Name: Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Öğrenin, maya iki melez sistemiyle PXR ve ketokonazol etkileşimlerini nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, nükleer reseptör bağlanma mekanizmalarını ve ilaç direnci mutasyonlarını anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibe CA127231 ve Damon Runyon Vakfı Klinik Araştırmacı Ödülü (CI 1502) (S.M.'ye) tarafından desteklenmiştir. Çek Cumhuriyeti, Olomouc, Palacky Üniversitesi'nden Profesör Zdenek Dvorak'a, bu tekniğin kurumlarına taşınabilirliği ve protokolün standardizasyonu konusundaki yararlı görüşleri için teşekkür ederiz.

1. Maya Vektörlerinde PXR ve SRC-1 Füzyonlarının Oluşturulması
<ol>
	<li>İnsan PXR LBD (107-434 amino asit) ve İnsan SRC-1 tam uzunluğunun (1-1401 amino asit) PCR amplifikasyonu.
	<ol>
		<li>PXR LBD şablonu olarak pSG5-hPXR plazmid8'i kullanın, SRC-1 şablonları olarak pCMX-SRC1 plazmidini kullanın.</li>
		<li>PCR SuperMix'i, DNA şablonlarını ve primerleri (Malzemelere bakın) çözdürün, buz üzerinde tutun.</li>
		<li>0.25 μg/μl DNA şablonu 1 μl, 10 mM primer çiftlerinin her biri 2 μl, PCR SuperMix 45 μl ekleyin ve toplam hacmi 50 μl'ye getirmek için H2O ekleyin.</li>
		<li>PCR'yi 2 dakika boyunca 94 °C'lik bir döngüye, 30 saniye boyunca 20 döngü 94 °C'ye, 30 saniye boyunca 55 °C'ye ve 2 dakika boyunca 72 °C'ye, ardından uzatma için 10 dakika boyunca 72 °C'lik bir döngüye ayarlayın. %1 agaroz jel üzerinde çalıştırarak PCR ürünlerini kontrol edin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Y2H vektörlerine klonlanan PCR ürünleri.
	<ol>
		<li>PCR ürünlerini %1 agaroz jelden arındırın. BamHI ve SalI ile PXR, LBD, PCR ve Y2H vektörü pSH2-1'i sindirin; SRC-1 PCR ve Y2H vektör pGADNOT'u NotΙ ve SalΙ ile sindirin. Bunu yapmak için, toplam hacmi 30 μl'ye getirmek için 1 μg DNA, 3 μl 10x reaksiyon tamponu, 1 μl kısıtlama enzimi ve son olarak H2O ekleyin.</li>
		<li>Çürütme örneklerini 1 saat boyunca 37 ° C su banyosuna koyun. % 1 agaroz jeli üzerinde çalışarak sindirimi kontrol edin.</li>
		<li>Sindirim örneklerini %1 agaroz jelden saflaştırın, sindirilmiş PCR ürünlerini ve Y2H vektörlerini bağlayın ve DH5α yetkin hücrelere dönüştürün.</li>
		<li>Kolonileri toplayın ve plazmit DNA'sını izole edin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pSH2-1-PXR plazmit DNA'sını BamHI/SalI sindirimi ile tanımlayın, pGADNOT-SRC-1 plazmit DNA'sını NotI/SalI sindirimi ile tanımlayın. Dizileme ile tüm pozitif plazmit DNA'yı doğrulayın.</li>
</ol>
2. Maya İki Hibrit Tahliller
<ol>
	<li>Maya türünü 5 ml YPAD'ye aşılayın ve sürekli çalkalama ile gece boyunca inkübe edin (30 ° C'de 220 rpm). Not: Saccharomyces cerevisiae suşu, lexA operatörü10 ile entegre bir GAL1-lacZ geni içeren CTY10-5d (MATa ade2 trp1-901 leu2-3,112 his3-200 ga l4-gal80- URA3::lexA-lacZ) idi. Ketokonazole dirençli, ancak azol direnci18-20'nin bir nedeni olarak taşıyıcı değişiklikler taşımayan canlı maya hücreleri elde etmek için, önce ERG3'ün (erg3Δ) silinmesi ve ardından homolog rekombinasyon ile ERG11 (erg3Δ / erg11Δ) genlerinde ek delesyon eklenmesiyle yeni CTY10-5d maya suşları elde edildi. İnşaat detayları daha önce yayınlanmış bir el yazmasındaaçıklanmıştır 6 .</li>
	<li>Ertesi gün (sabah), mayayı (1:20) 5 ml YAPD içinde aşılayın ve sürekli çalkalama (30 ° C'de 220 rpm) ile bir OD600 ~ 0.2 elde etmek için inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri 2.000 rpm'de bir mikrosantrifüjde 2 dakika boyunca peletleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra peleti iki kez otoklavlanmış su ile ve bir kez 0,1 M LiAc ile yıkayın.</li>
