Name: Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Öğrenin hücre göç ve invazyon analizleri yöntemlerini, yara kapanış ve transwell testleri kullanarak. Bu teknikler kanser biyolojisi ve immünoloji araştırmalarında hücre hareketliliğini incelemek için erişilebilir yöntemler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, video prodüksiyonunda yardım sağladıkları için ECU Multimedya ve Teknoloji Hizmetleri'nden Mike Myles, Sam Saunders ve C.W. Elton'a teşekkür eder. Kuzey Carolina Biyoteknoloji Merkezi, Kansere Karşı Golfçüler, Brody Brothers Bağış Fonu, Amerikan Kalp Derneği ve ECU/Vidant Kanser Araştırma ve Eğitim Fonu'ndan (LVY ve MJR) hibe desteğini kabul ediyoruz.

1.. Hücre Kültürü Deneyi yara kapatma <ol><li> Tripsin-EDTA solüsyonu% 0.25 ile doku kültürü hücreleri plakadan ayırın. Santrifüj ile bir 15 ml konik tüp içinde Pelet hücreleri, süpernatant aspire ve kültür ortamı hücreleri yeniden askıya. 24 saat içinde% 100 birleştiği için bir 6-çukurlu plaka içindeki hücrelerin uygun plaka. Not: Testler (örneğin, 1 x 10 6 B16F10 melanom hücrelerinin bir kuyuda tohumlanır nedeniyle hücre tipi ile de kullanılan ölçülerine% 100 izdiham elde etmek için zaman ve hücrelerin sayısını belirlemek için gerekli olabilir 6-çukurlu plaka önce yara kuşağa 24 saat). Seçenek olarak ise, 12-iyi veya 24 oyuklu plakalar kullanılabilir. Not: Varsa, hücreler yara ön-döküm yapan bir tedavi doku kültürü plaka üzerinde bir Kültür-Insert (Ibidi LLC) içine numaralı seribaşı olabilir. A Kültür-takın pipet tarafından zararlardan doku kültürü plaka yüzeyini koruyabilirsiniz. Bir Kültür-Ekle omit adım kullanılırsa1.2. </li><li> Steril bir ortamda (genellikle bir biyogüvenlik kaput) doku kültürü plakasının üst karşı sıkıca basın 200 ul pipet kullanın ve hızla hücre tek tabaka aşağı dikey bir yara olun. Farklı büyüklükte pipet istendiği yara boyut yapmak için kullanılabilmektedir. Bu yüzeye zarar verebilir gibi pipet ile doku kültürü plakası karşı aşırı güç kullanmayın. Yara ön döküm ise bu adım, ihmal edilebilir. </li><li> Dikkatli medya ve hücre artıkları aspire. Yavaş yavaş kuyunun alt kapağı ve ilave ayırma hücreleri önlemek için de duvara kadar bir kültür ortamı eklenir. Yaranın üretimi ve kontrol eden bir ilk görüntü alınmalıdır. Uygun sıcaklık ve CO2 konsantrasyonunda ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde doku kültürü plakayı (tipik olarak 37 ° C ve% 5 CO2). </li><li> Bir kaç zaman noktasında, her 3 saatte bir, örneğin incubat ikinci plakayı kaldırınya da bir anlık resim çekmek için ve yara kapanması kontrol etmek için ters bir mikroskop altında yerleştirin. Zaman atlamalı mikroskopi varsa, her zaman bir sıcaklık süresi ve CO 2 kontrol odası için Fotoğrafa (genellikle her 5 dakika ile başlayarak) dakika her X numarası almak. Hücre tipine bağlı olarak, yara kapanma süresi değişebilir. </li><li> Anlık resimlerin sonuçlarını analiz etmek, bir ölçek çubuğunu kullanarak diğer yaranın bir tarafındaki mesafeyi ölçün. Bir dağılım grafiği veya çubuk grafiği, örneğin Şekil 1 kullanarak analiz eder ve zamanla açık bir şekilde mevcut yara kapama. </li><li> Time-lapse fotoğrafları analiz etmek, bir video yapmak (http://rsb.info.nih.gov/ij/ serbestçe kullanılabilir) ImageJ yazılımı içine resim almak. Bu açık ImageJ yapmak için, İçe Aktar&#39;ı tıklatın ve Görüntü Sırası. Resimlerle dosyasını bulun; dosyasındaki ilk fotoğrafı tıklayın. , Dosya seçerek video kaydetmek gibi kaydedin, ve AVI. Tek göç hücreleri chara kadar görülebiliryönlü hareket cterize. Ayrıca, bu tür lamellipodia oluşumu ve arka kenar olarak geri çekilmesi morfolojik özellikleri (Şekil 2 ve ek video) de incelenebilir. </li></ol> 2.. Transwell Hücre Göç ve Invasion Testi <ol><li> Steril bir ortamda (tipik olarak bir biyo-güvenlik kapağı), bir enzimatik olmayan hücre ayrışma tamponunu ya da% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi, topak santrifüj ile hücreler kullanılarak doku kültürü hücreleri plakadan ayırmak ve mevcut medya pelet hücreleri bırakarak aspire. % 0.1 BSA (sığır serum albümini) içeren serumsuz hücre kültür ortamı içinde yeniden askıya hücreleri. Not: Tripsin-EDTA nedeniyle hücre yüzeyi 17 üzerinde çeşitli reseptörlerinin bölünme hücre göçü ve invazyonu etkileyebilir% 0.25 araştırılmaktadır hücre hattı ile ilgili olarak. Not: ml başına hücre sayısı hücrelerin büyüklüğüne bağlıdır. Ileri testler pro tohumlama yoğunluğu bulmak için gerekli olabiliriyi sonuçları vardır: Command. 