Farelerde Egzersiz Kapasitesi ve Kardiyak Uyum Kimyasal kaynaklı Yumurtalık Yetmezliği Etkisi Eğitim için Bir Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, yumurtalıklardaki foliküler atrezi sürecini hızlandırarak yumurtalık yetmezliği, östrojen tükenmesi ve döngüsel aktivitenin sona ermesiyle sonuçlanan ve menopoz durumunu yakından taklit eden bir tablo oluşturmaktır. Bu, öncelikle, küçük primer ve primordial yumurtalık foliküllerini doğal atrezi süreçlerini hızlandırarak spesifik olarak hedeflediği ve yok ettiği kanıtlanmış olan vinil siklopropan dioksit veya VCD kimyasalının 15 ila 20 gün boyunca ardışık olarak uygulanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise VCD enjeksiyonlarının başlangıcından yaklaşık altı hafta sonra vajinal sitoloji ile östrus döngüsünün ve yumurtalık döngüselliğinin belirlenmesidir.

Siklus kaybını ve yumurtalık yetmezliğini doğrulamak için vajinal sitoloji ile 15 ila 20 günlük sürekli dste veya siklus dışı durum gözlemlenmelidir. Son adım, gönüllü kafes tekerleği egzersizi ve kardiyak adaptasyon gibi menopozdan veya menopoza geçişten etkilenebilecek bir müdahalenin uygulanmasıdır. Nihayetinde, gönüllü kafes tekerleği aktivitesi ve kardiyak adaptasyon, menopozun kafes tekerleği aktivitesini azaltıp azaltmadığını göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin ekstomi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ekstominin östrojenin aniden tükenmesine yol açan cerrahi bir işlem olmasıdır; oysa bu durum, premenopozdan postmenopoza geçiş sırasında meydana gelen doğal ve kademeli östrojen kaybından farklıdır. Bu tekniğin etkileri, postmenopozal kadınların premenopozal kadınlara kıyasla metabolik sendroma ve kardiyovasküler hastalıklar dahil ilgili komorbiditelere özellikle daha yatkın olmaları nedeniyle, postmenopozal kadınlardaki metabolik ve kardiyovasküler hastalıkların tedavisine kadar uzanmaktadır. Vajinal sitoloji basamaklarının öğrenilmesinin zor olması, uygun yayma tekniğinin uygulanması ve EST döngüsünün tanımlanması konusunda dikkatli olunması gerektiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.

Dördüncü olarak, vinil siklin dioksit veya VCD, -20 °C'de saklanır. VCD'yi enjeksiyon protokolü için hazırlamak üzere, temiz bir dozaj vialine 0,87 mL VCD ekleyin ve son hacmi susam yağı ile 10 mL'ye tamamlayın, parafilm ile kapatın ve nazikçe ters çevirerek karıştırın. 4 °C'de yedi güne kadar saklayın.

VCD enjeksiyon protokolüne başlamak için, iki aylık iki fareyi 20 gün boyunca ardışık olarak tartın ve enjeksiyon süresi boyunca, 27 gauge iğne kullanarak, oda sıcaklığındaki VCD'yi kilogram başına 160 miligram dozunda günlük intraperitonal enjeksiyonlar şeklinde uygulayın. Benzer şekilde, lokal enfeksiyon olasılığını azaltmak için enjeksiyon bölgelerini değiştirilmeye çalışın. Enjeksiyon süresi tamamlandıktan sonra, kontrol farelerine taşıyıcı solüsyon olarak kilogram başına 2,5 mililitre hacminde susam yağı enjekte edin.

Vajinal yaymalar alarak östrus döngüsünü günlük olarak izleyin. Bu çalışmanın başarısı için kritik faktörlerden biri, sitolojik belirleme için yüksek kaliteli vajinal yaymalar elde etmektir. Fareleri sırt derisinden kavrama (dorsum scruff) yöntemiyle sabitleyin.

Vajina ağzına 0,5 santimetre derinliğe kadar 0,2 mililitre steril salin içeren bir damlalık yerleştirin. Enjekte edilen salini damlalıkla üç kez karıştırın ve ardından boş bir lam üzerine bir damla bırakın. Over yetmezliğini doğrulamak için her bir örneği standart bir ışık mikroskobu altında 100x büyütmede derhal mikroskobik olarak değerlendirin.

Ardından, VCD ile menopoza indüklenmiş fareler egzersiz deneylerinde kullanılır. Kafes çark düzeneği, çark dönüşüyle aktive olan dijital bir manyetik sayaçla donatılmış, beş santimetre genişliğinde koşma yüzeyine sahip 11,5 santimetre çapında bir çarktan oluşur. Her çark koşusu öncesinde, kafes çarkını üretici kılavuzuna göre test ederek kalibre edin.

