Name: Tüm hücre MALDI-TOF Kütle Spektrometre Makrofaj Aktivasyon Farklı Modu analiz için Doğru ve Hızlı Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Keşfedin, tüm hücre MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanarak makrofaj aktivasyon durumlarını hızlı ve doğru bir şekilde analiz etme yöntemini. Bu teknik, immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında maliyet etkin bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Richard Ouedraogo, Ministère de la Santé'den (PHRC 2010) bir hibe ile desteklenmektedir. Teknik yardım için Laurent Gorvel, Christophe Flaudrops ve Nicolas Amstrong'a teşekkür ederiz.

Mevcut protokolde, numunenin parmak izi olarak kabul edilen bir kütle spektrumu elde etmek için tam hücre MALDI-TOF tekniği kullanılmaktadır. Biyoinformatik bir analiz, bu parmak izlerinin karşılaştırılmasına ve sınıflandırılmasına izin verdi. Bu protokolde üç ana bölüm vardı:
<ol>
	<li>Biyolojik örneklerin hazırlanması: farklı agonistlerle uyarılan makrofajları ve makrofajları kontrol edin.</li>
	<li>Her bir numune tipinin teknik kopyalarla analizi, tam hücre MALDI-TOF MS ile tekrarlanır.</li>
	<li>Ham verilerin biyoinformatik analizi.</li>
</ol>
Hücre izolasyonu ve kültürü için steril solüsyonlar hazırlayın. Tüm reaktifleri 4 °C'de hazırlayın ve saklayın
1. İnsan Monositlerinin Hazırlanması
<ol>
	<li>Hücre kültürü ortamını hazırlayın. 55 ml insan serumu AB + veya fetal sığır serumu (FBS) ve 5 ml antibiyotik çözeltisi (10.000 UI / ml'de penisilin ve 10.000 μg / ml'de streptomisin; penisilin için 100 UI / ml nihai konsantrasyon ve streptomisin için 100 μg / ml) RPMI 1640 ortamına (500 mi) ekleyin.
	<ol>
		<li>Periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) lökositlerden (lökosit konsantreleri) izole edin.
		<ol>
			<li>15 ml Ficoll içeren 50 ml'lik tüpler hazırlayın. Kanı tuzlu suyla seyreltin (hacim / hacim, 1/10). Daha önce tarif edildiği gibi Ficoll üzerine 30 ml seyreltilmiş PBMC'leri bırakın26.</li>
			<li>20 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyin. Ficoll (1.077 g / ml yoğunluk) ve seyreltilmiş plazma arasındaki arayüzde PBMC'leri kurtarın. PBMC'leri kültür ortamında seyreltin ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Anti-CD14 antikorları ile kaplanmış manyetik boncuklar kullanarak PBMC'lerden CD14 + monositleri hazırlayın. 
		Not: Monosit elde edilene kadar ürünleri ve hücreleri 4 °C'de tutun.
		<ol>
			<li>Fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.2, %0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asitten (EDTA) oluşan çalışma tamponu hazırlayın.</li>
			<li>Peletlenmiş PBMC'leri (tahlil başına 10,7 hücre) 80 μl çalışma tamponuna nazikçe ayırın.</li>
			<li>PBMC'lere 20 μl CD14 MicroBeads ekleyin. PBMC'leri karıştırın ve 15 dakika inkübe edin. PBMC'leri 5 ml çalışma tamponu ile yıkayın ve 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Peletlenmiş PBMC'leri 108 PBMC için 500 μl çalışma tamponuna nazikçe ayırın. 
			Not: 108 PBMC'den daha düşük PBMC konsantrasyonları için 500 μl çalışma tamponu kullanın.</li>
			<li>Manyetik ayırmaya devam edin. 
			Not: 2 x 108 PBMC'den daha azı için MS sütununu kullanın; 2 x 108 PBMC'den fazla ve 2 x 109 PBMC'den az için LS sütununu kullanın.</li>
			<li>Ön sütunu ve sütunu çalışan tamponla durulayın (MS sütunu için 500 μl veya LS sütunu için 3 ml). PBMC'leri ön sütuna ekleyin (etiketlenmemiş hücrelerin sütundan geçmesini bekleyin). Çalışan tampon ile 3 kez durulayın (MS sütunu için 500 μl veya LS sütunu için 3 ml). Ön sütunu çıkarın.</li>
			<li>Sütunu 15 ml'lik tüplere yerleştirin. Kolon üzerine çalışan tampon (MS sütunu için 1 ml veya LS sütunu için 5 ml) ekleyin ve kolon üzerine bir basınç uygulayarak CD14 + hücrelerini elüte edin.</li>
			<li>Elüatı 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Monosit peletini 10 ml kültür ortamı ile yıkayın. 
			Not: Anti-CD14 antikorları ve akış sitometrisi (klasik olarak% 95'ten yüksek) kullanarak monosit preparatının saflığını analiz edin.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monositlerin makrofajlara farklılaşması.
	<ol>
		<li>Monositleri (6 oyuklu plakada oyuk başına 10,6 monosit), 37 ° C'de% 10 insan serumu AB + içeren 3 ml kültür ortamında inkübe edin. 4 gün sonra, insan serumu içeren kültür ortamını 3 gün daha% 10 FBS içeren 3 ml kültür ortamı ile değiştirin.</li>
