Protein A Membran Adsorberleri ve Kolaylaştırılmış bir İş Akışı Kullanarak Kimerik İnsan Fc Ekspresyon Proteinlerinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı; protein A membran absorbanlar ve optimize edilmiş bir iş akışı kullanarak, kimera insan FC eksprese eden proteinleri verimli ve etkili bir şekilde izole etmek ve karakterize etmektir. Bu işlem, öncelikle hücre kültürü süpernatantının 0.22 mikronluk bir filtre ile berraklaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise akış sisteminin kurulması ve hücre kültürü süpernatantının protein A membran absorban üzerinden perfüzyonuna başlanmasıdır.

Ardından, insan FC eksprese eden protein, ultrafiltrasyon yoluyla konsantre edilen sonuç EIT ile membran absorbsiyondan uzaklaştırılır ve bunu diyaliz yoluyla tampon değişimi izler. Son adımlar, konsantre proteinin kalitesini ve miktarını belirlemek için akış sitometrisi ve western blotting yöntemlerini kullanmaktır. Nihayetinde, protein A membran absorbsörleri ve optimize edilmiş bir iş akışı, protein A arole hızla paketlenmiş kolonlar içeren geleneksel afinite kromatografisine kıyasla işlem süresinde bir azalma ve protein veriminde potansiyel bir artış göstermektedir.

Bu tekniğin, kolon afinite kromatografisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, membran absorbsiyonunun daha kısa işlem süresiyle potansiyel olarak daha yüksek protein verimi sağlamasıdır. Uygun karakterizasyon yöntemlerinin seçimi de işlem süresini kısaltabilir. Üretici talimatlarını takip ederek membran absorbsiyonunu hazırlayın; bu sırada geçirilen tüm solüsyonların oda sıcaklığında olduğundan ve 0,22 mikronluk bir filtreden önceden süzüldüğünden emin olun. Başlamak için, 10 mililitrelik bir şırıngayı 0,22 mikron filtrelenmiş KO's fosfat tamponlu salin veya DPBS ile doldurun ve tüm hava kabarcıklarını dışarı atın.

Havanın membran absorbere asla girmediğinden emin olmak için, saklama çözeltisini uzaklaştırmak ve membran absorberi kullanımdan hemen önce dengelemek amacıyla DPBS perfüze edin. Protein A membran absorberini yüklemek için, hücre kültürü süpernatanını membran absorberden geçirmeden hemen önce vakum destekli 0,22 mikronluk steril bir filtrasyon ünitesi kullanarak filtreleyin; hücre kültürü süpernatanını luer lock bir şırıngaya aspire edin ve malzemeleri ve ekipmanları birleştirmek için tüm hava kabarcıklarını tahliye edin. İlk olarak, şırıngayı membran absorberin girişine bağlayın.

İsteğe bağlı olarak, membran absorbür çıkışına esnek tüp takın. Şırınga ile membran absorbür arasına 0,22 mikronluk bir şırınga filtresi yerleştirin. Absorbürden geçen sıvıyı toplamak için bir erlen veya şişe kullanın.

Şırınga pompasını istenen hacimsel akış hızına ayarlayın, ancak üreticinin önerdiği akış hızını aşmayın. Hücre kültürü süpernatanını membran absorbsiyondan geçirerek akış ile toplayın. Gerektiğinde şırıngayı süpernatan ile yeniden doldurun.

İsteğe bağlı olarak, laboratuvar tercihine göre akış sitometrisi, western blotting veya ELISA kullanarak akış sıvısında protein varlığını test edin; proteini membran adsorberden elüe etmek için akış sıvısını yeniden geçirmek genellikle gerekli değildir. İlk olarak, bağlanmamış proteinleri uzaklaştırmak için membran adsorberi 10 mL DPBS ile yıkayın. Proteini, istenen akış hızında membran adsorberden elüe edin.

10 ila 15 mililitre elüsyon tamponu kullanın. EIT'yi, elüsyon hacminin %10'u oranında nötralize edici tampon içeren bir tüpe toplayın. Proteini elüe ettikten sonra, membran absorbsörü üreticinin talimatlarına göre yeniden yapılandırın.

Membran absorbsiyoncuyu, dört santigrat derecede uzun süreli saklama için %20 etanol içeren DPBS ile doldurun. Tüm EIT'yi 10 kilodalton moleküler ağırlık kesimli bir santrifüj filtre ünitesine aktarın.

Santrifüj diyalizi için üretici talimatlarını izleyin. Retentatı, seçilen tampona karşı 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme sınırına sahip küçük hacimli bir diyaliz ünitesinde diyalize edin; diyalize edilen materyale tampon eklenmesi gerekebilir.

