Name: Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Keşfedin, yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinden nörospher kültürü optimizasyonunu ve 3D immünohistokimya için parafin gömme tekniğini. Bu yöntem, kanser kök hücre benzeri hücreleri zenginleştirir ve preklinik araştırmalar için hasta özgü glioblastoma modelleri oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Hermelin Beyin Tümörü Merkezi, Henry Ford Hastanesi tarafından finanse edilmiştir.

1. Nörosfer Kültürü için Taze Cerrahi Glioblastoma Örneğinden Tek Hücreli Süspansiyon
<ol><li>Hastaların yazılı onayı ile ve kurumsal yönergelere uygun olarak, yüksek dereceli glioma rezeksiyon ameliyatından hemen sonra hücre kültürü için tümör örnekleri toplayın.</li>
	<li>Histopatoloji ile tümör örneğinin tanısını onaylayın. Numuneyi ameliyattan itibaren 1 saat içinde işlenmek üzere hemen operasyon odasından laminer akış dokusu kültür başlığına taşıyın. NOT: Uzak bir bölgedeki ameliyatlar için tümör örneğini daha küçük parçalara bölün ve DMEM/F12 içeren bir tüpe yerleştirin (buzda tutun). Tümör ameliyattan birkaç saat sonra işlenebilir.</li>
	<li>200-500 mg doku (optimal) ile başlayarak, neşter bıçağı kullanarak tümör örneğini kıyma yapın ve 10 ml DMEM/ F12 serum içermeyen ortam içeren 15 ml'lik bir tüpe aktarın. Birkaç kez ters çevirerek karıştırın, tümör parçalarının yerçekimi ile tortulanmasını, ortamın çıkarılmasını ve gerektiğinde tekrarlanmasını bırakın.</li>
	<li>Enzymatic Doku Ayrıştırma Sokunu hazırlayın ve Çözeltiyi Yeni Durdurun.<ol>
<li>Enzymatic Doku Ayrıştırma Çözümü: 5 ml% 0.05 Tripsin-EDTA, 2.5 ml Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) kalsiyum ve magnezyum içermeyen, 2.5 ml Kollajenaz IV stok çözeltisi (kalsiyum ve magnezyumlu HBSS'de 2.000 U/ml).</li>
		<li>Durdurma Çözümü: 5 ml Tripsin inhibitör çözeltisi, 5 ml DMEM/F12, 2 μl 5.000 U/ml DNASE I (HBSS kalsiyum ve magnezyum içermeyen olarak üretilir).</li>
	</ol></li>
	<li>Ortamı çıkarın ve her 0,5 g doku için 2 ml kullanarak kıyılmış tümör örneğine Enzimatik Doku Ayrıştırma Çözeltisi ekleyin. Ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>37 °C'de bir doku kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca doku inkübatörünü inkübte edin.</li>
	<li>2 ml pipetle tritüre edin ve sindirimi durdurun veya sindirim seviyesine bağlı olarak 15-30 dakikalık başka bir inkübasyon için inkübatöre geri dönün.</li>
	<li>2 hacim stop solution ekleyerek sindirimi durdurun ve 5 ml serolojik pipet ile mekanik olarak tritüre edin.</li>
	<li>Sindirilmemiş malzemeyi 40 μm hücre süzgeçten filtreleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'daki hücreleri pelet, ardından 10 ml DMEM / F12'de 3x yıkayın.</li>
	<li>Son hücre peletini 5 ml DMEM/F12'de yeniden sür.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu yavaşça 5 ml Lenfolit-M ve pelet üzerinde 1,300 x g oda sıcaklığında 20 dakika boyunca katmanlayın.</li>
	<li>Çekirdeklenmiş hücreleri içeren arayüz katmanını 10 ml DMEM/F12 içeren 15 ml'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da peletin. Yıkamayı DMEM/F12 2 kat daha fazla tekrarlayın.</li>
	<li>Cryopreserve, elde edilen tek hücreleri, Kurtarma Hücresi Dondurma Ortamı'ndaki peletin yeniden canlandırılması, cryovials içine aliquoting, yavaş donma ve sıvı nitrojende depolanması ile daha fazla kullanım için saklayın.</li>
	<li>Kültüre, Büyüme Faktörleri (NMGF) ile desteklenmiş Nörosfer Ortamı'ndaki hücreleri yeniden dürtmek ve standart koşullar altında normal bir T25 doku kültürü şişesinde nispeten düşük yoğunlukta (<1 x10 5 hücre/ml) plaka, % 5 CO2, 37 °C, nemli doku kültürü inkübatörü (Şekil 1A).<ol>