		<li>Elde edilen hücre popülasyonunu akış sitometrisi ile monosit türevli makrofajlar (MDM'ler) olarak tanımlayın (bkz. Şekil 1).
		<ol>
			<li>Kültür ortamını 3 ml PBS ile değiştirin. MDM'leri bir lastik polis memuru ile kazıyın ve MDM süspansiyonlarını toplayın. 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Peletlenmiş MDM'lere %2 BSA içeren PBS ekleyin ve hücre süspansiyonunu hafifçe çalkalayın. Hücre konsantrasyonunu ayarlayın (200 ml PBS'de 106 MDM) ve 4 ° C'de inkübe edin.</li>
			<li>MDM süspansiyonuna 10 ml anti-CD14 antikoru ve 10 ml anti-CD68 antikoru ekleyin ve karanlıkta 20 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. 
			Not: Bu antikorlar, akış sitometrisi analizi ile tutarlı olarak iki farklı florokrom ile etiketlenmelidir. Örneğin, anti-CD14 antikorları, fikoeritrin bağlantılı (monositlerin boyanması için) ve anti-CD68 antikorları, Alexa Fluor 647'ye bağlı (makrofajların boyanması için) ile konjuge edilebilir.</li>
			<li>MDM'leri 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanları çıkarın. Hücre peletini nazikçe ayırın ve MDM'leri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 250 ml% 3 paraformaldehit (PFA) içinde inkübe edin. PFA ile sabitlenmiş MDM'leri 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. MDM'leri 3 ml PBS ile yıkayın ve MDM'leri 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. MDM peletini 400 ml PBS'de nazikçe ayırın.</li>
			<li>Monositlerin (CD14'ü eksprese eden ancak CD68'i eksprese etmeyen) monositlere (CD68'i eksprese eden ancak CD14'ü eksprese etmeyen) farklılaşmasını analiz edin. Not: Klasik olarak hücrelerin %95'inden fazlası MDM'dir.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MDM'lerin 18 saat stimülasyonu.
	<ol>
		<li>Yapışkan MDM'lerin kültür ortamını taze 3 ml kültür ortamı (% 10 FBS içeren) ile değiştirin.</li>
		<li>Bir M1 veya M2 polarizasyonunu indüklemek için aşağıdaki insan rekombinant sitokinlerini kullanın: M1 polarizasyonu için IFN-γ ve TNF ve M2 polarizasyonu için IL-4. M1 makrofajları ayrıca LPS ile stimülasyon yoluyla elde edilir. Sitokinlerin stok çözeltilerinin -80 ° C'de korunduğunu ve LPS'nin stok çözeltisinin -20 ° C'de korunduğunu unutmayın.
		<ol>
			<li>10 ng/ml'lik bir seyreltme elde etmek için IFN-gγ (1 mg / ml) stok çözeltisini kültür ortamında 1/100'de seyreltin. 20 ng / ml'lik bir nihai IFN-γ konsantrasyonu elde etmek için bu IFN-γ seyreltmesinden 6 μl MDM'lere ekleyin.</li>
			<li>10 ng / ml'lik bir seyreltme elde etmek için TNF stok çözeltisini (1 mg / ml) kültür ortamında 1/100'de seyreltin. 20 ng / ml'lik bir nihai TNF konsantrasyonu elde etmek için bu TNF seyreltmesinden 6 μl'yi MDM'lere ekleyin.</li>
			<li>10 ng / ml'lik bir seyreltme elde etmek için IL-4'ün (1 mg / ml) stok çözeltisini kültür ortamında 1/100'de seyreltin. 20 ng / ml'lik bir nihai IL-4 konsantrasyonu elde etmek için bu IL-4 seyreltmesinden 6 μl MDM'lere ekleyin.</li>
			<li>1 μg / ml'lik bir nihai LPS konsantrasyonu elde etmek için MDM'lere 3 μl LPS stok çözeltisi (1 mg / ml) ekleyin.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>MDM'leri bakterilerle uyarmak için ısıyla öldürülmüş bakteriler kullanın. Canlı bakterileri PBS ile yıkayın ve 95 °C'de 1 saat ısıtın. Orientia tsutsugamushi (Kato suşu (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG CIP suşu 671203) ve Coxiella burnetii (faz I'de Dokuz Mil) kullanın, çünkü bu patojenlerin makrofajları enfekte ettiği bilinmektedir. Bu nedenle, 109 bakteri / ml'de bir O. tsutsugamushi süspansiyonu hazırlayın. MDM'lere 50 μl ekleyin. Aynı adımı M. bovis ve C. burnetii için de tekrarlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MALDI-TOF MS için biyolojik numunelerin hazırlanması.
	<ol>
		<li>Uyarılmış MDM'leri Ca2 + veya Mg2 + olmadan PBS ile yıkayın (hücreler Ca2 + veya Mg2 + varlığında aglütine olabilir). MDM'leri bir lastik polis memuru ile kazıyın ve MDM süspansiyonlarını toplayın. MDM'leri santrifüjleyin. FBS kontaminasyonunu atmak için MDM'leri PBS'de Ca2+ veya Mg2+ olmadan 400 x g'de 5 dakika boyunca tekrar yıkayın.</li>
		<li>Hücre konsantrasyonunu ayarlayın (test başına 2 x 106 MDM). MDM'leri 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanları atın. Hücre peletlerini Ca2 + veya Mg2 + olmadan 20 μl PBS'de toplayın.</li>