Protein çökelmesi bir sorun teşkil ediyorsa, saflaştırılmış proteini ve FC standartlarını, tercihinize göre indirgeyici veya indirgeyici olmayan koşullar altında seçilen jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrıştırın. Çalışma süresini minimize etmek için mini jel yerine mini gel kullanın; saflaştırılmış protein bant sinyallerinin, FC standartlarının lineer sinyal aralığında olduğundan emin olmak için DPBS ile seyreltilmiş örnekler de dahil olmak üzere saflaştırılmış proteinin farklı miktarlarda örneklerini yükleyin. Jel üzerindeki ayrıştırmanın ardından, görüntü analizi aşamasında, üretici talimatlarını takip ederek yarı kuru bir blot cihazı yardımıyla kesikli bir tampon sistemi kullanarak proteinleri jelden bir polivinil florür membrana aktarın; aktarım süresi tipik olarak 5 ila 10 dakikadır.

Transfer verimliliğini doğrulamak için transfer işleminden sonra jeli Coomassie ile boyayın. Vakum destekli bir protein tespit sistemi kullanarak, alkalin fosfataz veya yaban turpu peroksidazla konjuge edilmiş anti-FC veya anti-IgG ile immünoblotlama yapın. İmmünoblotlama süresi tipik olarak bir saatten azdır.

Seçilen substrat ve yöntemi kullanarak immünoblota geliştirme yapın. Saflaştırılmış proteini görüntü analizi ile nicelendirin. FC standartlarından elde edilen bant sinyalleri üzerinde doğrusal regresyon gerçekleştirin.

R kare 0,90'dan büyükse, protein miktarını bant sinyalinden hesaplamak için, gerekliyse örnek seyreltmesini de hesaba katarak doğruyla ilgili denklemi kullanın. Protein nicelendirmesi fc bazında gerçekleştirildiğinden, protein ve fc arasındaki moleküler ağırlık farkları için değeri ayarlayın. R kare 0,90'dan küçükse, hızlandırılmış western blotting prosedürünü tekrarlayın.

Son olarak, proteini fonksiyonel assay'ler kullanarak veya akış sitometrisi yoluyla FC'yi tespit eden yöntemlerle valide edin. Başlangıç hücre kültürü süpernatantındaki fonksiyonel GAL one HFC varlığını test etmek için Western blotting veya EISA akış sitometrisi kullanılmıştır; mavi histogram ile gösterilen bu sonuçlarda, burada kırmızı ile gösterilen taze hücre kültürü ortamı negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Bu histogramın üzerinde yeşil ile gösterilen akış (flow through), membran absorbanın GAL one HFC'yi verimli bir şekilde yakaladığını ve tuttuğunu göstermektedir. GAL one HFC, amin bazlı asidik bir tampon kullanılarak dakika başına 1 mL hızla, 1 mL'lik artışlarla membran absorbandan elüe edilmiştir ve nötralize edilen elüsyon fraksiyonları daha sonra akış sitometrisi kullanılarak fonksiyonel GG one HFC varlığı açısından test edilmiştir. GL one HFC sinyali, negatif kontrole yaklaşık olarak eşit olan elüsyon 1'den başlayarak EEU 3'te maksimuma çıkmış ve ardından elüsyon 9 ve 10'da neredeyse sabit bir seviyeye düşmüştür.

Bazı adsorber tutulumları nedeniyle final EEU 10, negatif kontrol sinyali ile eşdeğerliğe ulaşmadı; bu nedenle saflaştırılmış GL one HFC'nin miktar tayini ve karakterizasyonu, yarı kuru transfer ve vakum destekli immün blotlama ile hızlandırılmış bir western blotting prosedürü ile gerçekleştirildi. GA one HFC sinyali, HFC miktar tayini standartları ile karşılaştırılarak saflaştırılmış materyalin hem miktarı hem de kalitesi belirlendi.

GAL one HFC ve degrade edilmiş GAL one HFC sinyalleri standartlar aralığındaydı. HFC standart bantlarının sinyal yoğunlukları, mevcut HFC miktarı ile doğrusal olarak ilişkiliydi. Purifiye edilmiş GAL one HFC konsantrasyonu, HFC baz alınarak görüntü işleme yoluyla 450 micrograms per milliliter olarak belirlendi.

G1HFC'nin moleküler ağırlığına göre ayarlama yapılmıştır. Saflaştırılmış materyalin konsantrasyonu 720 µg/mL idi. Buna karşılık, burada gösterilen western blotun altıncı ve yedinci kuyucuklarına çok fazla saflaştırılmış GAL1HFC yüklenmiş olup, bu durum HFC standart aralığını doyuran veya aşan sinyaller oluşturmuş ve böylece kantifikasyonu engellemiştir.

Western blotting yöntemine alternatif olarak kumasi gel boyama, hızlı bir kalite kontrol kontrolü ve/veya kantifikasyon yöntemi olarak kullanılabilir. Degrade olmuş GAL one HFC örneğinde, yaklaşık 25 kilodalton ve 40 kilodaltondaki bantlara ek olarak yaklaşık 10 kilodaltonda bir bant olduğu kaydedilmiştir. Bu bant, western blotlarda kullanılan tespit antikoru ile reaktif olmayan degrade GAL one HFC'dir.

Bu videoyu izledikten sonra, membran absorbsiyonerleri kullanarak kimera insan FC eksprese eden proteinlerin nasıl izole edileceği ve bu proteinlerin en az dört saat içinde nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.