Name: Protein A Membran Adsorberleri ve Kolaylaştırılmış bir İş Akışı Kullanarak Kimerik İnsan Fc Ekspresyon Proteinlerinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-08T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Öğrenin, Protein A membran adsorberleri kullanarak kimerik insan Fc ekspresyon proteinlerinin hızlı izolasyonunu ve karakterizasyonunu. Bu yöntem, geleneksel yöntemlere kıyasla işlem süresini önemli ölçüde azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, uzman teknik yardım için Bay Luis F. Delgadillo'ya (Ohio Üniversitesi Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü), Bay Matthew H. Williams'a (Ohio Üniversitesi Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü) ve Dr. Filiberto Cedeno-Laurent'e (Brigham ve Kadın Hastanesi ve Harvard Tıp Fakültesi) teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca 2011 Kış 2011 CHE 404/BME 504 ve Sonbahar 2012 CHE 4830/BME 5830 öğrencilerine (Ohio Üniversitesi Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik ve Biyomedikal Mühendisliği Programı Bölümü) teknik tavsiye ve tartışma için teşekkür etmek istemeleridir. Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Büyük Araştırma Araçları hibesi CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatoloji Vakfı Araştırma Hibesi A050422 (SRB), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) NCI hibesi 1R15CA1618 tarafından desteklendi.30-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Doktora Sonrası Burs F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) ve NIH NCCAM hibe R01AT004628 (CJD).

