Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

Bu prosedür, astrositlerin ve endotel hücrelerinin gözenekli bir membranın karşılıklı taraflarında birlikte kültüre edilmesiyle kan-beyin bariyerinin in vitro simülasyonunu yapmayı amaçlamaktadır. İlk olarak gözenekli membranın lüminal yüzeyini bir hücre dışı matriks ile kaplayın. Kollajen gibi proteinler, membranın ablıminal yüzeyinin üzerinde çıkarılabilir bir kuyu oluşturmak için ters çevrilmiş inserti harici bir silikon tüp ve dahili bir silikon tıpa ile uygun hale getirir.

Şimdi, astrosit hücrelerini, abluminal yüzeye yapışacak şekilde ters çevrilmiş insert üzerine ekleyin. Ardından tüpleri çıkarın ve inserti normal yönünde, ortam dolu bir kuyucuğun içine yerleştirin. Sonrasında, endotel hücrelerini insertin luminal bölmesine ekleyin ve karşı taraftaki astrositlerle birlikte ko-kültür yapın.

Sonuç olarak, çeşitli uyarıcı ajanlara yanıt olarak in vitro BBB'deki geçirgenlik değişikliklerini ölçmek için floresan izleyicilerin geçişi veya trans endotelyal elektriksal direncin kaydedilmesi kullanılır. Bu prosedürü, doktora çalışmaları sırasında kan-beyin bariyerini simüle etmek için kullandığımız bu modifiye ekim protokolünü geliştiren laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Bay Barry Nigo uygulamalı olarak gösterecek. Bu prosedür fikri, daha kaba ekim yöntemlerini test ettikten ve gözeneklerden ortam sızıntısının yanı sıra küçük ortam hacimleri nedeniyle yaşadığımız büyük hayal kırıklıklarından sonra ortaya çıktı.

Bu durum, prosedürümüzde gidermeye çalıştığımız kısa ve yetersiz astrosit yerleşme sürelerine yol açmıştır. Doku kültürü insertlerini 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin. Ardından, insertlerin lüminal yüzeyini kaplamak için 50 µL 132 µg/mL sıçan kolajen I ekleyin; kalıntı asitlerin uzaklaştırılması için nemlendirilmiş 37 °C'lik bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin ve insertlerin hem abluminal hem de lüminal taraflarını çift distile su ile yıkayın.

Ardından ekleri ters çevirin ve gözenekli membranın kenarına kısa bir elastik silikon tüp parçasını nazikçe yerleştirin. Temelde, abluminal yüzeyin üzerinde yeni bir kuyucuk oluşturun. Alt kısmı mühürlemek için.

Bir ucu 0,2 mililitrelik bir PCR tüpünün kesilmiş ucuyla kapatılmış silikon borudan bir tıpa hazırlayın. Ardından, steril bir pens kullanarak silikon tıpayı lüminal boşluğa yerleştirin ve membrana yaklaşık bir ila iki milimetre mesafe kalana kadar ilerletin. Sonrasında, 200 mikrolitre bakım ortamı içinde 40.000 astrositi, ablüminal membran yüzeyinin üzerindeki silikon kuyucuğa doğrudan ekleyin.

Astrositlerin yapışma durumunu izlemek için, 6,5 milimetrelik insert ile aynı yüzey alanına sahip olan ve faz kontrast mikroskobisi ile hücrelerin daha kolay görselleştirilmesine olanak tanıyan standart bir 96 kuyucuklu plaka kullanın. Astroset hücre süspansiyonunun aynı hacmini 96 kuyucuklu plakaya ekleyin. 96 kuyucuklu plaktaki ve dolayısıyla insert membranındaki astrositlerin steriliteyi korumak için yeterince yapışıp yapışmadığını belirlemek amacıyla süreç zaman içinde izlenecektir.

Filtrelenmemiş havaya maruz kalmayı en aza indirmek için monte edilmiş insertleri iki adet altı kuyucuklu plaka arasında taşıyın. Astrositlerin yapışmasını sağlamak için hücreleri inkübatöre yerleştirin. Kontrol 96 kuyucuklu plakayı da bu sırada inkübatöre yerleştirin.