24 oyuklu eklemek Transwell kullanırken tipik olarak 1 x 10 6 hücre / ml &#39;çoğu hücre tipi için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Bir Transwell insert boyutları aralığı ve katma hücre sayısı için buna uygun olarak ayarlanmalıdır bulunmaktadır. </li><li> Levha 100, transwell prospektüste filtre zarı üzerine hücre çözeltisinin ul ve 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca inkübe ve% 5 CO2, hücreler yerleşmek için izin vermek. Not: Kullanılan transwell Zarın gözenek boyutu, belirli bir numunedeki hücrelerin kendi boyutuna bağlıdır. Hücreler, çok küçük, örneğin, bunlar göç kolaylaştırmak için gerek kalmadan gözeneklerden geçebilir ya da çok büyük olduğunda bunlar gözeneklerden uymayabilir. Birkaç transwell 3 ila mikron arasında gözenek boyutları ile uçlar, 5 um, ve hücre göçü deneyleri için 8 mikron vardır. Transwell uçlar örneğin Corning gibi firmalardan ticari olarak temin edilebilir. Not: transwell migration deneyi kolaylıkla hücre istilası tahlili gerçekleştirmek için modifiye edilebilir. Bunu yapmak transwell membran üstüne dışı matris (ECM) malzemeleri ekleyin ve sonra ECM üstüne hücre eklemek için. Örneğin, Matrigel çözülmüş ve buz üzerinde sıvılaştırılmış ve Matrigel 30-50 ul eklemek transwell 24 oyuğa ilave edilir ve bir ince jel tabakası oluşturmak için 15-30 dakika için bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde katılaştırılır. Hücre çözeltisi hücre-dışı matris boyunca işgal taklit etmek için Matrigel kaplamanın üzerine ilave edilir. Not: transwell hücre göçü ve transwell hücre işgali tahliller arasında belirgin farklılıklar vardır. Hücre göçü, transwell tahlil, bir kemo-cezbedici doğru hücrelerin kemotaktik yeteneğini ölçer. Transwell hücre istilası deneyi Ancak, hücre dışı matris boyunca genel olarak kanser metastazı veya embriyonik gelişim bulunan bir işlem hücre kemotaksisi ve hücre işgalini iki ölçer. </li><li> Bir pipet kullanarak, çok carefully, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, alt haznesinin alt kısmına istenen kemo-cezbedici 600 ul ekleyin. Transwell yuvasını taşımadan kemo-cezbedici ekleyin ve kabarcıkları oluşmasını önlemek. Alt kuyudaki kemo-çekici sıvı kemotaktik bir gradyan meydana getirmek üzere, üst oyuğundaki membran ile temas emin olun. İnkübasyon süresi, hücre tipine ve kullanılan kemo-cezbedici bağlıdır. Not: Diğer testler kuluçka dönemi belirlemek için gerekli olabilir. Not: yapışık hücreler için, göç eden hücreler zar 1,8 diğer tarafına eklenecektir. Göç eden hücrelerin miktar adımları 2.4 (2,4-2,8 steril bir ortamda yapılması gerekmez adım) 2.8 için aşağıdakilerden yapılabilir. Yapışkan olmayan hücreler için, göç eden hücreler alt bölmede ise ortamı içine düşecektir. Göç eden hücre sayısı hemasitometre kullanılarak sayıldı ve 5 akış sitometresi edilebilir. </li><li> Plakadan transwell yuvasını çıkarın. Gerektiği gibi dikkatli bir şekilde zarar vermeden, zarın üstünden geçirilir olan medya ve kalan hücrelerin çıkarılması için birçok kez bir pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. </li><li> Bir 24-yuvalı plaka içinde bir kuyuya% 70 etanol 600-1,000 ul ekleyin. Hücre sabitleşmesi için 10 dakika boyunca% 70 etanol içinde transwell koyunuz. 24-iyi plaka transwell parçayı çıkarın ve zarın üstünden kalan etanolü çıkarmak için bir pamuk uçlu bir uygulama aleti kullanmak. Transwell membran (genelde 10-15 dakika) kurumasını bekleyin. </li><li> Bir 24-yuvalı plaka içinde bir kuyuya% 0.2 kristal violet 600-1,000 ul eklenir ve boyama için zar içine yerleştirin. 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Yavaşça bir pipet ucu ya da pamuklu çubuk ile zarın üstünden kristal mor çıkarın. Gerektiğinde çok dikkatli bir şekilde, sabit bir hücrelerini yıkama önlemek için fazla kristal Viole kaldırmak için pek çok kez damıtılmış su içine daldırma zart. Transwell membran kurumasını bekleyin. </li><li> Görüntüle, ters döndürülmüş bir mikroskop altında ve kemo-cezbedici doğru zardan geçirilir ve zarın alt (Şekil 3) üzerine takılı olan hücrelerin ortalama bir miktar elde etmek için farklı görüş alanları hücrelerin sayısı. </li></ol>