1. Protein A'nın Benzeşimini Doğrulayın
<ol><li>Fc ekspresyon proteininin (rekombinant füzyon proteini veya IgG antikoru, heretofore olarak adlandırılan "protein"), A membran adsorber proteinini kullanmadan önce A14-17 proteini için kabul edilebilir bir yakınlığa sahiptir ve proteinin stok çözeltisinde varlığını test edin(örneğin, 5 dakikalık pelet askıya alınmış hücreler için 1.000 x g'da santrifüjleme ile netleştirilmiş hücre kültürü süpernatantı). Akış sitometrisi, Batı şişkinliği, ELISA vb. laboratuvar tercihine göre protein fonksiyonunu ve/veya Fc varlığını tespit etmek. İdeal olarak, protein A membran adsorber kapasitesini aşmamak için hücre kültürü süpernatantındaki proteini ölçün (adım 6). Protein tespit edilirse devam edin.</li>
</ol>2. Protein A Membran Adsorber ve Hücre Kültürü Supernatant hazırlayın
<ol><li>Membran adsorberini hazırlamak için üreticinin talimatlarını izleyin. Havanın membran adsorber'e girmesine asla izin vermeyin. Membran adsorberden perfüzyona uğramış tüm çözeltiler oda sıcaklığında olmalı ve 0,22 μm filtre kullanılarak önceden filtrelenmelidir. 10 ml'lik bir şırınnayı 0,22 μm filtreli Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) veya tercih edilen tampon ve deşarj hava kabarcıkları ile doldurun. Depolama çözeltisini çıkarmak ve kullanımdan hemen önce membran adsorberini aşındırmak için DPBS'yi kullanın.</li>
	<li>Vakumla yönlendirilen 0,22 μm steril filtrasyon ünitesi kullanarak hücre kültürü üstnatantını membran adsorberi aracılığıyla perfüzyondan hemen önce filtreleyin.</li>
</ol>3. Protein A Membran Adsorberini Yükleyin
<ol><li>Hücre kültürünü bir Luer Lock şırındına (30 ml veya daha büyük) apire edin ve hava kabarcıklarını boşaltın.</li>
	<li>Şekil 1'degösterildiği gibi malzeme ve ekipmanları birleştirin. Şırındırı membran adsorberinin girişine bağlayın. Membran adsorber çıkışına esnek boru takın. İsterseniz, şırınna ve membran adsorber arasına 0,22 μm şırınna filtresi yerleştirin. Adsorberden gelen akışı (filtrat olarak da bilinir) yakalamak için bir şişe veya şişe kullanın.</li>
	<li>Şırıng pompasını istediğiniz hacimsel akış hızına ayarlayın, ancak üreticinin önerilen akış hızını(örneğin 10 ml/dk) aşmayın. Hücre kültürünü membran adsorberi ile aşırıya uçurun, bir beherde veya başka bir kapta akış toplayın. Şırınnayı ihtiyaç duyulan süpernatantlarla yeniden yükleyin.</li>
	<li>İsterseniz, akış sitometrisi, Batı şişkinliği, ELISA vb. laboratuvar tercihe göre. Akışı yeniden gözden geçirmek genellikle gereksizdir.</li>
</ol>4. Membran Adsorberinden Elute Proteini
<ol><li>İlişkisiz proteinleri çıkarmak için membran adsorberini 10 ml DPBS ile yıkayın.</li>
	<li>Membran adsorberinden istenen akış hızında(örneğin 1 ml/dk) 10-15 ml elüasyon tamponu(örneğin amin bazlı elüasyon tamponu (pH 2.8)) kullanarak sıvı proteini. Nötralize edici tampon içeren bir tüpte(örneğin, 1 M Tris (pH 9.4)) elüasyon hacminin % 10'unda (1.0-1.5 ml) elüat yakalayın.</li>
	<li>Alternatif olarak, toplam 10-15 ml elüasyon tamponu hacmi kullanarak, bir ml'lik elüte proteini 100 μl nötralizasyon tamponu içeren tüplere indirir. Her kesir protein varlığını test etmek için tercih edilen karakterizasyon yöntemini kullanın.</li>
	<li>Membran adsorberini üreticinin talimatlarına göre yenilenin. 10 ml 0,22 μm filtreli DPBS veya tercih edilen tampon, daha sonra 1 N NaCl'de 10 ml 0,22 μm filtreli 50 mM NaOH ve son olarak 10 ml 0,22 μm filtreli DPBS. 4 ºC'de uzun süreli depolama için MEMB adsorberini DPBS'de% 20 etanol ile doldurun.</li>
</ol>5. Konsantre Olun ve Proteini Dialyze
<ol><li>Tüm eluatları (veya adım 4.3'te belirlenen protein içeren elüasyon fraksiyonlarını) 10 kDa moleküler ağırlık kesme santrifüj filtre ünitesinde biriktirin. Santrifüjleme için üreticinin talimatlarını izleyin.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına uyarak, retentate'i tercih edilen tampona karşı küçük hacimli bir diyaliz ünitesinde (10 kDa moleküler ağırlık kesme) dialyze edin. Protein çökeltme bir endişe ise, diyalze malzemeye tampon eklenmesi gerekebilir. İstenirse, diyalizlenmiş malzeme 6.</li>
</ol>6. Hızlandırılmış Batı Blotting Prosedüründe Saflaştırılmış Ürünü Ölçün ve Karakterize Edin
<ol><li>SDS-PAGE tarafından tercih edilen jeldeki saflaştırılmış protein ve Fc standartlarını, istenen18-20gibi azaltıcı veya tahriş edici olmayan koşullar altında çözün. Çalışma süresini en aza indirmek için midi jel yerine mini jel kullanın.<ol>
<li>Henüz bilinmiyorsa, bant sinyalinin yüklenen miktara göre doğrusal olarak değiştiği Fc standartları aralığını belirleyin(örneğin 0,1-1 mg). Saflaştırılmış proteini ölçmek ve karakterize etmek için kullanılacak aynı jeli, çalışma koşullarını, transfer koşullarını ve reaktifleri kullanın.</li>
			<li>Saflaştırılmış protein bandı sinyallerinin görüntü analizinde Fc standartlarının doğrusal sinyal aralığında olduğundan emin olmak için DPBS ile seyreltilmiş numuneler de dahil olmak üzere birden fazla numune miktarı saflaştırılmış protein yükleyin.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Proteinleri jelden bir polivinliden florür (PVDF) membranına semidry blotter13kullanarak, leke üreticisinin talimatlarını izleyerek aktarın. Transfer süresi genellikle 5-10 dakikadır. İstenirse, Coomassie transfer verimliliğini doğrulamak için transferden sonra jeli lekeler21.</li>
	<li>Vakum destekli protein algılama sistemi kullanarak laboratuvar tercihine göre alkalin fosfataz (AP) veya at turpu peroksidazına (HRP) konjuge edilmiş anti-Fc veya anti-IgG ile immünblotting gerçekleştirin. İmmünblotting süresi genellikle 1 saatten azdır.</li>
	<li>Substratı ve tercih edilen yöntemi kullanarak immünoblot geliştirin(örneğin AP substratı ve gelişmiş kemimuminesans).</li>
	<li>Görüntü analizi ile saflaştırılmış proteini ölçün. Fc standartlarından gelen bant sinyallerinde doğrusal bir gerileme gerçekleştirin. R2>0,90 ise, bant sinyallerinden protein miktarını hesaplamak için çizginin denklemini kullanın. Gerekirse örnek seyreltme için hesap. Proteinin nicelemesi Fc temelinde gerçekleştirildiği için, protein ve Fc arasındaki moleküler ağırlık farklılıklarının değerini ayarlayın<.</li>