	<li>Son yıkamadan sonra, süpernatanı atın ve hücre peletine aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 240 μl PEG 3500 %50 w/h, 36 μl 1 M LiAc, 50 μl 2 mg/ml haşlanmış somon spermi ssDNA, H2O 34 μl. Karıştırmak için girdap, 1 μg pSH-PXR ve 1 μg pGADNOT-SRC-1 DNA ekleyin ve karıştırın.</li>
	<li>Karışımı polistiren yuvarlak tabanlı tüpe aktarın, dönüşümü çalkalayın, karıştırın (30 ° C'de 220 rpm) 30 dakika Tüpü 42 ° C su banyosuna getirin ve 30 dakika daha inkübe edin.</li>
	<li>Tüpü 2.000 rpm'de 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peletleri bir kez otoklavlanmış su ile yıkayın.</li>
	<li>Tüpe 100 μl steril su pipetleyin, hafifçe parmak vurma ve pipetleme ile hücreleri yeniden süspanse edin, ardından -His/- Leu Bırakma Ortamı plakalarına yerleştirin (Bir Litre Başına Formülasyon -His/-Leu Bırakma Ortamı: 20 g dekstroz, 1.7 g YNB, 0.67 g CSM-His/-Leu, 5 g amonyum sülfat, %1.5 agar) ve transformantları izole etmek için 30 ° C'de 3-4 gün inkübe edin.</li>
</ol>
3. X-gal Filtre Testi
<ol>
	<li>Nitroselüloz membranı bir Petri kabının bir parçası boyutuna kadar kesin. Yönü işaretlemek için nitroselüloz membranı etiketleyin.</li>
	<li>Önceden işaretlenmiş nitroselüloz membranı maya kolonilerine yerleştirin, membranın plaka ortamının yüzeyi ile temas halinde olduğundan emin olun.</li>
	<li>Membranı çıkarın, koloni tarafı yukarı bakacak şekilde 3 mm'lik bir filtre kağıdına yerleştirin ve membranı ve filtre kağıdını -80 °C'de 15 dakika boyunca yerleştirin.</li>
	<li>X-gal çözeltisi yapın. 5 ml Z-tamponuna 50 μl 20 mg / ml X-gal ve 15 μl β-merkaptoetanol ekleyin (1 L tampon 16.1 g Na2HPO47H2O, 5.5 g NaH2PO4 H2O, 0.75 g KCl , 0.25 g MgSO4•7H2O içerir). Z Tamponu 4 °C'de tutulduysa, bu reaktifleri eklemeden önce oda sıcaklığına getirin.</li>
	<li>Bir Petri kabına iki daire 3 mm filtre kağıdı yerleştirin ve 5 ml X-gal solüsyonu ile ıslatın. Petri kabındaki fazla tamponu boşaltın ve nitroselüloz zarı koloni tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.</li>
	<li>Kapağı kapatın, membranın filtre kağıdı ile tam temas ettiğinden ve tamamen ıslak olduğundan emin olun. Petri kabını folyoya sarın ve 37 °C'de 30 dakika ila gece boyunca inkübe edin.</li>
</ol>
4. Sıvı β-gal Testi
<ol>
	<li>Mayayı -His/-Leu Bırakma sıvı ortamında OD600 0.7'ye kadar büyütün.</li>
	<li>1 ml ortamı 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 3.000 rpm'de 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Peleti yeniden süspanse etmek için 1 ml Z Tamponu ekleyin, tekrar 3.000 rpm'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.</li>
	<li>Hücre peletini yeniden süspanse etmek için 2ME ile 150 μl Z Tamponu ekleyin, karıştırın ve ardından 50 μl kloroform ve 20 μl %0.1 SDS ekleyin. Numuneyi 15 saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın.</li>
	<li>700 μl ONPG Çözeltisi (Z tamponunda 1 mg / ml) ekleyin. Zamanlayıcıyı ayarlayın, sarı rengin gelişmesine izin verecek kadar uzun süre 30 °C'de inkübe edin ve toplam reaksiyon süresini not edin.</li>
	<li>Reaksiyonu durdurmak ve 420 nm'de absorbansı belirlemek için 500 μl 1 M Na2CO3 ekleyin. Boş, 700 μl ONPG çözeltisi artı 500 μl 1 M Na2CO3'tür.</li>
</ol>
Miller Birimlerini aşağıdaki gibi hesaplayın: Miller Birimleri = (Å420*1,000)/(Å600*min*ml)
Å420: 420 nanometrede absorbans birimleri; Å600: 600 nanometrede absorbans birimleri; min: dakika cinsinden reaksiyon süresi; ml: ml cinsinden reaksiyon hacmi