<ol><li>Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tumor+cell+migration+and+metastasis+by+the+proton-sensing+GPR4+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor.</a> Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).</li>
<li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Peter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+to+apoptotic+%26%2334%3Bfind-me%26%2334%3B+signals+is+mediated+via+the+phagocyte+receptor+G2A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Migration to apoptotic &#34;find-me&#34; signals is mediated via the phagocyte receptor G2A.</a> J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).</li>
<li>Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+through+the+G2A+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).</li>
<li>Buul, J. D., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+in+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling in leukocyte transendothelial migration.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).</li>
<li>Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+promoters+and+polyadenylation+regulate+tissue-specific+expression+of+Hemogen+isoforms+during+hematopoiesis+and+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis.</a> 228 (4), 606-616 (2003).</li>
<li>Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi-independent+macrophage+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+via+the+immunoregulatory+GPCR+G2A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A.</a> Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).</li>
<li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).</li>
<li>Albini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+and+endothelial+cell+invasion+of+basement+membranes.+The+matrigel+chemoinvasion+assay+as+a+tool+for+dissecting+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms.</a> Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+determinants+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical determinants of metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).</li>
<li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+3D+morphology+and+functions+on+genetically+engineered+mouse+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%22%5BJournal%5D)">Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells.</a> Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).</li>
<li>Junger, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+regulation+of+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).</li>
<li>Lazennec, G., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+new+insights+into+cancer-related+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation.</a> Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17, (2010).</li>
<li>Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-mediated+proteolysis+of+paxillin+negatively+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration.</a> J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).</li>
<li>Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+microtubules+and+focal+adhesion+dynamics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Hücre göçü kanser araştırmalarında incelemek için önemli bir yönüdür ve aynı zamanda, gelişim ve yara iyileşmesi immünolojik çalışmalar uygulanabilir. Hücre kültürü kapatma deneyi yara ve transwell hücre göçü ve işgali deneyleri hücre göç davranışları ayrıntılı bilgilerin açığa çıkarılması ve hücre göçü 1,2,10,14 moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir. Çalışmamız B16F10 melanom hücre çizgisinin hareket hızı ve invazyon yeteneklerini belirlemek için aşağıdaki hücre hareketi deneyleri kullanılır...