	<li>Akış sitometrisi, Batı şişkinliği, ELISA, vb. laboratuvar tercihe göre.</li>
	<li>Proteini istenen konsantrasyona seyreltin ve/veya uzun süreli depolama için aliquoting yapmadan önce, dondurulmuş veya başka bir şekilde saflaştırılmış protein çözeltisine istenen koruyucuları veya stabilizatörleri ekleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Gagnon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+trends+in+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Technology trends in antibody purification.</a> J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).</li>
<li>Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioseparation+in+antibody+manufacturing%3A+The+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly.</a> Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).</li>
<li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2, 480-499 (2010).</li>
<li>Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+of+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Anal.+Technol.+Biomed.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Future of antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).</li>
<li>Boi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+adsorbers+as+purification+tools+for+monoclonal+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Anal.+Technol.+Biomed.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).</li>
<li>Cuatrecasas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+by+affinity+chromatography.+Derivatizations+of+agarose+and+polyacrylamide+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads.</a> J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).</li>
<li>Shukla, A. A., Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-use+disposable+technologies+for+biopharmaceutical+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing.</a> Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).</li>
<li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+new+protein+a+affinity+membrane+for+the+primary+recovery+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies.</a> Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).</li>
<li>Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+immunoglobulins+g+by+protein+a%2Fg+afinity+membrane+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography.</a> J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).</li>
<li>Thommes, J., Etzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+chromatographic+separations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Alternatives to chromatographic separations.</a> Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).</li>
<li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+and+simulation+of+affinity+membrane+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Modelling and simulation of affinity membrane adsorption.</a> J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).</li>
<li>van Beijeren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-aided+process+design+of+affinity+membrane+adsorbers%3A+A+case+study+on+antibodies+capturing%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Pap%22%5BJournal%5D)">Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing.</a> Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).</li>
<li>Lauriere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semidry+electroblotting+system+efficiently+transfers+both+high-+and+low-molecular-weight+proteins+separated+by+sds-page%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page.</a> Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).</li>
<li>Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+antibodies+using+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of antibodies using affinity chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).</li>
<li>Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+a+from+staphylococcus+aureus.+Its+isolation+by+affinity+chromatography+and+its+use+as+an+immunosorbent+for+isolation+of+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins.</a> FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).</li>
<li>Hober, S., Nord, K., Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+a+chromatography+for+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Analyt.+Technol.+Biomed.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein a chromatography for antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).</li>
<li>Kronvall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface+component+in+group+a%2C+c%2C+and+g+streptococci+with+non-immune+reactivity+for+immunoglobulin+g%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g.</a> J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).</li>
<li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+nascent+galectin-1+chimeric+molecule+for+studying+the+role+of+leukocyte+galectin-1+ligands+and+immune+disease+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation.</a> J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+t4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+Procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Coomassie+brilliant+blue+g250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li>
<li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+inhibition+of+galectin-1-binding+carbohydrates+accentuates+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), (2009).</li>
<li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> J. Vis. Exp. (38), (2010).</li>
<li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analyses+of+all+Influenza+Type+A+Viral+Hemagglutinins+and+Neuraminidases+using+Universal+Antibodies+in+Simple+Slot+Blot+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.</a> J. Vis. Exp. (50), (2011).</li>
</ol>

