Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

Bu prosedür, gözenekli bir zarın zıt taraflarında astrositlerin ve endotel hücrelerinin birlikte kültürlenmesiyle kan-beyin bariyerinin in vitro simülasyonunu amaçlar. İlk olarak, gözenekli zarın lümen yüzeyini hücre dışı bir matris ile kaplayın. Kollajen gibi protein, zarın abluminal yüzeyinin üzerinde çıkarılabilir bir kuyu oluşturmak için ters çevrilmiş ek parçaya harici bir silikon boru ve dahili bir silikon tapa ile uyar.

Şimdi astrosit hücrelerini, abluminal yüzeye yapışacak şekilde ters çevrilmiş ek parçaya tohumlayın. Ardından boruyu çıkarın ve eki normal yönünde orta dolu bir kuyunun içine yerleştirin. Daha sonra, endotel hücrelerini ekin lümen bölmesine tohumlayın ve karşıt astrositlerle birlikte kültürleyin.

Sonuç olarak, floresan izleyicilerin geçişi veya trans endotelyal elektrik direncinin kaydedilmesi, çeşitli uyarıcı ajanlara yanıt olarak in vitro BBB'deki geçirgenlik değişikliklerini ölçmek için kullanılır. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan ve doktorası sırasında kan beyin bariyerini simüle etmek için kullandığımız bu modifiye tohumlama protokolünü geliştiren Bay Barry Nigo olacak. Bu prosedür hakkında ilk olarak, daha kaba oturma yöntemlerini test ettikten ve duraklama yoluyla ortamın yanı sıra küçük orta hacimlerin sızmasıyla ilgili çok fazla hayal kırıklığı yaşadıktan sonra bir fikrimiz vardı.

Bu, prosedürümüzde ele almaya çalıştığımız kısa ve yetersiz bir astrosit oturma süreleri dikte etti. Doku kültürü eklerini 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin. Daha sonra, mililitre sıçan kollajeni başına 50 mikrolitre 132 mikrogram ekleyin, biri eklerin lümen yüzeyini kaplamak için, herhangi bir kalıntı asidi çıkarmak için nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatörde gece boyunca inkübe edin, eklerin hem abluminal hem de luminal taraflarını çift damıtılmış su ile yıkayın.

Ardından ekleri ters çevirin ve gözenekli zarın kenarına kısa bir elastik silikon boru parçasını nazikçe yerleştirin. Esasen abluminal yüzeyin üzerinde yeni bir kuyu yaratmak. Alt tarafı kapatmak için.

0,2 mililitrelik bir PCR tüpünün kesik ucu ile bir ucu kapatılmış silikon borudan yapılmış bir tapa hazırlayın. Şimdi steril bir forsep kullanarak, silikon tapayı luminal boşluğa yerleştirin ve zardan yaklaşık bir ila iki milimetreye ulaşana kadar ilerletin. Bir sonraki tohum, 200 mikrolitre bakım ortamındaki 40.000 astrositi doğrudan abluminal membran yüzeyinin çok üzerindeki silikona yerleştirir.

Astrositlerin yapışma durumunu izlemek için, 6,5 milimetrelik ek parça ile aynı yüzey alanına sahip olduğu ve izin verdiği için standart bir 96 kuyulu plaka kullanın. Faz kontrast mikroskobu tohumu ile hücrelerin daha kolay görselleştirilmesi, astrosit hücre süspansiyonunun aynı hacminde 96 kuyulu plaka sekiz. Bu, 96 kuyucuğundaki astrositlerin ve ek zardaki uzantı olarak steriliteyi korumak için yeterince yapıştığını belirlemek için zaman içinde izlenecektir.

Filtrelenmemiş havaya maruz kalmayı en aza indirmek için monte edilmiş ekleri iki altı kuyulu plaka arasında taşıyın. Astrositlerin yapışmasını sağlamak için hücreleri inkübatöre yerleştirin. Ayrıca bu sırada kontrol 96 Kuyu plakasını inkübatöre yerleştirin.