Motilite canlı hücre bir temel özelliğidir. Hücre göçü ömrü, embriyonik gelişmesi, bağışıklık tepkisi ve kanser metastaz ve enflamasyon 1-9 gibi birçok patolojik süreçlerin kavramında yer almaktadır. Bu nedenle, hücre göç davranışlarını incelemek için yöntemler biyomedikal bilimler, biyoloji, biyomühendislik ve ilgili alanlarda disiplinler geniş bir yelpazede için çok yararlı bir araştırma araçlardır. Kanser hastalarında başlıca ölüm nedenidir metastatik ilerlemesi ile ilgili olarak kanser araştırmalarında hücre göçünün çalışma özel önem taşımaktadır. Vücuda yayılmış ve yaymak için kanser için, kanser hücreleri göç olmalı ve intravasate kan dolaşımı içine, hücre dışı matriks (ECM) ile işgal, uzak bir siteye eklemek, ve nihayet uzak odaklar 1,10-12 oluşturmak için damar dışına. Çeşitli biyolojik yöntemler ayrıntılı olarak bu olayları incelemek için kullanılabilir. Hücre kültürü yara kapanması bird transwell göç ve istila deneyleri geniş bilimsel topluluğun 1,10 kullanılır. Bu testler belirli bir hücre tipi kendiliğinden göç ya da kemo-cezbedici cevap ve yönlendirilerek ona doğru nasıl göç iyi bir anlayış için izin verebilir gerekli verileri sağlayabilir. Çeşitli göç fenotipleri tarif edilmiştir. Hücreler, mezenşimal veya amoeboid benzeri hareket bölgesi veya 13 geçiş akış toplu ya da çok-etiketli hücre hareketi ile görüldüğü gibi, tek bir hücre şeklinde aktarılabilir. Hareketli hücrelerinde kullanılan hareket ait yöntem hali hazırda hücre kültürü yara kapatma tahlili kullanılarak gözlemlenebilir. Hücre göçü çalışma için çok çeşitli yollar arasında, hücre yara kapatma deneyi basit biridir. Bu yöntem, tüm hücre kütlelerinin göç yeteneğini belirlemek için yararlıdır. Bir adım daha ileri alındığı zaman göç 14 sırasında bireysel hücrenin morfolojik özellikleri gözlemlemek için kullanılabilir. Yara kapanmasının analizi takiben birçok fenotipleri ortaya olabilir. Bir kontrol karşılaştırırken zamanla kapalı mesafeyi ölçen spesifik migrasyon değişiklik ya da önceden bilinmeyen bir engelli göçmen fenotip ortaya çıkarabilir. Ayrıca, tek bir hücre lamellipodium oluşumu, kuyruk geri çekme ve yönlü hareket ilgi 14 hücrelerinde bozulmuş veya gelişmiş olabilir ne için ipuçları verebilir. Transwell göç ve istila deneyleri yönde bu kemokinler, büyüme faktörleri, yağlar, ya da nükleotid 4,5,8,15,16 olup çeşitli kemo-cezbedici yanıt tek hücrelerinin yeteneği analiz etmek için kullanılabilmektedir. Ayrıca nedeniyle reseptörünün 1,14 aşırı ifade diferansiyel göçmen yeterliliğini değerlendirmek olabilir. Bu deneyler, aynı zamanda, küçük bir GTPases 2&#39;nin Rho aile olarak hücre göçü anahtar regülatörleri belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Acces kolayca bu kısa ve ardındanmak testleri, hücre göçünün modu ve bir 3-D matrisine işgal etmek için bir hücrenin yeteneği de belirlenebilir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s modifiye Eagle ortamı (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>İkizler</td><td>100106</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA% 0.25</td> <td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Kristal viyole</td><td>Sigma</td><td>C0775-100G</td><td>%0,2'de suda çözülür</td></tr> <tr><td>Hücre ayrışma tamponu</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3145</td></tr><tr><td>SterilGARD biyogüvenlik başlığı</td><td>The Baker Company, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Model # VBM-600</td></tr><tr><td>EVOS Fl ters mikroskop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # AMF-4302-US</td></tr><tr><td>Doku kültürü plakası</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td>Katalog numarası, kültür plakasının tipine bağlı olarak değişir</td></tr><tr><td>Corning Transwell kesici uç</td><td>Fisher</td><td>07-200-150</td><td>Katalog numarası, zarın gözenek boyutuna bağlı olarak değişir</td></tr></tbody></table>

vitro hücre göç ve invasion tahliller

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Göç, canlı hücrelerin önemli bir özelliğidir ve normal gelişim, bağışıklık tepkisi ve kanser metastazı ve iltihaplanma gibi hastalık süreçleri için kritik öneme sahiptir. Hücre göçünü inceleme yöntemleri, kanser biyolojisi, immünoloji, vasküler biyoloji, hücre biyolojisi ve gelişim biyolojisi gibi çok çeşitli biyomedikal araştırmalar için çok yararlı ve önemlidir. Burada örnek olarak tümör hücresi göçü ve istilasını kullanıyoruz ve bu süreçleri ölçmek için yaygın olarak kullanılan, kolay erişilebilir yöntemleri göstermek için ilgili iki testi açıklıyoruz. İlk yöntem, birleşik bir hücre tek tabakası üzerinde bir çiziğin oluşturulduğu hücre kültürü yara kapatma testidir. Yara kapanma ve hücre göçünün hızı, birkaç zaman aralığında düzenli bir ters mikroskopla anlık görüntü resimleri çekilerek ölçülebilir. Hızlandırılmış mikroskopi sistemi kullanılarak daha ayrıntılı hücre göç davranışı belgelenebilir. Bu yazıda açıklanan ikinci yöntem, hücre motilitesinin ve invazivliğinin kemo-çekici bir gradyana doğru kapasitesini ölçen transwell hücre göçü ve invazyon testidir. Amacımız, bu yöntemleri son derece erişilebilir bir şekilde tanımlamaktır, böylece prosedürler sadece temel hücre biyolojisi kurulumuyla bile araştırma laboratuvarlarında başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilir.