		<li>Numuneleri hemen analiz edin veya analizden önce -80 °C'de PBS'de saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Tüm Hücre Maldi-TOF MS ile Makrofajların Analizi
<ol>
	<li>CHCA matrisinin hazırlanması.
	<ol>
		<li>Bir şişeye 500 μl asetonitril, 250 μl %10 trifloroasetik asit ve 250 μl yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) suyu ekleyin. Bu çözeltide 10 mg CHCA'yı 10 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. En az 20 dakika karıştırın ve sonikasyon < / >
		Not: sonikasyon matrisin doygunluğunu artıracaktır, ancak bu adım zorunlu değildir.</li>
		<li>13.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Peçeteyi atın ve süpernatanı saklayın. 
		Not: Matris çözeltisini kullanmadan hemen önce hazırlayın. Kristaller içeren bir matris çözeltisi, numune moleküllerinin iyi bir iyonizasyonuna izin vermez ve bu, spektrumların kalitesini etkileyebilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MALDI çelik hedefinin hazırlanması.
	<ol>
		<li>Cilalı çelik hedefi sıcak musluk suyuyla nemlendirin. Hassas silme kağıdı ile ovalayın. % 70 etanol ekleyin ve ovalayın. Ovalayarak su ile durulayın. % 70 etanol ekleyin ve hassas kağıtla ovalayın.</li>
		<li>Hedefi% 70 etanole batırın ve en az 15 dakika sonikat yapın. Hedefi% 80'de 500 μl ila 1 ml trifloroasetik asit ile örtün. Hassas kağıtla ovalayın ve silin. Ovalamadan HPLC su ile durulayın. Hedefi oda sıcaklığında kurutun. 
		Not: Yanlış temizlenmiş bir hedef, spektrumların kalitesini etkileyebilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mevduat hazırlanması.
	<ol>
		<li>Düzgün tortular elde etmek için temiz hedefi yatay ve düz bir destek üzerine yerleştirin.</li>
		<li>MDM örneklerini buz üzerinde nazikçe çözdürün. Not: Hızlı ve kuvvetli çözdürme, numuneleri değiştirebilir ve böylece spektrumların kalitesini etkileyebilir. MALDI hedefinde 1 μl (yaklaşık 1 x 105 hücre içeren) biriktirmeden önce MDM'leri (hücre süspansiyonunu ileri geri pipetleyerek) homojenize edin. Numune üzerine 1 μl MALDI matris çözeltisi ekleyin. Pipetle lekeyi karıştırmaktan kaçının. Noktaları pipetlerle karıştırmak, spektrumların kalitesini değiştirir. 12-16 numune/tahlil (teknik kopyalar) atın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında kendiliğinden buharlaşır. Not: buharlaşma kademeli olarak gerçekleşir ve matris/numune kristallerinin oluşumuna yol açar. Tortular, analizden önce birkaç gün (2 haftaya kadar) hemen analiz edilebilir veya karanlıkta saklanabilir.</li>
		<li>Kullanıcı, deneyde kullanılan sitokinlerin veya ısıyla öldürülen bakterilerin, uyarılmış makrofajların spektrumları aralığında zirveler sağlamadığını kontrol etmelidir. Burada, sitokinlerin ve ısıyla öldürülen bakterilerin tek başına çalışılan aralıkta (0-20 kDa) herhangi bir sinyal sağlamadığını kontrol ettik.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kütle spektrometresi ayarlama ve veri toplama.
	<ol>
		<li>Numuneleri içeren çelik hedefi kütle spektrometresine yerleştirin.</li>
		<li>Kütle spektrometresini yapılandırın ve veri toplamayı çalıştırın. Verilerin otomatik olarak alınması için varsayılan yapılandırmayı kullanın.</li>
		<li>Not: flexControl yazılımının yapılandırmasının ayrıntılı bir görünümü ek/Tablo 1'de verilmiştir. Bu kütle spektrometresine ve kullanılan yazılıma göre değişiklik gösterebilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Biyoinformatik Analiz
Not: Biyoinformatik analiz, belirli analiz kütüphaneleri (MALDIquant) ile birlikte ücretsiz ve açık kaynaklı istatistiksel analiz yazılımı R kullanılarak gerçekleştirilmiştir. R, web sitesinden <a href="http://cran.r-project.org/">http://cran.r-project.org/ ücretsiz olarak indirilebilir</a>. Komut dosyasının ayrıntılı bir açıklaması <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50926/50926_MALDI_Ouedraogo_JoVE.tar.gz" target="_blank">ek materyal olarak sağlanır.</a>
<ol>
	<li>Ham verilerin yüklenmesi ve ön işlenmesi.
	<ol>
		<li>Ham verileri kütle spektrometresi ile ilişkili bilgisayarda birden çok dosya ve klasörde depolayın. Denemenin kök klasörünü tüm alt klasörlerle birlikte alın. Analiz için kök klasörü kişisel bilgisayara kopyalayın.</li>
		<li>Ham verileri yüklemek ve analiz etmek için readBrukerFlexData ve MALDIquant kitaplıklarını kullanın. 