<ol><li>Kliewer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orphan+nuclear+receptor+activated+by+pregnanes+defines+a+novel+steroid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway.</a> Cell. 92 (1), 73-82 (1998).</li>
<li>Blumberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+steroid+and+xenobiotic-sensing+nuclear+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor.</a> Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).</li>
<li>Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+%27Jekyll+and+Hyde%27+Nature+of+PXR%3A+The+Case+for+Discovering+Antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists.</a> Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).</li>
<li>Pondugula, S. R., Mani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+xenobiotic+receptor+in+cancer+pathogenesis+and+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response.</a> Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).</li>
<li>Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PXR+antagonists+and+implications+for+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Rev%22%5BJournal%5D)">PXR antagonists and implications for drug metabolism.</a> Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Yeast-Based+Strategy+Unveils+Antagonist+Binding+Regions+on+the+Nuclear+Xenobiotic+Receptor+PXR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR.</a> J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).</li>
<li>Hollenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li>
<li>Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Ras+interacts+directly+with+the+serine%2Fthreonine+kinase+Raf%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf.</a> Cell. 74 (1), 205-214 (1993).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phytoestrogen+coumestrol+is+a+naturally+occurring+antagonist+of+the+human+pregnane+X+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor.</a> Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).</li>
<li>Kalpana, G. V., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+homomeric+interactions+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+using+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).</li>
<li>Hamdi, A., Colas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid+methods+and+their+applications+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22TiPS%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery.</a> TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).</li>
<li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+two-hybrid+system+based+on+adenylate+cyclase+reconstitution+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli.</a> Methods. 58 (4), 325-334 (2012).</li>
<li>Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+and+optimization+of+yeast+two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems.</a> Methods. 58 (4), 317-324 (2012).</li>
<li>Albers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+yeast+two-hybrid+screening+for+nuclear+receptor-interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins.</a> Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).</li>
<li>Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+role+of+the+orphan+nuclear+receptor+SXR+%28steroid+and+xenobiotic+receptor%29+in+the+mechanism+of+CYP3A4+inhibition+by+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics.</a> J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+drug+metabolism+by+blocking+the+activation+of+nuclear+receptors+by+ketoconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole.</a> Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+pregnenolone+X-+receptor+is+a+target+for+ketoconazole+and+Its+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs.</a> Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).</li>
<li>Ghannoum, M. A., Rice, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+agents%3A+mode+of+action%2C+mechanisms+of+resistance%2C+and+correlation+of+these+mechanisms+with+bacterial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).</li>
<li>Kaur, R., Bachhawat, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+multidrug+resistance+pump%2C+Pdr5p%2C+confers+reduced+drug+resistance+in+erg+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology. 145, 809-818 (1999).</li>
<li>White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical%2C+cellular%2C+and+molecular+factors+that+contribute+to+antifungal+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).</li>
<li>Serebriiskii, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+peptides%2C+proteins%2C+and+drugs+that+selectively+interact+with+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets.</a> Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+PELP1+in+nonandrogenic+activation+of+the+androgen+receptor+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer.</a> Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).</li>
<li>Zhan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+Nur77+regulates+LKB1+localization+and+activates+AMPK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK.</a> Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Modifiye Y2H tahlilimizde, PXR6 üzerindeki ketokonazol etkileşimleri için önemli kalıntılar belirledik. SRC-1 bir koaktivatör olduğundan (ve pGADNot vektörüne klonlandığından), SRC-1'in pSH vektör sistemine klonlandığında lacZ ekspresyonunu aktive edip edemeyeceğini ve bunun aktivasyon profilini değiştirip değiştirmeyeceğini ve/veya maya iki hibrit testinin sızıntısını etkileyip etkilemeyeceğini de test ettik. Yeniden tasarlanmış plazmitlerimizi kullanarak erg3Δ/erg11Δ mayasında iki hibrit ta...