<li>Aşağıdaki tarifi kullanarak NMGF'ye hazırlanma<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
<colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;width:188px;">500 ml DMEM/F12 için</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Stok çözümü</td>
					<td>hacim</td>
					<td>nihai konsantrasyon</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">N2 takviyesi (10x)</td>
					<td>5 ml</td>
					<td>1x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">250 mg/ml BSA stok çözümü</td>
					<td>1 ml</td>
					<td>0,5 mg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">10 mg/ml Gentamisin reaktifi</td>
					<td>1,25 ml</td>
					<td>25 μg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100x antibiyotik/antimycotic</td>
					<td>2,5 ml</td>
					<td>0,5x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td>100 mg/ml bFGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100 mg/ml EGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
</tbody>
</table>
</li>
	</ol></li>
	<li>1-3 hafta boyunca oluşan nörosferleri (Şekil 1B-E) bağlı hücrelerden ve döküntülerden ayırmak için taze şişelere aktarın. Her 3-4 günde bir kısmi medya değişiklikleri gerçekleştirin. NOT: Yukarıdaki protokol kullanılarak ortotopik ksenograft tümörün ayrıştırılması durumunda 1.11-1.13 arası adımlar atlanabilir.</li>
</ol>2. Glioblastoma Nörosfer Kültürü Bakımı ve Aşağı Akış Uygulamaları
<ol><li>
Ayrışma: Nörosfer kültürlerini izleyin ve her 3-4 günde bir kısmi orta değişiklikler gerçekleştirin. Şişedeki çok hücreli nörosferlerin çoğu çapı 100 μm'ye ulaştığında, tek bir hücre süspansiyonuna ayrışın:<ol>
<li>Nörosferleri içeren ortamı 15 ml'lik bir tüpe aktarın, yerçekimi nörosferleri yaklaşık 5 dakika boyunca tortuya maruzn, ortamı çıkarın ve hücre peletini 10 ml kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'de yeniden biriktirin.</li>
		<li>Hücreler yerçekimi tarafından çökelti olarak oda sıcaklığında 10 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>7-8 ml DPBS çıkarın, ardından nörosferleri önceden yazılmış bir serolojik pipetle mekanik olarak ayrıştırın.</li>
		<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da ayrışmış hücreleri peletle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Paslanma: NMGF'de ayrışmış hücreleri (adım 2.1.) yeniden biriktirin ve gerekli şişe sayısına bölün (1:3) ve standart koşullar altında kuluçkaya yatırın. sekonder nörosferler oluşacak ve daha sonra üçüncül kürelerin oluşumu için ayrışmalıdır.</li>
	<li>
Uzun süreli kendini yenilemenin değerlendirilmesi: Nörosfer kültürü kültürde en az 2 aya eşdeğer en az 10 pasaj elde edene kadar ayrışma prosedürünü tekrarlayın.</li>
	<li>
Donma: Nörosferleri kriyoprezikasyon yapmak için, nörosferleri ayrıştırmak (adım 2.1.) ve hücre peletini Kurtarma Hücresi Dondurma Ortamı'nda, aliquot'u cryovials'ta, yavaş dondurmada ve sıvı nitrojende saklamak için yeniden depolayın.<ol>
<li>Nörosfer hücrelerini donmuş bir stoktan kültüre etmek için: hücreleri 37 ° C'de çözün ve hemen 10 ml DMEM / F12 içeren 15 ml'lik bir tüpe aktarın. Tüpü hafifçe karıştırın ve ardından hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da döndürün. Hücre peletini bir kez daha yıkayın ve NMGF'deki hücreleri yeniden biriktirin ve bir T25 doku kültürü şişesine aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İmmün sistemi baskılanmış farede intrakraniyal implant için hücre süspansiyonu:<ol>