Açıklayacak bir şey yok.

Burada açıklanan protokol, ürün geri kazanımını veya şişirme maliyetini önemli ölçüde tehlikeye atmadan, insan Fc'yi (Gal-1hFc) ifade eden bir kimerik füzyon proteinini hızla izole etmek ve karakterize etmek için geliştirilmiştir. Aerodinamik iş akışının temel bileşenleri, izolasyon için bir protein A membran adsorber ve Batı şişkinliği ile karakterize için semidry transferi ve vakum destekli immünobotting'dir.
Gal-1hFc'nin 300 ml hücre kültürü süpernatantından (geleneksel bir protokolde 20+ s...

Hücre kültürü süpernatantlarından ve seyreltilmiş lir hücre çözeltilerinden immünoglobulin G (IgG) Fc parçalarını ifade eden antikorların ve rekombinant proteinlerin izolasyonu protein A benzeşim kromatografisi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Temel bilim ve mühendislik laboratuvarlarında ve endüstrisinde, gözenekli protein A kaplı agarose, cam veya polimerik boncuklarla dolu sütunlar, yüksek finansal maliyetlere ve uzun işlem sürelerine rağmen, benzeşim kromatografisi için en yaygın olarak1-3kullanılır. Benzeşim kromatografisinin hem laboratuvar hem de endüstriyel ortamlardaki en büyük gider ve işleme darboğazını temsil ettiği iyi takdir edilir2,4. Sonuç olarak, proses treni1,2,5-7'dengenel ürün geri kazanımından ödün vermeden maliyet ve işlem süresini azaltmak için çok sayıda iyileştirme geliştirilmiştir. Antikorların ve diğer Fc ekspresyon proteinlerinin izolasyonu için özellikle umut verici olan, A membran adsorber2,5,7-10proteini kullanılarak benzeşim kromatografisidir. Kolon kromatografisinde FC yakalaması difüzyon sınırlıyken(yani Fc ekspresyon proteini, protein A'nın çoğunluğuna ulaşmak için iç gözeneklere ve a yoluyla dağılmalı) sütun boyunca yüksek basınç düşüşü ile, membran adsorberlerindeki kütle taşımacılığı toplu konveksiyon ile yönlendirilir ve bu da difüzyon sınırlamalarından kaçınmaya neden olur8,9,11,12. Ek olarak, membran adsorber boyunca basınç düşüşü düşüktür, böylece boncuk dolu sütunlara kıyasla daha hızlı perfüzyon akış hızlarına izin verir8,9,11,12. Böylece laboratuvar ölçeği izolasyonu için membran kromatografinin izolasyon süresini birkaç saat azaltarak kolon kromatografisine göre ürün yakalamayı artıracağı öngörülür. Ayrıca, membran adsorberlerinde IgG adsorpsiyonu için matematiksel modeller önerilmiştir8,9,11,12, böylece son kullanıcıların laboratuvardaki performansı tahmin etmelerini sağlar.
Temel bilim ve mühendislik laboratuvarlarındaki bir diğer darboğaz, Fc ekspresyasyon proteininin karakterizasyonudur. Bununla birlikte, Batı lekeleri gibi karakterizasyon testlerini tamamlamak için uygun yöntemlerin seçilmesi, ürün testlerine harcanan zamanı büyük ölçüde azaltabilir. Örneğin, süreksiz bir tampon sisteminde semidry transferi, sürekli bir tampon sisteminde 1-2 saat tank (ıslak) transferinin aksine, proteinlerin bir SDS-PAGE jelinden polivinil difluoridin (PVDF) membrana elektroforetik transferini birkaç dakika içinde gerçekleştirebilir13.
İnsan IgG'nin fc parçasını ifade eden bir kimerik füzyon proteinini izole etmek ve karakterize etmek için hızlı, ucuz ve etkili bir protokol burada açıklanmıştır. Çoğu ekipman standart temel biyomedikal bilim, biyoloji, kimya ve (biyo)kimya mühendisliği laboratuvarlarında mevcuttur ve tüm reaktifler ticari olarak mevcuttur. Bir murine galektin-1/insan Fc chimeric füzyon proteininin (Gal-1hFc) izolasyonundan ve karakterizasyonundan temsili sonuçlar elde edilmiş olsa da, aerodinamik protokol antikorlar, Fc parçaları veya diğer Fc füzyon proteinleri gibi fc parçasına sahip diğer moleküllerin izolasyonuna uygulanabilir. Geliştirmelerimiz, standart yöntemlere kıyasla benzer veya geliştirilmiş ürün geri kazanımı elde ederken işlem süresini önemli ölçüde azalttı (4 saat kadar az ancak daha tipik olarak ~9 saat, 20+ çalışma saatine kıyasla).