Koşu tekerleğinin iç çapını ölçün. Çevreyi hesaplayın ve tekerleği kafese monte etmek için bu değeri dijital sayaca tekerlek boyutu olarak girin, tekerleği kaydırın. Hayvan kafesinin üst tel kısmından geçirin.

Çark standını, binder klipsler kullanarak kafes tellerine sabitleyin. Klipsler, tellerin üst kısmında, hayvandan uzak bir noktada olmalıdır. Bilgisayar kısmını ve tüm fazla kabloları kafes tellerinin arasından geçirin.

Bilgisayar ile fazla kabloyu hayvanın erişemeyeceği bir yere yerleştirin. Bu, bilgisayarı ve fazla kabloyu tutmak için kafesin kablo tesisatının üzerine orta boy plastik bir tartım kabı yerleştirilerek sağlanabilir. Ardından, dijital manyetik sayıcının bilgisayar kısmını tekerlek standına sabitleyin.

Dijital manyetik sayacın boşta kalan mıknatısını, bilgisayara giden mıknatıs kablosuyla aynı tarafta olacak şekilde merkez çubuğa koli bandı ile sabitleyin. Mıknatısı kemirme hasarına karşı korumak için yeterince bantladığınızdan emin olun. Mıknatıs, tekerleğin her dönüşünün, tekerleğin tam dönüşüne herhangi bir müdahale veya direnç olmadan bilgisayar tarafından kaydedileceği şekilde konumlandırılmalıdır.

Koşu tekerleğini tekerleğe takın. Tekerlek standı direklerini tekerleğin merkezi çubuklarındaki montaj deliklerine yerleştirerek sabitleyin. Tekerleğin serbestçe dönebildiğinden emin olun.

Düzenek, kemirme hasarı açısından günlük olarak izlenmeli ve gerektiğinde onarılmalıdır. Deney için, belirli bir batından alınan yedi aylık inbred C 57, black six ve B six C3 F1 dişi fareler rastgele egzersiz rejimine veya sedanter kontrol grubuna atanır. Deney hayvanları, 28 gün boyunca bir kafes çarkına engelsiz erişimi olan 47 x 26 x 14,5 cm'lik kafeslerde bireysel olarak barındırılır; kontrol hayvanları ise çarksız bir kafeste birlikte barındırılır.

Tüm hayvanlara su ve standart sert kemirgen yemi verin. Manuel olarak lido ekleyin; manyetik sayaç tarafından sağlanan koşulan mesafe ve toplam koşu süresi günlük değerlerini kaydedin. 28 günlük egzersiz süresi boyunca doğru ve tutarlı değerler elde etmek için mesafe ve zaman değerlerini her gün aynı bir saatlik zaman dilimi içerisinde kaydedin. Her günün kaydından sonra, ertesi gün doğru okumalar yapıldığından emin olmak için manyetik sayacı sıfırlayın.

Belirli egzersiz döneminin sonunda, ötanazi uygulanan hayvanların vücut ağırlıkları doku hasadı öncesinde kaydedilir. Kalbi çıkarmak için ventral taraftan medial bir insizyon yapın, diyaframı açın ve kalbi hızla görünür hale getirin. Kalbi tabanından kesin ve ventriküler kalıntı kanı yeterince temizlemek için soğuk fosfat tamponlu saline yerleştirin. Kalbi fazla dokulardan temizleyin, tüm kalbi tartın ve istenirse sıvı azotta şok dondurun.

Ekstraksiyone dokuları toplayın, modifiye edilmiş buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin çözeltisi ile yıkayın ve sıvı azotla soğutulmuş izopentanda şok dondurun. Bu çalışmada, ovaryen yetmezlik VCD tedavisi ile indüklenmiş ve vajinal yaymaların mikroskobik incelemesi ile doğrulanmıştır. Östrus döngüsündeki evre, epitel hücrelerinin oranıyla belirlenmiş; epitel hücreleri ve lökositler nicelendirilmiştir; PROE'lerde çekirdekli epitel hücreleri baskındır.

Burada oklar çekirdekli hücreleri göstermektedir; östrus dönemindeki hücreler ağırlıklı olarak çekirdeksiz skuamöz epitel hücreleridir. Metrüs, lökositlerin baskın olduğu karma hücre tipleriyle karakterizedir. Diöstrüs ise lökositlerin hakimiyetindedir.

Farelerde östrus döngüsü, VCD enjekte edilmeden önce tipik olarak dört gün sürer. Hayvanlar, 15 gün boyunca devam eden diastrus durumundan sonra asiklik olarak değerlendirilmiştir. Bu şekil, vehicle ve VCD enjekte edilen grupların östrus döngüsünün gün cinsinden ortalama uzunluğunu göstermektedir.