Yaklaşık dört saat sonra, astrositlerin yapışıp yapışmadığını görmek için kontrol 96'yı kontrol edin. Eğer öyleyse, kesici uç tertibatını doku kültürü başlığına geri aktarın. Harici silikon hortumu ve tapaları yavaşça çıkarın.

Daha sonra, ekleri normal dik yöne, endotel hücresi bakım Ortamının kuyusu başına 800 mikrolitre içeren kuyucuklara geri getirin. 200 mikrolitrede 20.000 beyin endotel hücresini, herhangi bir ortam değişikliği olmadan BEC ortamında üç gün boyunca kollajen kaplı luminal yüzey ko-kültürüne bakın. Deneyden önce.

Daha sonra kullanmak üzere otoklavlamadan önce silikon tüpleri ve tapaları etanolde yıkayın. İn vitro kan beyin bariyerini uyarmak için önce abluminal ve luminal medyayı sırasıyla 600 mikrolitre ve 100 mikrolitre serumsuz becs ortamı ile değiştirin. Luminal yıkamayı aspire edin ve uyarıcı maddeler içeren 100 mikrolitre serum içermeyen ortam ile değiştirin.

İn vitro BBB'yi astrositik bölmeden indüklüyorsanız, abluminal ortamı aspire edin ve 600 mikrolitre serum içermeyen ile değiştirin. Ortam içeren uyarıcı ajanlar, insan kontakt kan-beyin bariyeri modeli oluşturmak için etiket izleyicilerin standart paraselüler veya hücre ötesi geçirgenlik deneyleri ile devam eder. İnsan ölümsüzleştirilen astrositler ve beyin endotel hücreleri, endotel hücreleriyle temas için astrosit ve ayakların geçişine izin veren üç mikron gözenekli zarlar üzerinde yetiştirilir.

Yöntem, astrositlerin ve beclerin optimum kesintisiz tohumlama periyoduna izin verdi, bu da minimum hücre kaybıyla gözenekli yüzeye güçlü bir şekilde yapıştı ve üç gün boyunca birlikte akıcılığa ulaştı. Tohumlama sonrası. Her iki hücre tipi de, SVG'lerde glial fibriler asidik protein GFAP'nin ve von Vand faktörü VWF NEC'lerin ekspresyon paternleri ile gösterildiği gibi, gözenekli membranlar üzerinde hücreye özgü belirteçlerini korur.

Bir kontakt BBB modelinin en temel özelliği ile tutarlı olarak, astrositik NFE, üç mikronluk gözeneklerden luminal bölmeye geçebilir. Bu nedenle, bu boyuttaki gözeneklere oturan SVG'ler ve BES arasında potansiyel olarak temas olabilir. Ayrıca, SEM görüntüleme, SVG'lerin ve BBC'lerin, in vitro BBB temas modellerinin fiziksel bariyer işlevine yapay olarak katkıda bulunan bir fenomen olan membran gözenekleri üzerinde doğrudan büyüyebildiğini göstermektedir.

Bu çalışmada, TPAA fibrinolitik ajanın BBB üzerindeki etkisini araştırmak için insan teması BBB modeli kullanılmıştır. Bu in vitro çalışmalar, TPA'nın, her ikisi de farmakolojik olarak ilgili bir aralıkta olan konsantrasyon ve zamana bağlı bir şekilde bozulmamış BBB'nin geçirgenliğini gerçekten arttırdığını doğrulamaktadır. SVG astrositlerinin dramatik morfolojik değişiklikleri, TPA'ya maruz kaldıktan sonra gözenekli membranlarda belirgindir, bu da TPA'ya astrositik yanıtın TPA'nın neden olduğu BBB açılmasının altında yattığını düşündürmektedir.

Bu yöntem, inme hastasında kan pıhtılarını eritmek için kullanılan TPAA trombolitik ilacına kan beyin bariyerinin nasıl yanıt verdiğini araştırmayı amaçlayan araştırmamızda önemli bir rol oynamıştır. Bu, bu yöntemin literatürdeki ilk gösterimidir ve diğer araştırmacıların bunu kendi amaçları için benimseyebileceklerini umuyoruz.