Burada sunulan deney yara kapatma ve Transwell hücre göçü deneyi, bir model sistem olarak fare B16F10 melanom hücreleri kullanılarak yapıldı. Yara kapatma tahlilde, B16F10 hücrelerinin bir 6-yuvalı doku kültürü plakasında tohumlandı ve 24 saat içinde% 100 konflüansa büyütülür. Yaklaşık 700 mikron genişliğinde bir yara time-lapse mikroskopi kullanılarak kaydedilen bir pipet ve yara kapanmasını (hücre göçü) kullanılarak oluşturulmuştur. Alternatif olarak, yara kapama da time-lapse mikroskopi 1 mevcut değilse fa...

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Hücre göçü oldukça dinamik bir süreçtir. Normal embriyonik gelişim ve bağışıklık yanıtı gibi çeşitli fizyolojik işlevlerin yanı sıra kanser metastazı ve inflamasyon gibi hastalık süreçleri için de önem taşır.Hücre göçünün incelenmesi; kanser biyolojisi, immünoloji, hücre biyolojisi ve gelişim biyolojisi gibi geniş bir biyomedikal bilimler yelpazesi için önem taşımaktadır. Hücre göçü; uzama, yeni adezyonların oluşumu, hücre gövdesi kontraksiyonu ve son olarak kuyruk ayrılması olmak üzere mekanik olarak birbirinden ayrı dört adıma bölünebilir. Burada, hücre göçünün in vitro ortamdaki dinamik doğasını dikkatle incelemek için iki basit yöntemi açıklayacağız.İlk yöntem, hücre kültürü kapalı alan analizidir. Bu analiz yaygın olarak kullanılmaktadır ve en temel laboratuvar düzenine sahip laboratuvarlar için bile oldukça erişilebilirdir. Hücre kültürü kapalı alan analizi, bir pipet ucu kullanılarak konfluen bir hücre monotabakası üzerinde oluşturulan çizikler aracılığıyla, konfluen hücre monotabakasının zamanla daha önce oluşturulan yarayı kapatacağı bir analizdir.Hücre göçü dinamiği, zaman ayarlı (time-lapse) fotoğrafçılık veya anlık görüntüler kullanılarak detaylı bir şekilde incelenebilir. Mesafe ölçülebilir ve zaman içinde hücrelerin hareket ettiği hız hesaplanabilir. İlgili ikinci yöntem olan transwell hücre göçü ve invazyon testi de, hücrelerin bir transwell membranına ekilmesinin ardından takip edilmesi açısından oldukça erişilebilirdir.Ayrıca yaygın olarak boyden odacığı olarak bilinir. Kemoatraktan gradyanına doğru göç etme yetenekleri ölçülebilir. Bu oldukça kolay uygulanabilir deneysel prosedürlerin her ikisi de birçok araştırma alanı için son derece değerlidir.İkinci bölüm, hücre kültürü kabini testi. Merhaba, ismim Calvin Justice. East Carolina Üniversitesi Brody Tıp Fakültesi Onkoloji Bölümü'nden Dr. Yang'ın laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim.Bugün, in vitro ortamdaki hücrelerin migrasyon ve invazyon kapasitelerini ölçen iki prosedürü göstereceğim. Şimdi hücre kültürü aşamasıyla başlayalım. Hücre kültürü aşamasında kullanılan hücreler.Analiz, geleneksel hücre kültürü teknikleri kullanılarak doku kültürü plaklarında yürütülebilir. Başlamak için hücrelerin büyütülmesinde kullanılan büyüme ortamını aspire edin, bir kez PBS ile yıkayın, ardından plağa iki mililitre 0.25%tripsin EDTA ekleyin ve plağı üç dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Plağı inkübatörden çıkarın ve %10 FES ile desteklenmiş üç mililitre DMM ekleyin.Besiyerini plakadan uzaklaştırın ve 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. 1500 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücreleri %10 FES ile desteklenmiş iki mililitre DMM içinde yeniden süspanse edin.Ardından hücreleri bir hemositometre ile sayın. Sayım tamamlandığında, 24 saat içinde konfluens olacak miktarda hücreyi plakaya ekleyin. Hücrelerin yapışması ve yayılması için plakayı 24 saat boyunca inkübatöre yerleştirin.Plakayı inkübatörden çıkarın ve plağın %100 konfluenste olduğundan emin olmak için mikroskop altında inceleyin. Ardından, biyogüvenlik kabininde, doku kültürü plağına zarar vermeden bir pipet ucu kullanarak kuyucuğun üstünden altına doğru bir yara oluşturun. Pipet ucuyla yara oluşturduktan sonra