Bir döngü, ES'deki ilk günden bir sonraki periyodun ilk gününe kadar ölçülür. ES vajinal sitolojisi, enjeksiyonların başlangıcından yaklaşık altı hafta sonra başlamıştır. VCD enjekte edilen hayvanların ESTRO döngülerinin, araç enjekte edilen hayvanlara kıyasla düzensizleştiği gözlemlenmiştir ve 12 estro döngüsünden sonra, VCD enjeksiyon protokolünün tamamlanmasıyla birlikte, tüm VCD enjekte edilen hayvanların sitolojisi artık döngü olduğunu göstermemiştir; over dokusu kesitlerinin H ve e boyaması, VCD ile tedavi edilen over dokusunda kontrollere kıyasla belirgin atrofi olduğunu ortaya koymuştur.

20 x büyütmede ve 200 büyütmede incelendiğinde, VCD ile işlem görmüş dokuda primer ve primordial foliküllerin tamamen tükendiği gözlemlendi. Plasebo ile işlem görmüş dokunun aksine, VCD kaynaklı yumurtalık yetmezliğinin egzersiz performansı üzerindeki etkisi, iki farklı suştan yedi aylık VCD ve plasebo ile işlem görmüş farelerde test edildi; dört haftalık egzersiz süresi boyunca egzersiz yapan her hayvan için günlük kafes tekerleği egzersiz değerleri zaman ve mesafe olarak kaydedildi. Bu şekil, mesafe, zaman ve hız için günlük koşu değerlerinin haftalık ortalamalarını göstermektedir.

Vehicle veya VCD uygulanan C 57, black six fareleri için, C 57, black six veya B six C3 F1 fare suşlarının her ikisinde de VCD ve vehicle uygulanan gruplar arasında günlük ortalama koşu mesafesi ve tekerlekte geçirilen süre ile ölçülen egzersiz performansında anlamlı farklar gözlemlenmemiştir. Bu durum, VCD kaynaklı yumurtalık yetmezliğinin gönüllü kafes tekerleği egzersizi üzerindeki etkisinin, gönüllü kafes egzersiz protokolü süresince en az iki fare suşunu aştığını göstermektedir. Vücut morfometrisi kaydedilmiş ve önceki gözlemlerle tutarlı olarak kalpler hızla çıkarılıp tartılmıştır.

Mutlak kalp ağırlığı ve tibia uzunluğuna göre normalize edilmiş kalp ağırlığı ile ölçülen, kafes tekerleği egzersizine yanıt olarak gelişen kardiyak hipertrofi gözlemlenmiştir. Mutlak kalp kütlesi ve kalp ağırlığının tibia uzunluğuna oranı, sedanter karşıtlarına kıyasla vehicle ve VCD ile tedavi edilen farelerde anlamlı derecede daha yüksek olsa da, kontrol grubu ile VCD kaynaklı over yetmezliği arasında kardiyak hipertrofi açısından ölçülebilir bir fark saptanmamıştır. Gönüllü kafes tekerleği egzersizi yapan fareler, son aşamada hem yüksek hem de düşük şiddetli egzersiz kapasitelerini belirlemek amacıyla zorunlu koşu bandı egzersizine tabi tutulmuştur.

Yüksek yoğunluklu protokolde, fareler bitkinlik belirtileri gösterene kadar ortalama bant hızı her 10 dakikada bir kademeli olarak artırıldı. Ortalama olarak, vehikül uygulanan farelerin maksimal hızı 26,7 ± 0,95 metre/dakika ve VCD uygulanan farelerin maksimal hızı bitkinlik öncesinde 28 ± 1,4 metre/dakika idi. Dayanıklılık kapasitesini değerlendirmek için 20 metre/dakika hızında düşük yoğunluklu koşu kullanıldı.

Ortalama olarak, araç uygulanan farelerin tükenme öncesindeki maksimum süresi 28,3 ± 1,3 dakika, VCD uygulanan farelerin maksimum süresi ise 29,7 ± 1,4 dakikaydı. Araç ve VCD uygulanan gruplar arasında yüksek veya düşük şiddetli egzersiz kapasitesi açısından anlamlı bir fark bulunmamış olup, bu durum VCD ile indüklenen over yetmezliğinin fare egzersiz kapasitesi üzerinde herhangi bir etkisi olmadığını göstermiştir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik; hücresel, moleküler ve fizyolojik bilimler alanındaki araştırmacıların, rodentlerde menopozun rolünü keşfetmelerine zemin hazırlamıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, uygun VCD enjeksiyonlarının nasıl yapılacağı, vajinal sitolojinin nasıl yürütüleceği ve fizyolojik bir müdahalenin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.