Maya iki-hibrit (Y2H) testi, protein-protein etkileşimlerini keşfetmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve daha yakın zamanda protein-protein etkileşim kompleksleri 7, 8, 9, 10, 11'i bozan yeni küçük moleküllerin keşfi için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ilaç keşfi veya "isabetler" için kullanılan bu tahlilin geleneksel yaklaşımları, protein-protein yüzeyleri içindeki kimyasal bileşiklerin allosterik etkileşim kalıntılarının tespit edilmesine izin vermez, bunlar değiştirildiğinde hala etkileşime girer ve değiştirilmiş kalıntıların sorgulanmasına izin verir11. Gerçekten de, böyle bir yöntem(ler)in geliştirilmesi mümkünse, protein-protein etkileşiminin bozulması için kritik olan allosterik etkileşim kalıntılarının yüksek verimli değerlendirmesi için izlenebilir bir maya sistemi sağlayacaktır. İlaç keşfi bağlamında, bileşiklerin proteinlerle etkileşimini kurmanın en doğrudan yolu, yapısal belirlemeyi (örneğin, protein inhibitörü kompleksinin kristalizasyonu) içerecektir. Bu yöntemler hantaldır, ayrıntılı kaynaklar kullanır ve her protein üzerinde yapısal çalışmalar yapmak teknik olarak mümkün değildir.
Bakteri1, 2 ve memeli iki-melez gibi diğer model sistemlerde izlenebilir genetik ilaç tarama sistemleri kurulmuştur. Bununla birlikte, bu sistemlerin optimizasyona ihtiyacı vardır ve Y2H gibi alternatif sistemler hala ilaç keşfinde en çok test edilenlerdir. Tekil yöntemler13 kullanılarak etkileşimlerin zayıf duyarlılığını ve güvenilirliğini içeren sınırlamalar vardır, ancak etkileşim kalıntılarıyla ilgili belirli soruları yanıtlamak için tek bir Y2H testi değiştirilebilir. Nükleer reseptör araştırması alanında, Y2H, etkileşen proteinleri14 tanımlamak için kullanılmıştır, ancak bu protein etkileşimleri, ligandların/antagonistlerin nükleer reseptör-protein kompleksleri ile etkileşime girdiği doğayı tanımlamak için nadiren kullanılmıştır. Bu nedenle, laboratuvarımız, özellikle proteomik tabanlı yöntemlere kolayca uygun olmayan reseptör proteinleri için, ters Y2H tabanlı bir keşif platformu kullanarak yeni ligand/antagonist etkileşimli kalıntıları ortaya çıkaracak bir yöntem tanımlama çabalarına odaklanmıştır.
Ketokonazolün PXR'yi ve aktivatörü SRC-1'i bozduğuna dair önceki bulgumuza dayanarak, PXR6 üzerindeki ketokonazol etkileşimli kalıntıları tanımlamamızı ve sorgulamamızı sağlayan yeni bir ters Y2H sistemi geliştirdik. Yöntemimiz, DNA bağlanması ve transkripsiyonel aktivasyondan sorumlu ayrılabilir alanlardan oluşan maya GAL4 proteininin özelliklerine dayanmaktadır. PXR LBD proteini, LexA DNA bağlama alanına (DNA-BD) bir füzyon olarak eksprese edilirken, tam uzunlukta ko-aktivatörler SRC-1 (steroid reseptör koaktivatörü 1) proteinleri, GAL4 aktivasyon alanına (AD) füzyonlar olarak ifade edilir. PXR ve SRC-1 füzyon proteinleri arasındaki etkileşim, maya genomuna entegre edilmiş raportör gen β-LacZ içeren GAL4 bağlanma bölgelerinin transkripsiyonel aktivasyonuna yol açar. Bir PXR antagonisti olan ketokonazol, PXR ve SRC-1 etkileşimini bozar 15, 16, 17 ve X-gal aktivitesi için filtrelerdeki kolonileri boyadıktan sonra ketokonazolün varlığında veya yokluğunda PXR ve SRC-1'in etkileşimini tespit edebiliriz. Y2H prensibi Şekil 1'de gösterilmiştir ve deneysel prosedür Şekil 2'de özetlenmiştir.

<table><tbody><tr><td>Maya Suşu: CTY10-5d erg3&Delta;/erg11&Delta;</td><td>Laboratuvarımız</td><td></td><td>CTY10-5d mayası, ERG3 ve ERG11 (erg3&Delta;/erg11&Delta;) genleri6 edildi.</td></tr><tr><td>YPD Büyüme Ortamı</td><td>BD Biosciences</td><td>630409</td><td></td></tr><tr><td>Difco Maya Azot Baz (YNB), Amino Asitler ve Amonyum Sülfat olmadan</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CSM-His/-Leu Komple Takviye Karışımı</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>4250-412</td><td></td></tr><tr><td>ONPG (O-Nitrofenil ve Beta;-D-Galaktopiranosid).</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Luria Suyu (LB)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Fisher</td><td>BP-1615</td><td></td></tr><tr><td>Sonike Somon Sperm DNA'sı haşlanmış (10 mg / ml)</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>156-017</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Acros Organics</td><td>61177</td><td></td></tr><tr><td>Ketokonazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1003</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamid</td><td>Acros Organics</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>Lityum Asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>%50 PEG-3350 solüsyonu, filtre ile sterilize edilmiş</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz Membran</td><td>Whatman</td><td>10402091</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri Kabı</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'pSH2-1</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'bizim</td> <td>laboratuvarımız</td><td></td><td>PXR LBD pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'laboratuvar</td><td></td><td></td> <td>SRC-1 pGADNOT</td></tr> <tr><td>için ileri astar5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'bizim</td> <td>laboratuvarımız</td><td></td><td>SRC-1 pGADNOT</td></tr><tr><td>Platinum PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr> için ters astar <tr><td>BamHI</td><td>laboratuvarımız</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>laboratuvarımız</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>laboratuvarımız</td><td>R0189</td><td></td></tr></tbody></table>

