Vitamin E-TPGS ile Tek veya Çift Emülsiyon ile Oluşturulan PLGA Nanopartikülleri

Bu prosedürün genel amacı, ayarlanabilir boyutta polimer nanopartiküller oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle polimerin bir organik çözücü içinde çözülmesi ve ilaç veya floresan kapsülleme maddesinin eklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, polimerin emülsiyonlaştırıcı ajan içeren bir su fazıyla emülsifiye edilmesi ve ardından çözücü buharlaşırken partiküllerin daha büyük bir sulu hacim içinde sertleşmesine izin verilmesidir.

Ardından, partiküller yıkanır, santrifüjle toplanır ve uzun süreli saklama için liyofilize edilir. Son adım, nano partikül boyutunun ve yüzey morfolojisinin taramalı elektron mikroskobu veya SEM görüntüleme ile karakterize edilmesidir. Nihayetinde SEM, nano partikül boyutunun emülgatör konsantrasyonu değiştirilerek kontrol edilebildiğini göstermek için kullanılır.

Parçacıklar, hedef dokuda uzun süreli etki sağlamak amacıyla geniş bir terapötik ajan yelpazesini kapsülleyecek ve iletecek şekilde özelleştirilebildiği için bu tekniğin etkileri birçok insan hastalığının tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.

Emülsifikasyon adımlarının öğrenilmesi zordur; çünkü emülsiyonun nasıl oluştuğuna dair ince ayrıntılar, partiküllerin özelliklerini önemli ölçüde etkileyebilir. Nanopartikül hazırlığına başlamak için, PLGA olarak da bilinen yaklaşık 100 miligram polilaktik ko-glikolik asidi 13 x 100 milimetrelik bir deney tüpüne yerleştirin. Ardından, cam bir serolojik pipet kullanarak numuneye 1 mililitre etil asetat aktarın, tüpün üst kısmını alüminyum folyo ile kapatın ve ardından folyoyu parafilm ile güvenli bir şekilde sarın.

Çözücünün buharlaşmasını önlemek için parafilmi, flakonun üst kenarı ile folyonun alt kenarı boyunca sıkıca sardığınızdan emin olun. Test tüpündeki çözücü seviyesini işaretleyin ve polimerin gece boyunca çözünmesini bekleyin. Ertesi gün, herhangi bir buharlaşma meydana gelmişse ek çözücü ekleyin.

Aşağıdaki ekipman ve malzemeleri ultrasonik cihazın yakınındaki bir çeker ocakta hazırlayın. Bir vorteks, kauçuk pompalı iki küçük cam pastör pipeti ve bir manyetik karıştırıcı plaka hazırlayın. Ayrıca, ultrasonik cihazın altındaki bir standa buzlu suyla dolu büyük bir beher yerleştirin.

Ardından, 200 mililitrelik cam bir behere 45 mililitre %0,3 ağırlık/hacim vitamin E-T-P-G-S ekleyin ve karıştırma hızını 360 RPM olarak ayarlayın. Sonra, 13 x 100 milimetrelik cam bir deney tüpüne iki mililitre %0,3 ağırlık/hacim vitamin E-T-P-G-S ekleyin. Hidrofobik ajanları karıştırmak için, deney tüpünün çeperlerine değdirmemeye dikkat ederek enkapsülanı doğrudan polimer çözeltisine ekleyin ve enkapsülan homojen olarak dağılana kadar tüpü vorteksleyin.

Hidrofilik ajanlar için, kapsülleme maddesini polimer çözeltisi ile emülsifiye edin. Polimer çözeltisinin yüzeyine tampon çözelti içindeki ilaçtan 50 µL'ye kadar ekleyin. Karışımı buz üzerinde yaklaşık 10 saniye boyunca veya çözelti opak ve homojen hale gelene kadar ultrasonik işleme tabi tutun.

Ardından, vitamin E-T-P-G-S içeren test tüpünü dikey tutarak yüksek hızda vorteksleyin. Cam postür pipetini vortekslenen tüpün üst kısmının bir ila iki santimetre üzerinde tutun ve polimer çözeltisini vortekslenen sıvının yüzeyine yavaşça damla damla ekleyin. Polimer çözeltisinin tamamı eklendikten sonra pipetin tüpün kenarlarına değmediğinden emin olun.

Çözeltiyi vortekslemeye devam edin. Şimdi 15 saniye boyunca emülsiyon oluşturun. Emülsifiye polimeri derhal ultrasonikatöre aktarın.

Test tüpünü buzlu suyun içinde tutun ve emülsiyonu onar saniyelik üç patlama halinde sonikasyona tabi tutun. Eşit sonikasyon sağlamak için emülsiyonu prob boyunca yukarı ve aşağı hareket ettirin; probun test tüpünün kenarlarına veya tabanına değmemesine dikkat edin. Devam etmeden önce çözeltinin soğumasına izin vermek için her on saniyelik sonikasyon arasında beş ila 10 saniye ara verin.

Ardından, karıştırma çözeltisinden bir ila iki mililitre %0,3 vitamin E-T-P-G-S'yi emülsiyona ekleyin. Bu işlem, emülsifiye polimeri seyrelterek dökülmesini kolaylaştıracaktır; emülsiyonu karıştırma çözeltisinin içine boşaltın. Deney tüpünde kalan tüm çözeltiyi karıştırma çözeltisinin içine yıkayarak aktarın.