<table><tbody><tr><td>Protein A membran adsorbe edici (Sartobind Protein A 2 ml)&nbsp;</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>93PRAP06HB-12--A</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra santrifüj filtre, 10 kDa, 4 ml</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td>Gerekirse 15 ml hacim kullanın</td></tr><tr><td>Steril vakum filtre ünitesi, 0.22 & m, 500 ml</td><td>Kırlangıç</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Luer Kilit uçlu 10 ml Şırınga</td><td>BD</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Luer Kilit uçlu Şırıngalar</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Tygon laboratuvar hortumu (1/16 inç x 1/8 inç x 50 ft)</td><td>Cole Parmer</td><td>WU-95903-16</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Diyaliz Cihazları (10K MWCO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>69576</td><td></td></tr><tr><td>Snap i.d. antikor toplama tepsisi</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDABTR</td><td></td></tr><tr><td>Snap i.d. tek kuyulu leke tutucu</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDBH01</td><td></td></tr><tr><td>Elüsyon tamponu</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Tris, ultra saf</td><td>Fisher Scientific</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, Ca2+ / Mg2 + </td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Fc</td><td>Bethyl Araştırma Laboratuvarları</td><td>P80-104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-insan Fc-APC</td><td>Jackson İmmünoaraştırma</td><td>109136170</td><td></td></tr><tr><td>Anti-insan Fc-AP</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5018</td><td></td></tr><tr><td>Alkalin fosfataz substrat</td><td>Promega</td><td>S3841</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometri tüpleri (5 ml polistiren veya polipropilen)</td><td>BD</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Harvard Aparatı</td><td>55-2226</td><td>Peristaltik bir pompa da kabul edilebilir</td></tr><tr><td>Protein jeli elektroforez sistemi</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>552BR094876</td><td>Herhangi bir jel elektroforez sistemi kabul edilebilir, ancak mini jel sistemleri en hızlı çalışır</td></tr><tr><td>Yarı kuru kurutma kağıdı</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>690BR006163</td><td>Herhangi bir transfer sistemi kabul edilebilir, ancak süreksiz transfer sistemleri elektroforetik transferi en hızlı şekilde gerçekleştirir</td></tr><tr><td>SNAP kimlik vakum destekli protein tespit sistemi</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDBASE</td><td>Yükseltilmiş bir model bu özel enstrümanın yerini almıştır, ancak her ikisi de aynı şekilde çalışmalıdır</td></tr></tbody></table>

protein a membran adsorberleri ve kolaylaştırılmış bir İş akışı kullanarak kimerik İnsan fc ekspresyon proteinlerinin İzolasyonu ve karakterizasyonu