memeli nükleer reseptör kalıntıları tespit maya İki melez sistemi ters olduğunu ligandlannın ve / veya antagonistleri ile etkileşim

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

İlaç metabolizması ve inflamasyon kritik bir düzenleyicisi olarak, pregnan X Reseptör (PX), metabolizma ve enflamasyon (örneğin, karaciğer yağlanması) 1,2 bağlama hastalığın patofizyolojisinde önemli bir rol oynar. PX için agonist ligandların belirlenmesinde çok ilerleme olmuştur Bununla birlikte, ilaç-benzeri antagonistler ve PX 3,4,5 üzerindeki bağlanma siteleri sınırlı açıklamaları vardır. Kritik bir bariyer verimli PX 1998 klonlandı ve karakterize edildi rağmen antagonistleri ile yapı çalışmaları için de tam uzunluktaki proteini saflaştırmak için yetersizlik olmuştur. Bizim laboratuar PX 6 artıkları bağlayıcı, bir antagonist, ketokonazol en tanımlamak için temel alan yeni yüksek kapasiteli maya iki-hibrid tahlili geliştirilmiştir. Bizim yöntem ketokonazol ile etkileşim beklenen pxr ve AF-2 yüzeyinde tek mutasyonların etkisini kurtarırdı mutasyon kütüphanelerini oluşturma içerir. Kurtarma veya &quot;kazanç fonksiyon-&quot; sekond mutasyonlar PX üzerinde ketokonazol genetik etkileşim ve kalıntı yüzey (ler) ile ilgili sonuçlar, uygun olduğu şekilde yapılabilir. Böylece, kendi koaktivatörle, SRC-1 ile etkileşim PX mutantlarının veren yüksek işleme kapasiteli, iki maya hibrid ekran geliştirdi. Maya antifungal ilaç, ketokonazol çalışma karşılamak için modifiye edildiği, bu yaklaşım kullanarak, ketokonazol bağlamak için mümkün klonlarında zenginleştirilmiş PX belirli mutasyon göstermek olabilir. Ters mantıkla, biz orijinal kalıntıları ketokonazol ile doğrudan etkileşim kalıntıları olduğu sonucuna. Bu deney, bir yeni, nükleer reseptör yüzeyler üzerinde antagonist bağlanma bölgeleri için ekrana uysal genetik deneyi temsil etmektedir. Bu deney, maya hem de standart yapısal biyoloji veya proteomik göre yöntemler kullanılarak incelendi edilemez hücresel protein (ler) bağımsız olarak bir sitotoksik potansiyel herhangi bir ilaç için uygulanabilir. Potansiyel tuzaklar verilerin yorumlanmasını (tamamlayıcı yöntemler yararlı), dinleri dahilTek Y2H yöntemi, maya taşıma veya maya iki hibrit deneyleri performans uzmanlık ve tahlil optimizasyonu ance.

PXR ve steroid reseptör koaktivator-1'in (SRC-1) etkileşiminin kolorimetrik bir okumasını tespit edip edemeyeceğimizi görmek için bir analiz gerçekleştirdik. Mayalar önemli düzeyde sterol üretimi yaptığından, mayalarda lacZ ekspresyonunun ek bir ekzojen ligand gereksinimi olmaksızın indüklenebildiği daha önce gösterilmiştir. PXR ve SRC-1 ile transforme edilen maya suşunda lacZ ekspresyonunun (mavi koloniler) indüklendiğini; ancak boş vektörler, sadece PXR veya sadece SRC-1 ile transforme edilen mayalarda LacZ ekspresyonu...

Ketokonazol, Pregnane X Reseptörü (PXR) aktivasyonuna bağlanır ve antagonize eder. PXR mutantlarının maya yüksek verimli ekranları, ketokonazol bağlanması için benzersiz bir bölge tanımlar. Bu maya bazlı genetik yöntem, yüzey bağlanma bölgeleriyle ilişkili ligandlarla yeni nükleer reseptör etkileşimlerini keşfeder.