Nanoparçacıkların sertleşmesi için üç saat boyunca karıştırın. Eğer kapsülleme maddesi ışığa duyarlıysa, beheri alüminyum folyo ile sarın ve çözücü buharlaşmasını kolaylaştırmak için üst kısmını açık bırakın. Nanoparçacıkları toplamak için önce nanoparçacık çözeltisini 30 mililitre nominal hacme sahip iki Oak Ridge santrifüj tüpüne paylaştırın ve tüpleri birbirine göre 0,1 gram toleransla dengeleyin. Ardından nanoparçacıkları sabit açılı bir rotorda 17.000 rpm'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

RC f. Daha uzun santrifüj süreleri, daha küçük nanopartiküllerin daha yüksek bir fraksiyonunun toplanmasıyla sonuçlanacaktır. Nanopartikül peletini bozmamaya dikkat ederek süpernatanı atın.

Beş mililitre distile su ekleyin ve nanopartikülleri tamamen süspande etmek için benmari, rotator ve vorteks kullanın. İki santrifüj tüpünün içeriğini tek bir tüpte birleştirin ve toplam hacim 30 mililitre olacak şekilde 20 mililitre distile su ekleyin. Ardından, toplamda üç yıkama olacak şekilde santrifüjleme ve yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın.

Son pelet Resus süspansiyonunun sıvı hacmi dört ila beş mililitre olmalıdır. SEM görüntülemesi için telos içermeyen nanoparçacıklardan küçük bir alikotu, geri kalanlardan ayrı olarak dondurun. PLGA nanoparçacıklarının homojen ve tam resus süspansiyonu için kriyoprotektan olarak polimere bir ila iki ağırlık oranında TLO ekleyin.

Bu işlem, partikül yüzeyine zarar verebilecek ve agregasyona neden olabilecek buz kristallerinin oluşmasını önleyecektir. Nanopartikülleri önceden tartılmış beş mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın, ardından en az 30 dakika boyunca -80 °C'de dondurun. Sonrasında tüpün kapağını açın ve üst kısmını bir lastik yardımıyla laboratuvar peçetesi yerleştirerek kapatın.

Herhangi bir erime meydana gelirse içeriğin tamamen erimemesi için hızlı hareket edin. Liyofilize cihazına yerleştirmeden önce tekrar dondurun ve 5 mL örneği 72 saat boyunca liyofilize edin. Ardından kapağı kapatın, tüpü sarın ve liyofilize edilmiş partikülleri -80 °C'de saklayın.

Görüntüleme gününde, bir SEM stub üzerine çift taraflı karbon bant şeridi yerleştirin. Daha sonra referans olarak kullanmak için stub'ın metal kısmını kalıcı bir markörle etiketleyin. Liyofilize nanoparçacıklardan küçük bir miktar toplamak için metal bir spatula kullanın ve bunları bandın yüzeyine nazikçe yayın.

Gevşek nanopartikülleri temizlemek için stub yüzeyini laboratuvar peçetesiyle fırçalayın veya basınçlı hava kullanın. Partikülleri 5 ila 15 milimetre demet çalışma mesafesi, 5 ila 12 kilovolt güç ve 1 ila 3 spot boyutu kullanarak görüntüleyin; daha yüksek demet güçleri, partiküllerin yüzey morfolojisini değiştirecek bölgesel numune ısınmasına neden olabilir. Mikropartiküller 100 kat büyütmede gözlemlenir ve nanopartiküller 3000 kat büyütmede ayırt edilebilir olacaktır.

SEM ile kolayca görselleştirilebilen partikülleri tespit etmek için büyütme odağı bir kürenin üst kısmına odaklayın; partikül boyutu ve morfolojisinin temsili bir örneğini elde etmek için her gruptan en az üç görüntü toplayın. Bu yöntem kullanılarak, pürüzsüz bir yüzey morfolojisine sahip, birbirine kaynamamış bireysel küreler şeklinde görünen ve örnek boyunca geniş bir boyut aralığında dağılan partiküller oluşturulabilir. Burada gösterilen mikropartiküllerin ortalama çapı 730 nanometredir.

Burada, hidrofobik ilaç kampin'i kapsülleyen tekil emülsiyonla oluşturulmuş nanoparçacıklar gösterilmektedir. Bu parçacıklar, 340 nanometre ortalama çap ile daha da küçük boyutlara ulaşmıştır. Daha yüksek emülgatör konsantrasyonları, ortalama çapları 2000'den 200 nanometreye düşürerek daha küçük parçacıklar üretmiştir.

Buradaki SEM görüntülerinde gösterildiği üzere, emülgatör konsantrasyonu %0,01'den %0,3'e yükseldiğinde artış gözlenmiştir. Ancak, vitamin E-T-P-G-S konsantrasyonu çok yüksek olduğunda, %1 vitamin E-T-P-G-S kullanıldığında ayrık partiküller oluşmamış, tüm yapı boyunca yoğun birleşmeler ve tabaka benzeri yapılar meydana gelmiştir. Doğru. Emülsifikasyon yoluyla PLG nanopartiküllerinin nasıl üretileceğini öğrendikten sonra, nanopartikülleri belirli hücre tipleriyle veya vücudun belirli bölgeleriyle etkileşime girecek şekilde tasarlamak için yüzey modifikasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, emülsifikasyon yoluyla tekrarlanabilir ve ayarlanabilir boyutta partiküllerin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.