medyumu aspire edin ve iki mililitre büyüme medyumu ile nazikçe yıkayın.Bu durumda, mevcut kalıntıları temizlemek için %10 FES ile desteklenmiş DMEM kullanın ve ardından medyumu tekrar aspire edin. Son olarak, iki mililitre büyüme medyumu ekleyin ve eğer mevcutsa, plakayı mikroskobun altındaki sıcaklık ve CO2 kontrollü hazneye yerleştirin. Sistemde zaman ayarlı (time-lapse) fotoğraf çekim özelliği bulunmaktadır.Zaman atlamalı çekim özelliği mevcut değildir. İşaretleme konumunun ve kuyucuğun başlangıç fotoğrafını çekin ve plakayı inkübatöre yerleştirin. Zaman atlamalı fotoğraf çekimi mevcutsa, mikroskobun zaman atlamalı çekim özelliklerini ayarlayın.Time-lapse süresini 16 saate ayarlayacağız. 16 saat boyunca her beş dakikada bir fotoğraf çekildikten sonra, plaka odadan çıkarılabilir ve deney süresince edinilen fotoğraflar bir flash belleğe kaydedilebilir. USB'yi bilgisayara takın ve Image J programını açın.Dosyaya tıklayın. Bir görüntü dizisi içe aktarın. Deney sırasında çekilen görüntüleri bulun.İlk dosyaya tıklayın ve aç'a tıklayın. Ardından dizi seçenekleri görünecektir. Fotoğraflar listenizdeki ilk resmi seçin ve video için ihtiyaç duyacağınız artış miktarlarını girin.Şimdi AVI okuyucu seçeneklerini göreceksiniz. Deneyinize en uygun olanı seçin ve tıklayın. Tamam. Image J programı şimdi bir video oluşturacaktır; videoyu kaydetmek için dosya (file) sekmesine tıklayın, AVI olarak veya deneyinize uygun olabilecek diğer seçeneklerden biriyle kaydedin.Ardından video, ilgi çekici olabilecek migrasyon özellikleri açısından hücre çalışmasında analiz edilebilir. İncelenebilecek olası özellikler arasında lamellipodiyal uzama, hücre gövdesi kontraksiyonu ve kuyruk ayrılması yer alabilir. Time-lapse fotoğrafçılığın olmadığı durumlarda, ilk çekimin ardından 12 ila 16 saat boyunca inkübatöre yerleştirilen plaka çıkarılabilir.Başlangıçta fotoğrafı çekilen alan yeniden fotoğraflanmalı ve sonraki ölçümler için bir ölçek çubuğu eklenmelidir. İlk fotoğrafta oluşan yaranın başlangıç genişliği ölçüldükten sonra, piksel cinsinden ölçülen genişlik ölçek çubuğu kullanılarak mikrometreye dönüştürülmelidir. Ardından, final fotoğraflarındaki yara genişliği aynı alanda yine piksel cinsinden ölçülmeli ve tekrar ölçek çubuğu kullanılarak mikrometreye dönüştürülmelidir.Son adım, yaranın ayrılan süre içinde kapandığı toplam genişliği elde etmek için son genişliğin başlangıç genişliğinden çıkarılmasıdır. Ölçülen nihai göç mesafesi, kapatma hızını ve saat başına mikrometre cinsinden değeri bulmak için ayrılan süreye bölünmelidir. Hücre göçünün daha kantitatif bir analizi için anlık görüntü yöntemi, farklı boyutlardaki çok sayıda kuyucukta tekrarlanabilir; bkz. Bölüm üç, TransWell Hücre Göçü ve İnvazyon Analizi.Başlamak için, öncelikle prosedür için ilgili hücreleri bir doku kültürü plakasında büyütmelisiniz. Ardından, PBS ile bir kez yıkayın ve ilgili hücreleri hücre ayrıştırma tamponu veya tripsin ile doku kültürü plakasından ayırın. Ayrıca, tripsin kullanımının sonuçlarınızı etkileyebileceği nedeniyle, tripsinin çalıştığınız hücreleri nasıl etkileyebileceğine dair literatürü okumanızı öneririz.1500 RPM'de beş dakika boyunca gerçekleştirilen ayırma santrifüjlemesinin ardından, mevcut medyumu çıkarıp aspire edin, ardından hücreleri %0,1 BSA içerisinde yeniden süspanse edin. Transwell insert paketini açın ve inserti kendi boyutuna uygun olarak tasarlanmış kuyucuğun içine yerleştirin. Eğer önce Transwell invazyon testi yapıyorsanız, bir sonraki adıma geçmeden önce insertin üst kısmına matrigel ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübe edin.Transwell membranının üzerine 100 µL hücre çözeltisi ekleyin. Hücrelerin çökmesine izin vermek için 10 dakika boyunca inkübe edin. Ekilen hücre sayısı hücre tipine bağlıdır ve sonraki deneyler gerekli olabilir.Bu sayıyı belirlemek için, bir pipet kullanarak istenilen kemoatraktanı insertin altına, kuyucuğun tabanına dikkatlice ekleyin. Inserti yerinden çıkarmamaya çalışın. İnkübasyon süresi hücre tipine göre değişiklik gösterir.