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Bu prosedürün genel amacı, Pregnan X reseptörü veya PXR ile küçük moleküllü inhibitör ketokonazol arasındaki etkileşimleri ortaya çıkaran yüksek kapasiteli bir maya iki hibrit analizini tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle biri insan PXR ligand bağlama alanını ve diğeri steroid reseptör KOAKTİVATÖR 1 veya SRC 1'i eksprese eden maya iki hibrit plazmitlerinin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Sıvı beta galaktos analizlerinde ortaya çıktığı üzere, ketokonazol varlığı insan PXR ile SRC 1 arasındaki etkileşimi bozar.Kolonilerin kolorimetrik taramasıyla birlikte, ketokonazol varlığında PXR mutantlarının filtre üzerinde taranması, reseptörü ilacın etkisine karşı bağışık kılan mutasyonların tanımlanmasını sağlar; bu durum nihayetinde görsel inceleme ve sıvı beta galaktosidaz analiz sonuçlarıyla düşük ekspresyon olarak belirlenir. SASE analizleri, ketokonazol varlığında PXR aktivasyonundaki değişiklikleri göstermek için kullanılır ve bu da etkileşimde yer alan orijinal kalıntıların tanımlanmasına olanak tanır. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, ortak olduğum Dr. Manny'nin laboratuvarında geliştirdik.PXR üzerine eksik yapılandırılmış verilerle karşılaştığımızda, biyokimyasal teknikler, özellikle etkileşim boyutunun çok yüzeysel ve kolayca düzeltilemez olduğu durumlarda tanımlama yapmamıza izin vermiyordu. Yapısal karakterizasyon için, kiton dirençli PXR mutanlarını tespit etme prensibine dayanarak, izlenebilir, uygulanabilir ve çok yüksek verimli bir şekilde birkaç gün içinde gerçekleştirilebilecek bir asit yöntemi geliştirdik.Bu yöntem, küçük moleküllerin reseptör proteinlere bağlanma gücü hakkında bilgi sağlayabilse de, hastalıklarda patojenik rol oynayan herhangi bir protein gibi diğer sistemlere de uygulanabilir; özellikle yapısal biyoloji yaklaşımlarındaki bir kısıtlama, küçük moleküler hedef etkileşimcilerini daha iyi anlamak ve tasarlamak için bağlanma kalıntılarının kaba tanımlanmasıdır. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi insan PXR ligand bağlanma bölgesini ve tam uzunluktaki insan SRC 1'i amplifiye edin. PCR ürünlerini %1'lik agaroz jelde çalıştırarak kontrol edin.Ardından, PCR ürünlerini AROS jelinden saflaştırın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde, PCR ürünlerini iki hibrit vektörde sindirin ve sindirim örneklerini bir saat boyunca 37 °C'lik su banyosunda bekletin. Sindirilmiş örnekleri %1'lik agroz jelden saflaştırın; ardından, sindirilmiş ve saflaştırılmış PCR ürünleri ile iki hibrit vektörü ligasyon işlemine tabi tutun ve 37 °C'de gece boyu inkübasyonun ardından DH five alpha kompetan hücrelerine transforme edin.Kolonileri seçin ve plazmit DNA'sını izole edin; vektör ve insert varlığını doğrulamak için restriksiyone enzim sindirimi kullanın, tüm pozitif plazmit DNA'larını sekanslama ile doğrulayın. Maya suşunu beş mililitre YAPD'ye ekleyin ve 220 RPM'de sabit ajitasyon ile 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, mayayı beş mililitre YAPD'ye 1:20 oranında ekleyin ve sabit ajitasyon ile 600 nanometrede 0,2 optik yoğunluk elde edene kadar inkübe edin.Hücreleri bir mikrosantrifüjde 2000 RPM'de iki dakika boyunca pelletleyin ve süpernatanı dökün. Ardından pelleti iki kez otoklavlanmış su ile ve bir kez 0,1 molar lityum asetat ile yıkayın. Son yıkamanın süpernatı döküldükten sonra, metin protokolünde listelenen transformasyon reaktiflerini hücre pelletine ekleyin ve karıştırmak için vorteksleyin.Ardından, karıştırmadan önce hazırlanan PXR içeren ve SRC içeren vektörleri ekleyin. Transformasyon karışımını tekrar bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpe pipetleyin ve 30 dakika boyunca çalkalayın. Tüpü 42 °C'lik bir su banyosuna taşıyın ve 30 dakika daha inkübe edin.Ardından, süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra tüpü 2000 RPM'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Pelleti bir kez otoklav suyuyla yıkayın; tüpün içine 100 µL steril su pipetleyin ve hücreleri hafifçe parmakla vurarak ve pipetleyerek yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri, transformantları