		Not: readBrukerFlexData, daha fazla analiz için kütle spektrometresinden ham verilerin R'deki belirli bir nesneye yüklenmesine izin verir. Daha fazla bilgi için MALDIquant açıklamasına bakın27.</li>
		<li>Oluşturulan spektrumları analiz et. 
		Not: Her spektrum, kendi kütleleri ve yoğunlukları (göreceli bolluk) ile bir tepe listesinden oluşur. Spektrumların grafiksel görselleştirmesini geliştirmek için yoğunlukların karekökünü kullanın. Temel tahmin için istatistiğe duyarlı, doğrusal olmayan tepe kırpma algoritması kullanarak arka planı düzeltin27. Tepe noktalarını tespit etmek için 6'lık bir sinyal-gürültü oranı kullanın. Kütle / yük (m / z) değerleri 2.000 ppm'lik bir pencere içinde olduğunda, tespit edilen tepe noktalarının spektrumlar arasında benzer olduğunu düşünün.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skor tanımlama ve hesaplama. Spektrumları, yığılma için bir koğuş algoritması ve Jaccard mesafesine dayalı bir benzerlik matrisi ile hiyerarşik bir kümeleme kullanarak sınıflandırın. 
	Not: Jaccard indeksi, Boolean örnek kümeleri arasındaki benzerliği ölçer (yani, bir tepe noktası listesinin varlığı/yokluğu).</li>
	<li>Spektrumların karşılaştırılması ve görüntüleme.
	<ol>
		<li>Ham spektrum grafiklerini analiz edin. Not: x ekseni m/z oranını (Dalton cinsinden) ve y ekseni yoğunluğu (bağıl bolluk) temsil eder.</li>
		<li>Hiyerarşik kümeleme ile spektrumlar arasındaki benzerliği değerlendirin. Dendrogram olarak benzerliği (veya farklılığı) temsil edin.</li>
		<li>Sanal jel görünümü temsili aracılığıyla tekrarlanabilirliği değerlendirin. Not: sanal jel görünümü gösterimi, göreceli bolluğun artan mavi yoğunluklarıyla renk kodlu olduğu değiştirilmiş bir ısı haritası grafiğidir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mass Gross, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMass+Gross%2C+J+%22Spectrometry%3A+A+Textbook%22">Spectrometry: A Textbook</a>. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).</li>
<li>Villanueva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+Peptide+Profiling+by+Magnetic+Particle-Assisted%2C+Automated+Sample+Processing+and+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).</li>
<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+as+a+Diagnostic+and+a+Cancer+Biomarker+Discovery+Tool+Opportunities+and+Potential+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molec.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry as a Diagnostic and a Cancer Biomarker Discovery Tool Opportunities and Potential Limitations.</a> Molec. Cell. Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li>
<li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry+in+Screening+and+Diagnostic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Screening and Diagnostic.</a> 11 (20), 2577-2591 (2005).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry and Protein Analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li>
<li>Carbonnelle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+two+MALDI-TOF+mass+spectrometry+systems+for+bacterial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification.</a> J. Microbiol. Methods. 89 (2), 133-136 (2012).</li>
<li>Bizzini, A., Jaton, K., Romo, D., Bille, J., Prod’hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization%E2%80%93Time+of+Flight+Mass+Spectrometry+as+an+Alternative+to+16S+rRNA+Gene+Sequencing+for+Identification+of+Difficult-To-Identify+Bacterial+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative to 16S rRNA Gene Sequencing for Identification of Difficult-To-Identify Bacterial Strains.</a> J. Clin. Microbiol. 49 (2), 693-696 (2011).</li>
<li>Buchanan, C. M., Malik, A. S., Cooper, G. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualisation+of+peptide+hormones+in+cultured+pancreatic+islet+alpha-+and+beta-cells+by+intact-cell+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct visualisation of peptide hormones in cultured pancreatic islet alpha- and beta-cells by intact-cell mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 (21), 3452-3458 (2007).</li>
<li>Ouedraogo, R., Flaudrops, C., Ben Amara, A., Capo, C., Raoult, D., Mege, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+circulating+immune+cells+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Global analysis of circulating immune cells by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> PloS One. 5 (10), 13691 (2010).</li>