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Biyomoleküllerin hücre kültüründen endüstriyel ölçekte arındırılması için laboratuvar ölçeğinde süpernatantlar ve lisli hücre çözümleri benzeşim kromatografisi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Gözenekli protein kullanılarak benzeşim kromatografisi Sütunlar halinde paketlenmiş agarose boncukları, IgG'nin Fc parçalarını ifade eden antikorların ve rekombinant proteinlerin laboratuvar ölçeği izolasyonunun tartışmasız en yaygın yöntemi olsa da, zaman alıcı ve pahalı bir süreç olabilir. Zaman ve finansal kısıtlamalar, özellikle seyreltilmiş çözeltilerden yüzlerce mikrogram ila miligram proteini geri kurtarması gereken, ancak yüksek basınçlı sıvı dağıtım sistemlerine ve / veya biyobenzerlik konusunda uzman personele erişimi olmayan küçük temel bilim laboratuvarlarında göz korkutucudur. Ayrıca, ürün nicelemesi ve karakterizasyonu da birkaç iş günü boyunca işlem süresini aşırı uzatabilir ve giderleri (sarf malzemeleri, ücretler vb.)şişirebilir. Bu nedenle, bir Fc parçasına sahip antikorların ve diğer proteinlerin laboratuvar ölçeği izolasyonu ve karakterizasyonu için hızlı, ucuz, ancak etkili bir protokol gereklidir. Bu amaçla, 20' den fazla çalışma saati gerektiren geleneksel yöntemlerin aksine, sınırlı deneyime sahip teknik personel tarafından 9 saatten daha kısa bir sürede (kabaca bir iş günü) ve 4 saat kadar hızlı bir şekilde tamamlanabilen bir protokol tasarladık. Gerekli ekipmanların çoğu standart biyomedikal bilim, biyokimya ve (biyo)kimya mühendisliği laboratuvarlarında mevcuttur ve tüm reaktifler ticari olarak mevcuttur. Bu protokolü göstermek için, hücre kültürü üstnatantından insan Fc'ye (Gal-1hFc) kaynaşmış kimerik murine galectin-1'in A membran adsorber proteini kullanılarak izole edildiği temsili sonuçlar sunulmaktadır. Saflaştırılmış Gal-1hFc hızlandırılmış bir Batı blotting analiz prosedürü kullanılarak ölçüldü ve akış sitometrisi kullanılarak karakterize edildi. Kolaylaştırılmış iş akışı, antikorlar gibi diğer Fc ekspresyel proteinleri için değiştirilebilir ve/veya alternatif niceleme ve karakterizasyon yöntemlerini içerecek şekilde değiştirilebilir.

Fc ekspresyon proteinlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için kolaylaştırılmış protokol, insan Fc 'ye (Gal-1hFc) kaynaşmış kimerik murine galektin-1'i seyreltik hücre kültürü süpernatantlarından işlemek için rutin olarak kullanılır. Şekil 2'deki akış çizelgesi, protokoldeki her adım için iş akışını ve zamanı gösterir. Tipik bir 300 ml'lik süpernatant grubu için, elütion fraksiyonlarının isteğe bağlı akış sitometrisi testi gerçekleştirildiğinde toplam işlem süresi yaklaşık 9 saattir. Akış sitometresi v...

Protein A agarose boncuk dolu sütunlar kullanılarak geleneksel benzeşim kromatografisi ile karşılaştırıldığında, protein A membran adsorberleri antikorların ve diğer Fc parça ifade eden proteinlerin laboratuvar ölçeğinde izolasyonunu önemli ölçüde hızlandırabilir. Uygun analiz ve niceleme yöntemleri protein işlemeyi daha da hızlandırarak izolasyonun/karakterizasyonun 20+ iş saati yerine tek bir iş gününde tamamlanmasını sağlayabilir.

Protein A Membran Adsorberleri ve Kolaylaştırılmış bir İş Akışı Kullanarak Kimerik İnsan Fc Ekspresyon Proteinlerinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Bu prosedürün genel amacı; protein A membran absorbanlar ve optimize edilmiş bir iş akışı kullanarak, kimera insan FC eksprese eden proteinleri verimli ve etkili bir şekilde izole etmek ve karakterize etmektir. Bu işlem, öncelikle hücre kültürü süpernatantının 0.22 mikronluk bir filtre ile berraklaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise akış sisteminin kurulması ve hücre kültürü süpernatantının protein A membran absorban üzerinden perfüzyonuna başlanmasıdır.Ardından, insan FC eksprese eden protein, ultrafiltrasyon yoluyla konsantre edilen sonuç EIT ile membran absorbsiyondan uzaklaştırılır ve bunu diyaliz yoluyla tampon değişimi izler. Son adımlar, konsantre proteinin kalitesini ve miktarını belirlemek için akış sitometrisi ve western blotting yöntemlerini kullanmaktır. Nihayetinde, protein A membran absorbsörleri ve optimize edilmiş bir iş akışı, protein A arole hızla paketlenmiş kolonlar içeren geleneksel afinite kromatografisine kıyasla işlem süresinde bir azalma ve protein veriminde potansiyel bir artış göstermektedir.Bu tekniğin, kolon afinite kromatografisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, membran absorbsiyonunun daha kısa işlem süresiyle potansiyel olarak

isolation-characterization-chimeric-human-fc-expressing-proteins

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hücre geçirgen çapraz bağlayıcı DSP [dithiobis-(succinimidyl propiyonat)] stabilize geçici ve labil...