izole etmek için histidin ve lösin içermeyen dropout besiyerine ekin ve 30 °C'de üç ila dört gün boyunca inkübe edin.Xga filtre deneyi ile başlamak için, bir Petri kabının 10 milimetrelik kısmına sığacak şekilde nitrocellulose membrandan bir üçgen kesin. Yönü belirtmek için nitrocellulose membranı etiketleyin. Önceden işaretlenmiş nitrocellulose membranı, membranın plaka ortamının yüzeyiyle temas ettiğinden emin olarak maya kolonilerinin üzerine yerleştirin.Membranı çıkarın. Koloni tarafı yukarı gelecek şekilde üç milimetrelik bir filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve membranı ve filtre kağıdını 15 dakika boyunca -80 °C'de bekletin. Ardından, bir Petri kabına iki adet üç milimetrelik daire şeklinde filtre kağıdı yerleştirin ve bunları 5 mL xal çözeltisi ile ıslatın.Petri kabındaki fazla tampon çözeltiyi süzün ve nitroselüloz membranı, koloni tarafı yukarı bakacak şekilde kaba yerleştirin. Membranın filtre kağıdıyla tamamen temas ettiğinden ve tamamen ıslandığından emin olarak kapağı kapatın. Petri kabını folyo ile sarın ve histidin ve lösin içermeyen sıvı besiyerinde, 600 nanometrede 0,7 optik yoğunluğa ulaşan mayaları büyütmek için 37 °C'de 30 dakikadan gece boyunca inkübe edin.Bir mililitre besiyerini 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 3000 RPM'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, pelete bir mililitre Z tamponu ekleyin ve santrifüjleyin. Daha önce yapıldığı gibi, hücre peletini yeniden süspande etmek için tümör kapto etanol içeren 150 mikrolitre Z tamponu ekleyin.Ardından 50 µL kloroform ve 20 µL %0,1 SDS ekleyip kuvvetlice karıştırın. Numuneyi 15 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra 700 µL ONPG çözeltisi ekleyin, zamanlayıcıyı ayarlayın ve sarı rengin oluşması için yeterli süre boyunca 30 °C'de inkübe edin.Renk geliştikten sonra toplam reaksiyon süresini kaydedin. Reaksiyonu durdurmak için 500 µL 1 M sodyum karbonat ekleyin. Ardından 420 nm'de absorbansı belirleyin.Son adım olarak, metin protokolünde açıklandığı şekilde Miller birimlerini hesaplayın. Mayalar önemli ölçüde steril üretim yaptığı için, mayada laxy ekspresyonu ek bir ekzojen liganda ihtiyaç duyulmadan indüklenebilir. Xal lift testi, mavi kolonilerle gözlemlenen laxy ekspresyonunun, PXR ve SRC one ile transforme edilmiş maya suşunda indüklendiğini ortaya koymuştur.Bu durum beta-galaktosidaz sıvı analizinde de gösterilmiştir. Ancak, tek başına boş vektörler PXR veya tek başına SRC-1 ile transforme edilmiş mayalarda laxy ekspresyonu indüksiyonu gerçekleşmemiştir. Replika filtreden gelen tüm kolonilerin beyaz olması, ketokonazolün mayadaki PXR ve SRC-1 etkileşimlerini bozduğunu göstermiştir; bu durum sıvı enzimatik analizlerle tespit edilen beta-galaktosidaz aktivitesindeki anlamlı azalma ile de kanıtlanmıştır.S rrc one ile P XR çift mutantı üzerinde maya transformasyonları gerçekleştirildiğinde, ketokonazole maruz kalan kolonilerin lakz ekspresyonunu hala koruduğu ortaya çıkmıştır. Bu durum, aynı PXR'nin güçlü bir ligand tarafından aktive edilebildiğini ancak memeli assaylerinde ketokonazolün antagonist etkilerine karşı bağışık olduğunu gösteren bu laboratuvardaki önceki çalışmalara benzerdir. Bu videoyu izledikten sonra, dikkatli bir hibrit AC'nin nasıl gerçekleştirileceği ve proteinler üzerindeki küçük moleküler bağlanma kalıntılarının incelenmesi için gerekli modifikasyonların neler olduğu konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedürü uygularken, reseptörünüzün oldukça çeşitli bir mutant kütüphanesini elde etmenin, her bir 200 artı için iyi bir transformasyon verimliliği sağlamanın, ilaçlı veya ilaçsız filtrelerin yerinde neredeyse özdeş kopyalarını geliştirmenin ve son olarak nase tespiti için doğru görsel ve kimyasal incelemeler yapmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, en azından bend uc'nin insan hücreleri için uygulanabilir olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla Ian 200 a Asitler protein pro as asitler ve iCal docking homolog modelleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Eğer öyleyse, bu kalıntıları bir farmakofor olarak tanımlayan bir model oluşturulabilir.

