında beş saat inkübe edin.Hafifçe karıştırarak, protia lipozom proteinini ve serbest substratları, Hess tamponu ile dengelenmiş bir PD 10 tuz giderme sütunu kullanarak saflaştırın. Hem Mex B'nin hem de opsin bakterisinin lipozomlarda sulandırıldığını kontrol etmek için, protea lipozom süspansiyonunu süreksiz bir sükroz gradyanı üzerinde saflaştırın. Proteozomu nazikçe beş katmanlı bir sükroz gradyanı üzerine yerleştirin.Daha sonra, ultraifikasyonu takiben yüz bin G'de 17 saat boyunca ultra santrifüjleyin, tüpün dibinde toplanmış proteinler bulunurken, tüpün üst kısmında dahil edilmemiş deterjan çözündürücü proteinler bulunur. Protea, lipozomlar ve lipozomlar, içsel yoğunluklarına karşılık gelen sakaroz arayüzlerinde bulunur. Boş lipozomlar, gradyanda prot lipozomlardan daha fazla geri kazanılır.Sodyum dyl sülfat ile analiz etmeden önce çeşitli gradyan fraksiyonlarını dikkatlice toplayın. Kumasi boyama veya batı lekeleme kullanılarak poli akrilamid jel elektroforezi. Çift dalga boyu ölçümlerine izin veren bir spektral florimetre kullanarak 25 santigrat derecede floresan ölçümleri yapın.İki saniye boyunca 455 nanometrelik bir uyarma dalga boyu ve 509 nanometrelik bir emisyon dalga boyu ile karakterize edilen pürin floresan ölçümleri ile 550 nanometrelik uyarma ve emisyon dalga boyları ile karakterize edilen bakteriyel rodini aktive etmek için aydınlatma periyotlarını değiştirin. Uyarma ve emisyon bant genişliklerini beş nanometreye ayarlayın. Ters membran potansiyelinin oluşmasını önlemek için ölçümleri 50 nanomolar liny varlığında gerçekleştirin.Burada gösterilen delta iç çekişi, Mex a, Mex B'nin yokluğunda tahlil ile elde edilen ve bakteriyel çubuk opsin tarafından üretilen proton gradyanının geri dönüşümlü olduğunu doğrulayan temsili bir kontroldür. Bir asitleşme döngüsünden sonra, Oreo lipozomları, opsin bakterisinin proton pompalamayı durdurması için 45 dakika karanlıkta tutulur. Bu iyileşme süresinden sonra, bakteri opsininin aktivasyonu sadece aynı süspansiyonun aydınlatılmasıyla mümkündür.Yine, gerçek bir taşıma ölçümü, protein içermeyen lipozomlarla yapılan negatif bir kontrolün, beklendiği gibi aydınlatma üzerine sabit bir pH'a sahip olduğunu gösterir. Bununla birlikte, zarlarında bakteri veya opsin içeren protea lipozomları proton pompalar. Böylece lipozomların içindeki pH azalır ve stabil bir gradyan oluşur.Gri üçgenler, aldatmaca varlığında bakteri veya opsin ve mex B içeren protea lipozomlarının içindeki pH'ı temsil eder. 3, 3, 3, 4, 2 boya. Kırmızı elmaslar, boyanın yokluğunda pH'ı temsil ederken, bir proton gradyanının, Mex A'nın Mex b B.In'nin aktivitesi üzerindeki etkisini test etmek için Mex'in bazal aktivitesine atfedilen Mex B karşı taşımacılığı ile yalnızca kısmen dağıtıldığı bir substrattan bağımsız aktivite gözlenir.Herhangi bir substratın yokluğunda, yine, bakteriyel opsin tarafından üretilen proton gradyanı sadece kısmen dağılır. Gerçek taşıma ölçümü aynı numune üzerinde gerçekleştirilir ve proton dizginlenir ve substrat, proteindeki bağlanma yerine ulaşmak için süspansiyona eklenir. Daha sonraki aydınlatmanın ardından, bakteriyel opsin tarafından üretilen proton gradyanının, pompa tarafından substrat taşınmasının bir sonucu olarak artık Mex AB tarafından tamamen dağıtıldığı görülebilir, Bu protokolü başka bir proteine uyarlamak için gerekli olan kesin koşulun burada açıklanandan farklı olabileceğini akılda tutmak önemlidir.Aşağıdaki parametrelerin, saflaştırmanın kalitesinin, deterjanın verimliliğinin, deterjanın çözündürücü adım desorpsiyonunun, lipit bileşiminin ve lipit-protein oranının optimize edilmesinde kibrit bakımı yapılmalıdır. Ek olarak, sıcaklık ve inkübasyon süresi periyotları tüm bu parametreleri etkilemeye eğilimlidir. Protokolümüz, r ve d flix pompa karışımının aktivitesinin daha iyi anlaşılmasına giden yolu açar B.Bununla birlikte, özellikle r ve d taşıyıcı için satılmışsa, bu yöntem herhangi bir PMF ile etkinleştirilmiş FFL spam taşıyıcısına uyarlanabilir.

in-vitro-investigation-mexab-efflux-pump-from-pseudomonas

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokolde, çözünebilir bir protein deterjan kompleksi olarak, ifade, çözünmüş ve recombinantly ifade membran proteini, MexB arıtma göstermektedir. MexB fırsatçı bakteriyel patojen Pseudomonas aeruginosa bir çok ilaca direnç membran taşıyıcı.

İfade, Deterjan çözünürleştirme ve Membran Transporter, MexB ilaca Direnç Protein Saflaştırılması

Kaynak: Bru, J., et.al. Bakteri Sürülerinin Hızlandırılmış Görüntülemesi ve Toplu Stres Tepkisi. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, bir sürü agar plakası testi kullanılarak Pseudomonas aeruginosa'da sürüden kaçınma davranışının nasıl görselleştirileceğini ve ölçüleceğini gösterir. Kontrollü koşullar altında hızlandırılmış görüntüleme kurulumunu gösterir ve antibiyotik kaynaklı stres sinyallerinin, görüntü analizi yoluyla ölçülen bakteri hareketini nasıl yönlendirdiğini açıklar.

Pseudomonas aeruginosa'da Antibiyotik Stresine Sürüden Kaçınma Tepkilerinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Burada multicopy plazmid rolü antibiyotik direncinin evrime sınamak için deneysel bir yöntem mevcut.

Multicopy plazmid rolü antibiyotik direnci gelişimi test

Burada, abd gıda ve ilaç İdaresi (FDA) onaylı Escherichia coli ticari uygulamalar için karşılaştırıldığında Pseudomonas aeruginosa genetik olarak değiştirilmiş suşlarının zayıflamasını değerlendirmek için enfeksiyon fare modelibasit ve tekrarlanabilir bir protokol açıklar.

Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test

Bu protokol, Caenorhabditis elegansbağırsak geçirgenliği ölçmek için nasıl açıklar. Bu yöntem bağırsak bakterileri ve ev sahibi arasındaki etkileşim ile ilgili bağırsak sağlığı temel biyolojik araştırma ve sızıntılı bağırsak sendromu ve inflamatuar barsak hastalıkları nın tedavisi için probiyotik ve kimyasal ajanları belirlemek için tarama için yararlıdır.

Bakteri ve Kimyasalların Caenorhabditis elegans'ın Bağırsak Geçirgenliği Üzerine Etkilerinin Ölçülmesi

Floresan etiketli antibiyotikler antimikrobiyal direnç birden fazla yönünü incelemek için kullanılabilecek güçlü araçlardır. Bu makalede floresan etiketli antibiyotiklerin hazırlanması ve bakterilerde antibiyotik direnci eğitimi için uygulama açıklanmaktadır. Problar spektrofotometri, akış sitometrisi ve mikroskopi ile bakteriyel direnç (örn. efflux) mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir.

Floresan Antibiyotik Probları Kullanılarak Bakteriyel Direncin Görüntülenmesi

Bu iş akışı, kistik fibrozisli bireylerin akciğerlerinde bakteriyel biyofilm için yerleşik bir ex vivo modeli kullanılarak antibiyotik duyarlılık testi yapmak için kullanılabilir. Bu modelin kullanımı MBEC (minimal biyofilm eradikasyon konsantrasyonu) testlerinin klinik geçerliliğini artırabilir.

Kistik Fibrozis Akciğerinde Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Biofilms Ex vivo Modelinde Antibiyotik Etkinliği Testi

Mini-Tn7 tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bir akış pompası geninin tek kopyalı kromozomal tamamlayıcısı için tasarlanmış bir akış eksikliği olan Acinetobacter baumannii suşuna kolay bir prosedür tarif ediyoruz. Bu hassas genetik araç, çoklu ilaca dirençli patojenlerde akış pompalarının karakterizasyonu için anahtar olan kontrollü gen ekspresyonuna izin verir.

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Şu anda kronik bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilaç taramasına uygun in vivo modellerin eksikliği vardır. Burada, zebra balığı larvalarında kalıcı bir enfeksiyon oluşturmak için bir Pseudomonas aeruginosa klinik izolatı ile yara enfeksiyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Yaralı Zebra Balığı Larvalarında Kalıcı Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonunun Modellenmesi

Yapışkan-invaziv Escherichia coli suşlarında antibiyotik direnci, geleneksel gentamisin koruma testi kullanılarak bakteriyel invaziyanı değerlendirmede zorluklar yaratmaktadır. Bakteriyel istilayı nicel olarak değerlendirmek için koloni oluşturan birimlerin sayılması ve enfekte hücrelerin immünofluoresans konfokal mikroskopisi ile niteliksel olarak görselleştirilmesi için geliştirilmiş bir yöntem tanımlanmıştır.

Escherichia coli hücre istilasının nicelendirilmesi ve görselleştirilmesi için amikacin koruma testi

Keşfedin MexAB dışa atım pompasının lipozomlarda yeniden yapılandırma yöntemiyle in vitro aktivitesini. Pseudomonas aeruginosa'da antibiyotik direnci mekanizmalarını anlamak için bu protokolü kullanın.

Pseudomonas aeruginosa itibaren MexAB dışa atım pompa in vitro olarak incelenmesi

Daha fazla video keşfet