Yaklaşık dört saat sonra, astrositlerin yapışıp yapışmadığını görmek için kontrol 96 kuyucuğunu kontrol edin. Eğer yapışmışlarsa, insert düzeneğini doku kültürü kabinine geri transfer edin. Harici silikon tüpleri ve tıpaları nazikçe çıkarın.

Ardından insertleri, her bir kuyucukta 800 microliters endotel hücre bakım ortamı içeren kuyucuklara normal dik oryantasyonda geri yerleştirin. Deneyden önce, 200 microliters hacminde 20.000 beyin endotel hücresini kolajen kaplı lüminal yüzeye ekleyin ve herhangi bir ortam değişimi yapmadan üç gün boyunca BEC ortamında ko-kültür yapın.

Silikon tüpleri ve tıkaçları, daha sonra kullanmak üzere otoklavlamadan önce etanol ile yıkayın. İn vitro kan-beyin bariyerini stimüle etmek için, önce abluminal ve luminal medyumları sırasıyla 600 µL ve 100 µL serumsuz BECS medyumu ile değiştirin. Luminal yıkama sıvısını aspire edin ve stimülan ajanlar içeren 100 µL serumsuz medyum ile değiştirin.

Eğer in vitro BBB, astrositik bölmeden indükleniyorsa, abluminal medyumu aspire edin ve yerine 600 µL serumsuz, uyarıcı ajanlar içeren medyum ekleyin. İnsan temas kan-beyin bariyeri modeli oluşturmak için işaretli izleyicilerin standart paraselüler veya transelüler geçirgenlik analizleriyle devam edin. Ölümsüzleştirilmiş insan astrositleri ve beyin endotel hücreleri, astrosit ayaklarının endotel hücrelerle temas etmesine izin veren üç mikron gözenekli membranlar üzerinde kültüre edilir.

Bu yöntem, astrositler ve BEC'ler için optimize edilmiş, kesintisiz bir ekim süresine olanak tanımış; bu hücreler gözenekli yüzeye minimum hücre kaybıyla güçlü bir şekilde tutunmuş ve ekimden sonra üç gün içinde birlikte konfluens seviyesine ulaşmışlardır. Her iki hücre tipi de gözenekli membranlar üzerinde, SVG'lerdeki glial fibrillary acidic protein GFAP ve NEC'lerdeki von Willebrand faktörü VWF ekspresyon modelleriyle belirtildiği üzere, hücreye özgü markerlarını korumuşlardır.

Bir temaslı KKB modelinin en temel özelliğiyle uyumlu olarak, astrositik NFE üç mikronluk gözeneklerden geçerek lüminal kompartmana ulaşabilir. Bu nedenle, bu boyutlardaki gözeneklere yerleşmiş SVG'ler ve BES arasında potansiyel olarak temas gerçekleşebilir. Ayrıca SEM görüntüleme, SVG'lerin ve BBC'lerin doğrudan membran gözeneklerinin üzerinde büyüyebildiğini göstermektedir; bu fenomen, in vitro KKB temas modellerinin fiziksel bariyer fonksiyonuna yapay olarak katkıda bulunur.

Bu çalışmada, TPAA fibrinolitik ajanın KKB üzerindeki etkisini araştırmak için insan temas KKB modeli kullanılmıştır. Bu in vitro çalışmalar, TPA'nın sağlam KKB'nin geçirgenliğini, her ikisi de farmakolojik olarak ilgili bir aralıkta olan konsantrasyona ve zamana bağlı bir şekilde artırdığını doğrulamaktadır. TPA'ya maruz kaldıktan sonra gözenekli membranlar üzerinde SVG astrositlerinde belirgin morfolojik değişiklikler görülmüştür; bu durum, TPA'ya karşı verilen astrositik yanıtın TPA kaynaklı KKB açılımının temelini oluşturduğunu göstermektedir.

Bu yöntem, kan pıhtılarını çözmek için inme hastalarında kullanılan TPAA trombolitik ilacına kan-beyin bariyerinin nasıl tepki verdiğini araştırmayı amaçlayan çalışmamızda kilit bir rol oynamıştır. Bu yöntemle ilgili literatürdeki ilk gösterim olup, diğer araştırmacıların da bu yöntemi kendi amaçları doğrultusunda benimsemelerini umuyoruz.