<li>Munteanu, B., von Reitzenstein, C., Hänsch, G. M., Meyer, B., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+robust+and+automated+protein+analysis+of+cell+differentiation+and+of+primary+human+blood+cells+by+intact+cell+MALDI+mass+spectrometry+biotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive robust and automated protein analysis of cell differentiation and of primary human blood cells by intact cell MALDI mass spectrometry biotyping.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (8), 2277-2286 (2012).</li>
<li>Feng, H., Sim, L. C., Wan, C., Wong, N. S. C., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+protein+productivity+and+production+stability+of+CHO+cells+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of protein productivity and production stability of CHO cells by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25 (10), 1407-1412 (2011).</li>
<li>Ouedraogo, R., Daumas, A., Ghigo, E., Capo, C., Mege, J. -L., Textoris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+MALDI-TOF+MS%3A+A+new+tool+to+assess+the+multifaceted+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Whole-cell MALDI-TOF MS: A new tool to assess the multifaceted activation of macrophages.</a> J. Proteomics. 75 (18), 5523-5532 (2012).</li>
<li>Amann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+profiling+of+proteins+in+lung+cancer+cells+from+fine-needle+aspirates+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective profiling of proteins in lung cancer cells from fine-needle aspirates by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin. Cancer Res. 12 (17), 5142-5150 (2006).</li>
<li>Maurer, K., Eschrich, K., Schellenberger, W., Bertolini, J., Rupf, S., Remmerbach, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+brush+biopsy+analysis+by+MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+early+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oral brush biopsy analysis by MALDI-ToF Mass Spectrometry for early cancer diagnosis.</a> Oral Oncol. 49 (2), 152-156 (2013).</li>
<li>Ishii, K. J., Koyama, S., Nakagawa, A., Coban, C., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+innate+immune+receptors+and+beyond%3A+making+sense+of+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host innate immune receptors and beyond: making sense of microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 3 (6), 352-363 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23 (4), 344-346 (2005).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nat. Rev. Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181 (6), 3733-3739 (2008).</li>
<li>Biswas, S. K., Sica, A., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+macrophage+function+during+tumor+progression%3A+regulation+by+distinct+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of macrophage function during tumor progression: regulation by distinct molecular mechanisms.</a> J. Immunol. 180 (4), 2011-2017 (2008).</li>
<li>Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+World+J%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in health and disease.</a> Sci. World J. 11, 2391-2402 (2011).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+system+in+diverse+forms+of+macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization.</a> Trends Immunol. 25 (12), 677-686 (2004).</li>
<li>Delaby, A., Gorvel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+monocyte+dynamics+in+Q+fever+granuloma+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective monocyte dynamics in Q fever granuloma deficiency.</a> J. Infect. Dis. 205 (7), 1086-1094 (2012).</li>
<li>Gibb, S., Strimmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDIquant%3A+a+versatile+R+package+for+the+analysis+of+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MALDIquant: a versatile R package for the analysis of mass spectrometry data.</a> Bioinformatics. 28 (17), 2270-2271 (2012).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur. RO, JLM ve CC, "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF" adlı uluslararası WO 2011/154650 patentinin mucitleridir.