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

Yeni ve son derece verimli, iki kademeli afinite kromatografisi protokolü geliştirildi ve ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yöntem iki içsel yakınlık küçük bir arıtma etiketi dayanan ve farklı özelliklere sahip geniş bir hedef proteinlerin uygulanabilir.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Bu video, Çin Hamster Yumurtalık hücrelerinden hasat edilen hücre kültürü sıvısından monoklonal antikorların saflaştırılması için bir testi göstermektedir. Numunedeki antikorların Fc bölgesine bağlanan ve onları kirleticilerden etkili bir şekilde ayıran hareketsizleştirilmiş protein A içeren gözenekli bir cam reçine kullanır. Düşük pH'lı bir elüsyon tamponunun kullanılması, saflaştırılmış antikorların alınmasını kolaylaştırarak etkileşimi zayıflatır.

Çin Hamster Yumurtalık Hücreleri Tarafından Üretilen Monoklonal Antikorları Saflaştırmak İçin Bir Teknik

Bu video, antikor üreten bir hücre kültüründen elde edilen kültür süpernatantından monoklonal antikorların saflaştırılması için bir tekniği göstermektedir. İşlem, boncuklar üzerindeki süpernatanttaki antikorları hareketsiz hale getiren ve kirleticilerden etkili bir şekilde ayrılmaya izin veren konjuge Protein A ile çapraz bağlı agaroz boncuklarından oluşan bir matrisin kullanılmasını içerir. Düşük pH'lı bir elüsyon tamponu uygulanarak, protein A-antikor etkileşimi gevşetilir ve antikor içeren...

Monoklonal Antikorların Saflaştırılması için Bir Afinite Kromatografisi Tekniği

Yapısal olarak ilişkili proteinler sık sık farklı Biyolojik işlevleri uygulamak. Eşdeğer chimeric proteinleri oluşturmak için bu proteinler bölgelerinde alışverişi için onların fonksiyonel sapma sorumludur kritik protein bölgeleri tanımlamak için yenilikçi bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Fonksiyonel Protein bölgeleri Chimeric Protein inşaat aracılığıyla tanımlaması

Otomatik microbioreactors hasat hücre kültürü sıvı (HCCF) bir monoklonal antikor arıtma ve sonraki analizi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Kritik kalite niteliklerini (CQAs) belirlemek ve önemli bilgileri ayıklamak için sınırlı numune hacmini maksimize etmek için analitiklerin kullanılması da sunulmaktadır.

Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Bu prosedürde, Bir DsRed tabanlı epitop ligand protein A alternatif olarak, ham bitki özleri veya hücre kültürü supernatants monoklonal antikorların yakalanması için son derece seçici afinite reçine üretmek için immobilize edilir.

Affinity Kromatografi Reçiyatlarının Hızlı Gelişimi İçin Aktif Çapraz Bağlantılı Agarose - Örnek Olay Olarak Antikor Yakalama

Antijenik peptid ve Fc-III mimetik (DCAF) çift fonksiyonlu bir konjuge gelişimi zararlı antikorların ortadan kaldırılması için yeni bir yeniliktir. Burada, Dang virüsü enfeksiyonu sırasında antikorbağımlı geliştirme etkisini ortadan kaldırmak için seçici olarak 4G2 antikor engelleyebilir DCAF1 molekülünün sentezi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Antijenik Peptid ve Fc-III Mimetics (DCAF) Çift Fonksiyonlu Konjuge tarafından Hedefli Antikor Engelleme

Öğrenin, Protein A membran adsorberleri kullanarak kimerik insan Fc ekspresyon proteinlerinin hızlı izolasyonunu ve karakterizasyonunu. Bu yöntem, geleneksel yöntemlere kıyasla işlem süresini önemli ölçüde azaltır.

Protein A Membran Adsorberleri ve Kolaylaştırılmış bir İş Akışı Kullanarak Kimerik İnsan Fc Ekspresyon Proteinlerinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal

Protein A Membran Adsorberleri ve Kolaylaştırılmış bir İş Akışı Kullanarak Kimerik İnsan Fc Ekspresyon Proteinlerinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet