Murin Aort Sinüsünde Aterosklerotik Lezyonların Kantitatif Analizi ve Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, MI aort sinüsündeki aterosklerotik lezyonları karakterize etmek ve ölçmektir. Bu, apikal kısmı ayırmak ve aort sinüsünü bulmak için önce çıkarılan bir kalbin diseksiyonu ile gerçekleştirilir. Daha sonra kalbin işlenmiş apikal kısmı ile parafin blokları hazırlanır.

Daha sonra aort sinüsü bölümlere ayrılır ve slaytlara monte edilir. Son olarak, doku bölümleri boyanır. Sonuç olarak, histokimyasal ve immünohistokimyasal analizler yoluyla aterosklerotik lezyonların farklı boyut ve bileşimlerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Daniel Venga cezai olacak. McMaster Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu, bir LDLR çift negatif fareyi uyuşturduktan ve kanı çıkardıktan sonra, metin protokolüne göre kalbi izole etmeden önce ötenazi yaptıktan ve düzelttikten sonra, çıkan aorta dik olarak kalp üzerinde enine bir kesim yapmak için bir neşter kullanın. Kalbin apikal veya üst kısmını bir gömme kasetine yerleştirin ve Formin'e batırın.

Ardından kaseti bir doku işlemcisine yerleştirin ve gece boyunca işleyin. Histoloji kalıpları için metin protokolünde belirtilen programı kullanarak, parafin mumunu gece boyunca 62 santigrat derecede eritin. Her işlem dokusunu derin bir histoloji kalıbına yerleştirin, kalbin arayüzünün kalıbın tabanına temas ettiğinden emin olun ve ardından kalıbı tamamen doldurmak için erimiş parafin mumu dökün.

Kalıbı kapatmak için etiketli bir plastik kaset kullanın. Kalıpları buz veya soğuk bir yüzey üzerinde soğuttuktan sonra, aortu bölmek için bloğu kalıptan ayırın. Bloğu, içeriden kalbin tepesine doğru bölümlere ayrılabilecek şekilde mikrotomun numune tutucusuna yerleştirin.

Mikrotomu 10 mikrona ayarlayın ve kalbi bölümlere ayırın. Bir cam slayt üzerinde bölümleri toplayın ve konumu ve yönü belirlemek için ışık mikroskobu altında inceleyin. Sinüs, ekli broşürlerle birlikte üç parçalı valf tabanı olarak görünmelidir.

Aort sinüsünün bir veya iki kapakçığı belirginleştiğinde, bloğun açısını gerektiği gibi ayarlayın. Valflere ulaşıldığında, mikrotomu dört ila beş mikron kesecek şekilde ayarlayın. İlk 10 bölümün her birini ayrı cam kızakların üstüne monte edin ve ardından sonraki her 10 bölümlük grubu bir sonraki konuma monte edin.

Slaytlarda. Aterosklerotik lezyon gözlenene kadar bölümleri toplamaya devam edin. Lezyonları görselleştirmek için bölümleri hematin ve eoin ile boyamak için, slaytları sekiz dakika boyunca bir hava kurutucusuna koyun.

Daha sonra, her biri üç dakika boyunca dört kez yıkamak için ksilen kullanarak bölümleri ayırın. Slaytları her biri üç dakika boyunca üç kez% 100 etanol içinde yıkayın. Daha sonra% 70 etanol ve% 50 etanol.

Her biri üç dakika boyunca üç kez. Slaytları durulamak için damıtılmış su kullanın ve ardından içine daldırın. MA'nın 15 dakika boyunca hematini.

Yıka ve çalışıyor. Beş dakika boyunca musluk suyu. Daha sonra, bir ila beş dakika boyunca eoin Y'ye batırdıktan sonra beş dakika boyunca yıkayın ve damıtılmış su

Her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve damıtılmış su. Her biri iki dakika boyunca iki kez% 50 etanol. Daha sonra her yıkamada iki dakika boyunca üç kez% 70 etanol ve% 100 etanol.

Her biri iki dakika boyunca üç kez. Daha sonra her biri iki dakika boyunca dört kez yıkayın ve ksileni yıkayın. Bölümleri monte etmek ve ışık mikroskobu altında görüntü yakalamak için ksilen bazlı bir montaj ortamı kullanın.

Kesitlerin kalınlığına bağlı olarak aort sinüsünden 40 ila 50 mikron aralıklarla belirli mesafelerde belirlenebilen lezyonları tanımlamak ve ölçmek için görüntüleme yazılımı kullanın, immünohistokimyasal ve immünofloresan boyama için metin protokolüne bakın. Beş haftalık LDLR. Pozitif fareler, kalpleri burada gösterildiği gibi sabitlenmeden, izole edilmeden ve bölümlere ayrılmadan önce 10 hafta boyunca standart bir diyet veya yüksek yağlı bir diyetle beslendi.

Fareler standart bir yemek diyeti ile beslendiğinde, aterosklerotik gelişim çok sınırlıdır ve sekizin 15. haftasında tespit edilemeyebilir. Yüksek yağlı bir diyet, bu modelde aterogenezi önemli ölçüde hızlandırır ve ne kronik aselüler çekirdekler ve fibröz kapaklar içeren büyük ileri lezyonların oluşumunu indükler. Aterosklerotik lezyonlar, lezyon gelişiminin aşamalarını tanımlayan spesifik hücre tiplerinin ve faktörlerin varlığı için boyama ile daha da karakterize edilebilir.

İntima içine monosit infiltrasyonu, aterogenez intimanın en erken olaylarından birini temsil eder. Monositler, hücresel kalıntıları ve lipitleri yutan makrofajlara farklılaşır. Köpük hücreleri olarak bilinen lipid tıkanmış makrofajlar, burada görülen arter duvarında yağlı bir çizgi oluşturur.

Makrofaj köpük hücreleri, F four 80 ve MAC three gibi spesifik makrofaj belirteçlerine karşı antikorlarla boyanarak lezyon gelişiminin tüm aşamalarında tespit edilebilir. Vasküler düz kas hücreleri veya v SMC'ler, sağlıklı bir arterin medial tabakası ile sınırlıdır. VSC'ler, ileri bir lezyonun gelişimi sırasında intimada göç etmeye ve çoğalmaya indüklenir.

Bu panelde görülebileceği gibi, V SMC'ler geliştirildikten sonra alfa aktine karşı bir antikor ile boyanarak tanımlanabilir. Bu teknik, kardiyovasküler hastalık alanındaki araştırmacıların çubuklardaki aterosklerotik lezyonların gelişimini ve ilerlemesini keşfetmeleri için yol açtı.