Bu protokol, ökaryotik tam hücreler üzerinde MALDI-TOF-MS kullanımını açıklar. Burada, makrofajların mikro çevrelerine yanıt olarak çoklu aktivasyon durumlarını analiz ederek yöntemin doğruluğunu gösteriyoruz.
Protokolün başarısı birkaç kritik adıma bağlıdır. İlk olarak, herhangi bir çözelti kirleticisi spektrumları değiştirebilir. Örneğin, hedef üzerinde birikmeden önce kültür ortamını ve serum proteinlerini çıkarmak için PBS'deki hücreleri yıkamak önemlidir. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etm...

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi (MALDI-TOF MS), biyolojik örnekleri incelemek için popüler bir kütle spektrometrisi tekniğidir. Bir lazer ışını ve enerji emici bir matris kullanmak, yumuşak bir iyonizasyon işlemine izin verir: büyük, çoğunlukla tek yüklü biyomoleküllerin buharlaşması ve oluşumu. Bu işleme desorpsiyon/iyonizasyon denir ve MALDI kısaltmasını haklı çıkarır. Bu iyonlar daha sonra voltaj uygulanarak hızlandırılır ve bu iyonların ayrılmasına ve ilgili kütlelerinin1 miktarının belirlenmesine izin veren bir TOF analizörüne girer.
MALDI-TOF MS, biyoloji, kimya ve tıpta molekülleri ve biyobelirteçleri2-4 tanımlamak veya proteins5,6. Son zamanlarda, birkaç grup klinik örneklerden mikroorganizmaların tanımlanması için MALDI-TOF MSuyguladı 7,8<span style="font-size: 14px;">. Bu mikrobiyolojik uygulama günümüzde klinik ortamlarda rutin olarak kullanılmaktadır. Tüm hücreli MALDI-TOF, klasik MALDI-TOF MS uygulamalarına kıyasla birçok avantaja sahiptir. Tam hücreleri içeren numuneler doğrudan işlenir ve büyük miktarlarda materyali parçalamak veya ayırmak için zaman alan adımlardan kaçınılır. Ayrıca, çeşitli tepe noktalarının karakterizasyonuna gerek yoktur: tüm spektrum, numunenin parmak izi olarak kabul edilir ve eşleştirme algoritmaları, test edilen spektrumu bir referans spektrum veritabanı ile karşılaştırır.
Biz ve diğerleri bu tam hücre analiz tekniğini ökaryotik hücrelere uyguladık. Bu teknikten birçok uygulama türetilebilir: (1) karışık bir numune9-11'den ana hücre tiplerini tanımlayın; (2) hücre kültürlerinin zaman içindeki canlılığını değerlendirmek (kalite kontrol endüstriyel uygulamaları dahil)12; (3) tek bir hücre tipi13'ün aktivasyon durumlarını izlemek; (4) bir klinik numunenin malign dönüşümünü değerlendirin14,15.
Burada, sitokinlere veya ısıyla öldürülen bakterilere yanıt olarak makrofajların çeşitli polarizasyon fenotiplerini keşfetmek için tam hücre MALDI-TOF MS'nin kullanımını açıklıyoruz. Makrofajlar, mikrobiyal patojenlere karşı bağışıklık tepkisinde çok önemli bir rol oynar. Lipopolisakkarit (LPS) gibi korunmuş mikrobiyal paternleri tespit edebilen örüntü tanıma reseptörleri aracılığıyla dokulardaki enfeksiyöz ajanları tespit ederler16. Makrofajlar, adaptif immün yanıtı oluşturmak için T hücreleri ile etkileşime giren profesyonel antijen sunan hücrelerdir. T hücreleri, makrofajların mikrobisidal aktivitesini güçlendiren veya düzenleyen sitokinleri serbest bırakarak makrofajları etkiler. Th1/Th2 lenfosit polarizasyonuna benzer şekilde, inflamatuar, mikrobisidal ve tümör öldürücü makrofajlar M1 makrofajları ve immünoregülatör makrofajlar M2 makrofajları17-19 olarak sınıflandırılmıştır. M1 terimi, makrofajların interferon (IFN)-γ ve tümör nekroz faktörü (TNF) gibi tip I sitokinler veya LPS18,20-23 gibi bakteriyel ürünler tarafından klasik aktivasyonunu ifade ederken, alternatif yollarla aktive edilen makrofajlar (interlökin (IL)-4, IL-10, Dönüştürücü Büyüme Faktörü-β1, M2 makrofajları olarak kabul edilir19,24,25. Makrofajların mikro çevrelerine yanıt olarak yüksek fenotipik ve fonksiyonel plastisitesi, bu makrofajları MALDI-TOF MS yaklaşımıyla ince değişiklikleri analiz etmek için yararlı kılar.