reverse-yeast-two-hybrid-system-to-identify-mammalian-nuclear

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

MİT, geçici ve istikrarlı model organizma Saccharomyces cerevisiae ifade proteinler arasındaki etkileşimleri hassas algılama sağlar. Bu, yüksek kapasiteli bir şekilde etkileşim ortakları belirlemek amacıyla eksojen ve maya integral membran proteinleri çalışma başarıyla tatbik edilmiştir.

Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

Biz geleneksel maya iki-hibrit taraması, protein etkileşimleri tanımlayan genetik etkili bir aracı olarak var. Bu değişiklik, sürecin belirgin kısaltır, iş yükünü azaltır ve en önemlisi, yanlış pozitiflerin sayısını azaltır. Buna ek olarak, bu yaklaşım, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Büyüme Faktörü Progranulin ile etkileşimde Proteinler tanımlamak Modifiye Maya-İki Hybrid Sistemi

Bu videoda, hedef DNA ile etkileşime giren birden fazla proteini tespit eden modifiye maya tek hibrit testini gösteriyoruz. Dönüştürülmüş maya hücreleri, raportör genin yukarı akışındaki hedef DNA dizisini içerir. Ek olarak, transkripsiyon faktörü proteinlerini eksprese ederler. Proteinler kompleksler oluşturduğunda ve hedef DNA'ya bağlandığında, raportör gen eksprese edilir ve enzimatik olarak tespit edilebilir.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşimlerini Tespit Etmek için Modifiye Maya-Bir Hibrit Testi

Hücre içi depolardanCa2+ salınımına aracılık eden homo-tetramerik bir iyon kanalı olan ryanodin reseptörünün oligomerizasyonu, iskelet ve kalp kası kasılması için kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin kendi kendine birleşmesini tespit etmek ve homo-oligomer stokiyometrisini belirlemek için tamamlayıcı in vivo ve in vitro yöntemler sunuyoruz.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Bakteriyel efektör proteinleri başarılı enfeksiyonları kurulması için önemlidir. Bu protokol, doğal bitki konukçuda bir bakteriyel efektör proteininin proteinli bağlanma partnerleri ile deneysel tanımlanmasını açıklar. Maya iki hibrit ekranlarından yoluyla bu efektör etkileşimleri belirlenmesi moleküler patojenite stratejilerinin çözülüyor önemli bir araç haline gelmiştir.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Burada açıklanan tadil edilmiş maya tek hibrid tahlil, herhangi bir işlevsel genomik çalışma için heterolog bir sistemde heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamak için klasik maya tek hibrid (Y1H) analizinin bir uzantısıdır.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Bu iletişim kuralı tanımlamak ve reseptör-ligand etkileşimleri ölçmek için kullanılan bir muhabir sistem kurmak açıklar.

Reseptör-Ligand etkileşimleri çalışmak için bir BW muhabir sistemi

Biz memeli iki-hibrid tahlil kullanarak 4-hidroksi-tamoxifen-bağımlı östrojen reseptör Alfa ligand bağlayıcı etki alanı dimerization etkinliğini analiz etmek için bir yöntem mevcut.

Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama

Protein-protein etkileşimleri gibi biyomoleküllerin etkileşimleri, biyolojik fonksiyonların moleküler temelidir. Özellikle ilgili etkileşimden yoksun olan etkileşim-sıfır/bozulmuş mutantlar izole edilebilirse, bu etkileşimin işlev(ler)ini anlamaya büyük ölçüde yardımcı olacaklardır. Bu makale, etkileşimi boş/bozulmuş mutantları izole etmenin etkili bir yolunu sunmaktadır.

Maya iki-hibrit testi kullanılarak etkileşim-boş/bozulmuş mutantların izole edilmesi

Protein tasarımı, amino asit dizilerinin inşasını ve fonksiyonel varyantlar oluşturmak için belirli motiflerin dahil edilmesini içerir. Bu yaklaşım, antibiyotiğe dirençli patojenlerle savaşmak için antimikrobiyal peptitlerin (AMP'ler) geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, çeşitli biyoinformatik araçları kullanılarak protein yapımı için bir prosedür sunmaktadır.

Proteinlerin De Novo ve In Silico Tasarımı için I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK sunucusu ve HEX loria uygulaması

Öğrenin, maya iki melez sistemiyle PXR ve ketokonazol etkileşimlerini nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, nükleer reseptör bağlanma mekanizmalarını ve ilaç direnci mutasyonlarını anlamak için kullanılır.

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim (Video) | JoVE Journal

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

Daha fazla video keşfet