<li>Nörosferleri ayrıştırın (adım 2.1.) ve hücre peletini kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'de yeniden biriktirin. Hemositometre ve trypan mavi dışlama kullanarak uygulanabilir hücreleri sayın.</li>
		<li>İmplant için gereken hücre sayısını hesaplayın, tipik olarak 3 x 105 hücre/fare, istenen hücre sayısını bir şişeye aktarın ve hücreleri 1.000 x g'da peletlayın.</li>
		<li>Mikrosantrifüj tüpüne hafifçe dokunarak hücre peletini implanta (5 μl/fare) uygun bir hacimde yeniden kullanın. Hücre süspansiyonu buza yerleştirin ve 2 saat içinde kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tümörojenik Glioblastoma Hücrelerinin Kült Haline Getirmede Alternatif Protokol (nörosfer kültürünün başarısız olduğu durumlar için)
<ol><li>NMGF ortamını fetal sığır serumu ile %2 FBS/NMGF son konsantrasyonuna tamamlar.</li>
	<li>
NMGF kültüründeki hücrelerden başlayarak:NMGF şişesinden (Şekil 1F) uygulanabilir hücreleri hasat edin, % 2 FBS / NMGF'de yeniden biriktirin ve normal bir T25 doku kültürü şişesinde nispeten düşük yoğunlukta (<1 x10 5 hücre / ml) plaka, ve standart koşullar altında kültür, 5% CO2, 37 ° C, nemlendirilmiş doku kültürü inkübatörü (Şekil 1G).</li>
	<li>
Donmuş hiç kültüre sahip olmayan hücrelerle başlayarak (adım 1.14.): Hücreleri çözün, serumsuz ortamda yıkayın ve % 2 FBS / NMGF'de plaka yıkayın ve adım 3.2'de açıklandığı gibi kültür. Uygulanabilir hücrelerin %2 FBS/NMGF'ye aktarılmasına kadar 3 gün boyunca NMGF'de kültleme, farklılaştırılmış hücreleri önceden seçmeye bir alternatiftir.</li>
</ol>4. İmmünohistokinetri ile Nörosferlerin Morfolojik ve Moleküler Analizi
<ol><li>Çoğu yüzen çok hücreli sferoid 100 μm çapa ulaşana kadar nörosferleri kültüre edin.</li>
	<li>Kültür şişelerini inkübatörden çıkarın ve hemen nörosferleri peletleyin, ortamı çıkarın ve peleni bozmadan 10 ml DPBS ekleyin. DPBS'yi çıkarın, %10 nötr tamponlu formalin içinde yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Küreselleri pelet, % 30 etanol resuspend ve 30-45 dakika kuluçka.</li>
	<li>% 30 etanolünü% 50 etanol ile değiştirin, 15 dakika kuluçkaya yatır ve taze% 50 etanol ile değiştirin, 30 dakika daha kuluçkaya yatır.</li>
	<li>%70 etanol ile tekrarlayın (adım 4.4.).</li>
	<li>Her biri 10-20 dk iki değişiklik% 95 etanol ile değiştirin ve küreseller parlak beyaz ve yoğunlaşına kadar mutlak etanol ile tekrarlayın.</li>
	<li>Lens kağıdından küçük bir filtre kağıdı konisi yapın ve bir beherde küçük bir huni içine yerleştirin. Lens kağıdını mutlak alkolle ıslatın.</li>
	<li>Peletin taze% 100 etanol ile hafifçe gevşetin, fazla etanol dökün ve küreselleri lens kağıt koniden dökün, koninin ucuna gittiklerinden emin olun. Tüpü ek mutlak etanol ile durulayın ve kalan küreselleri lens kağıdı koniden dökün.</li>
	<li>Kağıt konisini huniden çıkarın ve küreselleri koninin altına dikkatlice hareket ettirelim. Kağıdı bir kareye katlayın ve küresellerin mümkün olduğunca güvenli bir şekilde kapalı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Paketlenmiş nörosferleri bir kasete aktarın ve otomatik bir doku işlemcisine aktarın.</li>
	<li>Otomatik doku işlemcisini aşağıdaki gibi programlayın: mutlak etanol, 10 dk, ksilen, 15 dk (2x), parafin, 10 dk (4x).</li>
	<li>Kaseti işlemciden çıkarın ve bir parafin gömme sisteminin ısıtılmış kısmına yerleştirin. Tüm yüzeyin parçalardan, tozdan veya diğer döküntülerden arındırığından emin olun ve tüm parafinleri ısıtan kuyulardan sifonlayın. Sıcak temiz parafinsiz kümesler ve ısıtılmış bir baz kalıba az miktarda parafin ekleyin.</li>