İnkübasyon sonrası transwell insertini çıkarın ve membran üzerinden geçiş yapmamış hücreleri ve fazla medyumu membranın üst kısmından nazikçe temizlemek için bir pamuklu çubuk uygulayıcıyı gerektiği kadar kullanın. Membrana zarar vermemeye dikkat edin. Boş bir alt bölmeye 600 ila 1000 microliters %70 ethanol ekleyin.Hücrelerin fiksasyonu için, ole inserti %70 etanol içeren kuyucuğa yerleştirin ve 10 dakika inkübe edin. Membran üzerinden içeri migrate olmamış hücrelerde kalan etanolü temizlemek için, gerekince birkaç kez pamuklu aplikatör kullanın. Hücre boyama işlemi için bir kuyucuğa 600 ila 1000 µL %0,2 Kristal viyole ekleyin ve inserti içine yerleştirin.10 dakika boyunca inkübe edin. Genellikle membranın üzerindeki fazla kristal viyole boyasını uzaklaştırın. Ardından, göç eden hücrelerin yıkanıp gitmesini önlemek için çok dikkatli bir şekilde, kalan kristal viyoleyi temizlemek amacıyla membranı gerektiği kadar distile suya daldırıp çıkarın.Hücreleri mikroskop altında görüntülemek için membranın kurumasını bekleyin. Membran, bistüri ile dikkatlice çıkarılıp bir lam üzerine yerleştirilebilir veya hücreler insertler hala kuyucukların içindeyken görüntülenebilir. Bir ters mikroskop kullanarak, birkaç farklı görüş alanının fotoğrafı çekilmelidir.Göç eden hücre sayısının iyi bir temsilini elde etmek için, hücre sayısı Adobe Photoshop sayım aracı kullanılarak sayılabilir. Birikdirilen veriler, sonuçlarınızın en iyi şekilde temsil edilmesi için bir sütun grafiğine aktarılabilir. Bölüm dört, temsili sonuçlar.Ardından, hücre kültürü kapatma deneyi ve transwell hücre migrasyon deneyi ile elde edilen bazı temsili sonuçları inceleyeceğiz. Bu videoda açıklanan, hücre hareketliliğini incelemeye yönelik iki ilişkili yöntemden hücre kültürü kapatma deneyi ile başlayacağız. Burada, 0, 4, 8 ve 12. saatlerde çekilmiş anlık görüntüler sunulmaktadır.Görüldüğü üzere, yaranın oluşumundan sonra fotoğraflar çekilebilir ve zaman içinde yara kapanma mesafesi ölçülebilir. Verilerimizi bir dağılım grafiği kullanarak sunuyoruz ve daha önce tartışılan yöntemi kullanarak zaman içindeki yara kapanma hızını belirliyoruz. Ayrıca, time-lapse fotoğrafçılığı kullanılarak bireysel hücre göçü de detaylı bir şekilde incelenebilir.Bu vakada, yara kapanması sırasında tekil hücrelere odaklanıyor, zaman içindeki göçlerini takip ediyor ve hareketlerini gözlemliyoruz. Öncü kenar uzanımı, kuyruk retraksiyonu ve genel hareket gibi özellikler ayrıntılı olarak incelenebilir. Şimdi, transvers hücre göçü denemesinin bazı sonuçlarını gözden geçireceksiniz. Burada, transwell hücre göçü denemesini takiben membrandan alınan iki fotoğrafı gösteriyoruz.İlk resim, membran boyunca çok az hücre göçü olan veya hiç göç olmayan kemoatraktan uygulanmamış sonuçları göstermektedir. İkinci resim, membrana doğru artmış hücre göçünün olduğu kemoatraktan uygulanmış sonuçları göstermektedir. Sağda, standart hatayı temsil eden hata çubuklarına sahip bir sütun grafiği kullanarak deneyimizin nicelleştirme sonuçlarını sunuyoruz.Beşinci bölüm, sonuç olarak, hücre kültürü kapatma deneyi sonrası enine hücre göçü veya invazyon deneyinde toplanan veriler, hücrelerin 2D ortamdaki veya 3D ortamdaki göç yeteneklerini ortaya koymaktadır. Bu sonuçlar, daha önce bilinmeyen verileri potansiyel olarak açığa çıkarmak için diğer sonuçlarla karşılaştırılabilir ve ayrıca diğer biyokimyasal testlerle korelasyon gösterebilir. Yaygın olarak kullanılan bu iki ilgili test, en temel hücre biyolojisi laboratuvar kurulumları için bile değerli ve kolayca erişilebilirdir.Bugün bize katıldığınız için teşekkür eder, gelecekteki bilimsel çalışmalarınızda başarılar dileriz.