tüm hücre maldi-tof kütle spektrometre makrofaj aktivasyon farklı modu analiz için doğru ve hızlı yöntem

Whole-cell MALDI-TOF Mass Spectrometry is an Accurate and Rapid Method to Analyze Different Modes of Macrophage Activation

MALDI-TOF, kimya ve biyokimyada yaygın olarak kullanılan bir kütle spektrometresi tekniğidir. Tıpta molekülleri ve biyobelirteçleri tanımlamak için de uygulanmıştır. Son zamanlarda, mikrobiyolojide, klinik örneklerden yetiştirilen bakterilerin hazırlık veya fraksiyonlama adımları olmadan rutin olarak tanımlanması için kullanılmaktadır. Biz ve diğerleri, bu tam hücre MALDI-TOF kütle spektrometresi tekniğini ökaryotik hücrelere başarıyla uyguladık. Mevcut uygulamalar, hücre tipinin tanımlanmasından kalite kontrolüne, hücre kültürünün değerlendirilmesine ve teşhis uygulamalarına kadar uzanmaktadır. Burada, sitokinlere veya ısıyla öldürülen bakterilere yanıt olarak makrofajların çeşitli polarizasyon fenotiplerini keşfetmek için kullanımını açıklıyoruz. Makrofajların proteomik tepkilerinin çeşitliliğini temsil eden makrofaj spesifik parmak izlerinin tanımlanmasına izin verdi. Bu uygulama, yöntemin doğruluğunu ve basitliğini göstermektedir. Burada tarif ettiğimiz protokol, patolojik durumlarda immün konak yanıtını incelemek için yararlı olabilir veya daha geniş tanı uygulamalarına genişletilebilir.

Bu protokolün amacı, makrofajların mikroçevrelerine verdikleri yanıtı değerlendirmek için tüm hücre MALDI-TOF MS yönteminin doğruluğunu göstermektir.
Şekil 1, kan örneklerinden stimüle edilmiş makrofajların hazırlanmasını açıklamaktadır. Şekil 2, monositlerin ve MDM'lerin akış sitometrisi ile analizini temsil etmektedir. Monositlerin CD14 eksprese ettiği ancak CD68 eksprese etmediği görülmüştür (Şekil 1A). Aksine, MDM'ler CD68 eksprese etmiş a...

Bu protokol, ökaryotik hücrelerde tam hücre MALDI-TOF kütle spektrometresinin kullanımını açıklar. Burada, makrofajların mikro çevrelerine yanıt olarak çoklu aktivasyon durumlarını analiz ederek bu tekniğin doğruluğunu gösteriyoruz.

Tüm hücre MALDI-TOF Kütle Spektrometre Makrofaj Aktivasyon Farklı Modu analiz için Doğru ve Hızlı Yöntem

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and ...