in-vitro-cell-migration-and-invasion-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Üç boyutlu hücre dışı matriks içine tümör hücresi invazyonu modelleri daha iyi...

Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

Bu video makalesinde, kanser hücresi istilasını yönlendirmede hormonların, sitokinlerin ve/veya büyüme faktörlerinin rolünü incelemek için modifiye edilmiş bir in vitro yöntem açıklanmaktadır.

Bir Modifiye<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Deneyi Hormonlar, Açan Kanser Hücre Invasion Sitokinlerin ve / veya Büyüme Faktörleri Potansiyel Rolü belirlemek için

Bu çalışmada cep işgali ve geçiş analizi için iki farklı yöntem raporları: Boyden odası tahlil ve vitro video mikroskobu tabanlı yara iyileşmesi tahlil. Bu iki deney protokollerde açıklanmış ve kendi yararları ve dezavantajları karşılaştırılır.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Burada, peptidler etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntemi Nicel veri hücre göç ve yara kapatma hızı üzerinde hızlı ve son derece tekrarlanabilir elde olanak sağlar.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

Burada, kantitatif geçiş ve zamanla ve birden fazla tedavi koşullar altında işgal glioblastoma Beyin tümör kök hücrelerin ölçmek için canlı hücre görüntüleme teknikleri açıklar.

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Burada, üç tüp bebek deneyleri kullanarak insan Trofoblast hücreleri hücre hareketinde değerlendirmek için son derece erişilebilir bir iletişim kuralı mevcut: sıfırdan tahlil, transwell istila tahlil ve Hücre proliferasyonu tahlil.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Geçerli protokol kanser hücre göç ve gerçek zamanlı olarak tek bir platformda işgali araştırma, kolayca tekrarlanabilir ve zamanı verimli bir seçenek hücre hareketlilik ve morfoloji çalışmaya sağlayan entegre bir yöntemini açıklar.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

İn vitro hücre invazyonu assay, protein matrisini içeren hücre kültürü eklemlerini kullanarak invazyon ve göç için hücresel potansiyelin ölçülmesi ile kanser metastifinin potansiyelini ölçmek için kullanılır. Hücreler protein matrisinde ve gözenekli membrandan, bir kemoçekiciye doğru göç etmek ve sonra ışık mikroskobu ile ölçülebilir.

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

Birçok yukarı regüle edilmiş gen, tümör hücresi göçünü ve invazyonunu uyararak kötü prognoza yol açar. Hangi genlerin tümör hücresi göçünü ve invazyonunu düzenlediğini belirlemek çok önemlidir. Bu protokol, bir genin artan ekspresyonunun tümör hücrelerinin göçü ve invazyonu üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı olarak araştırmak için bir yöntem sunar.

Sentetik mRNA Transfeksiyonunu Takiben Tümör Hücresi Migrasyonu ve İnvazyonunun Gerçek Zamanlı Kantitatif Ölçümü

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Öğrenin hücre göç ve invazyon analizleri yöntemlerini, yara kapanış ve transwell testleri kullanarak. Bu teknikler kanser biyolojisi ve immünoloji araştırmalarında hücre hareketliliğini incelemek için erişilebilir yöntemler sunar.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Daha fazla video keşfet