Bu deneyde, tüm hücreli çoklu kütle spektrometrisi kullanılmaktadır. Makrofajların çoklu aktivasyon durumlarını doğru şekilde analiz etmek için, önce CD 14 pozitif monositlerden makrofajlar türetilir ve ardından hücreler sitokinler ve bakteriler gibi agonistlerle uyarılır. Örnekler, proteinlerin ayrıştırılması ve her örnek için bir spektrum elde edilmesi amacıyla çelik bir hedef üzerinde moly to yöntemiyle analiz edilir.Tüm hücre MALDI kütle spektrometrisi ile elde edilen spektrumların biyoinformatik analizi temelinde, spesifik parmak izi sonuçları, tek bir ökaryotik hücre olan makrofajın çeşitli aktivasyon durumlarını ayırt edebilmektedir. Bu tekniğin akış sitometrisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı; hızlı, kolay ve düşük maliyetli olmasıdır. Bu deneyde, makrofajlardan tekrarlanabilir spektrumların elde edildiğini ve çeşitli aktivasyon durumlarının tüm hücre analizi ile ayırt edildiğini gösteriyoruz.Ayrıca, enfeksiyona karşı konak yanıtının teşhisi için yararlı olabilecek BBMC'den spektra elde ediyoruz. Bu yöntem, bağışıklık hücrelerinin aktivasyon durumlarına dair bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, örneğin cerrahi sırasında yapılan ekstra analizlerin yerine kavramsal profi

whole-cell-maldi-tof-mass-spectrometry-is-an-accurate-rapid-method-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Makrofajlar, konak patojenitesinde rol oynayan anahtar hücrelerdir. Makrofajlar, proteomik analiz ile analiz edilebilen ve tespit edilebilen fenotipik ve fonksiyonel çeşitlilik gösterir. Bu makale, M1 veya M2 fenotipine farklılaşmış insan makrofajlarının birincil kültürlerinin 2D elektroforezinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

Metabolik yeniden programlama, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için bir özellik ve önkoşuldur. Bu el yazması, fare kemik iliği türevli makrofajlarda glikoliz ve mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerinin ölçümü için bir testi açıklamaktadır. Bu araç, belirli faktörlerin makrofajın metabolizmasını ve fenotipini nasıl etkilediğini araştırmak için uygulanabilir.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

NLRP3 inflammasome harekete geçirmek algılama floresans mikroskobu kullanarak ve etkin caspase-1 ve adaptörü, ASC için boyama hücresel olarak açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz yayın tahlil pyroptotic lizis nüfus olarak algılamak için sunulmuştur. Bu teknikler birçok açıdan inflammasome biyoloji çalışmaya adapte edilebilir.

Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Numune hazırlama bir roman yöntemi görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak küçük molekül alışverişte algılamak için hücre ve doku coculture karşılamak için geliştirilmiştir.

Doku ve kütle spektrometresi Imaging kullanarak hücreleri arasında küçük molekül iletişim yakalama

Bu rapor, otomatik bir slayt boyayıcı üzerinde multipleks immünofloresan (mIF) testleri için otomatik bir protokolü açıklar. Translasyonel araştırmalarda çok sayıda doku slaytında özel mIF tahlilleri için ideal olan standart yüksek verimli doku otomatik boyalayıcıları ve tam slayt floresan görüntüleyiciler üzerinde uzamsal proteomiklerin yüksek tekrarlanabilirliğini gösterir.

Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Bu protokol, floresan kılavuzlu, tek hücreli MALDI-2 kütle spektrometresi için mikroMS kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve birincil sıçan nöronal hücrelerinin gelişmiş moleküler profilini çıkarmayı sağlar.

Bireysel Sıçan Nöral Hücrelerinin Lazer Kaynaklı Postiyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Floresan Kılavuzluğunda Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon

Bu protokol, makrofaj morfodinamiğinin gerçek zamanlı görüntülemesi ve nicel analizi için etiketsiz optik kırınım tomografisi tabanlı bir iş akışını tanımlar. Bu yöntem, tek hücre morfolojisi ve göçünün sürekli izlenmesini sağlar ve uzun vadeli canlı hücre görüntüleme sırasında projeksiyon alanı, çevresi ve ortalama göç hızının zaman çözünçüsüyle ölçümlerini sağlar.

Gerçek Zamanlı Etiketsiz Görüntüleme ve Makrofaj Morfodinamiğinin Optik Kırınım Tomografisi Kullanılarak Nicel Analizi

Bu protokol, ardından hızlı bir şekilde tüm hücre algılama, domates ve diğer taze ürün yüzeyler örnekleme için basit bir yapışkan bant tabanlı yaklaşım,...

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay...

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Keşfedin, tüm hücre MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanarak makrofaj aktivasyon durumlarını hızlı ve doğru bir şekilde analiz etme yöntemini. Bu teknik, immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında maliyet etkin bir alternatif sunar.

Tüm hücre MALDI-TOF Kütle Spektrometre Makrofaj Aktivasyon Farklı Modu analiz için Doğru ve Hızlı Yöntem

Daha fazla video keşfet