	<li>Kaseti açın, paketi çıkarın ve gömme sisteminin ısıtılmış kısmına yerleştirin. Sferoidler görünene kadar kağıt konisini dikkatlice açın. Önceden ısıtılan önps ile malzemenin mümkün olduğunca çoğunu toplayın ve baz kalıptaki sıvı parafinlere aktarın.</li>
	<li>Mümkün olduğunca çok sferoid almak için gerektiği gibi tekrarlayın. Doku kağıdını, bloğa herhangi bir kağıt almadan kalan küreselleri toplamak için etanol ile silinmiş önceden ısıtilmiş temiz bir jiletle hafifçe kazıyın.</li>
	<li>Sıcak kümelerle herhangi bir küresel kümeyi dikkatlice ayırın. Küreselleri köşelerden tekdüze bir merkezi katmana taşıyın. Küreselleri yerinde sabitlemek için temel kalıbı soğutma alanına taşıyın, kaseti ekleyin, parafinle yavaşça doldurun ve iyice soğutun.</li>
	<li>Nörosfer parafin bloğu normal kesit ve immünostokimya için kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ignatova, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cortical+glial+tumors+contain+neural+stem-like+cells+expressing+astroglial+and+neuronal+markers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro.</a> Glia. 39, 193-206 (2002).</li>
<li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444, 756-760 (2006).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
<li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%28%2B%29+and+CD133%28-%29+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).</li>
<li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+biological+implications+of+CD133-positive+and+CD133-negative+cells+in+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas.</a> Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).</li>
<li>Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSEA-1+is+an+enrichment+marker+for+tumor-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+cell%22%5BJournal%5D)">SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma.</a> Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).</li>
<li>deCarvalho, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliosarcoma+stem+cells+undergo+glial+and+mesenchymal+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo.</a> Stem Cells. 28, 181-190 (2010).</li>
<li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Laks, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+Formation+Is+an+Independent+Predictor+of+Clinical+Outcome+in+Malignant+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li>
<li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumour+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Brain tumour stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 425-436 (2006).</li>
<li>Gunther, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma-derived+stem+cell-enriched+cultures+form+distinct+subgroups+according+to+molecular+and+phenotypic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria.</a> Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).</li>
<li>Fael Al-Mayhani, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+derivation+and+propagation+of+glioblastoma+cell+lines+that+conserves+the+molecular+profile+of+their+original+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours.</a> J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).</li>
<li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+cell%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+implications+of+plasticity+of+the+cancer+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Pietras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in tumor heterogeneity.</a> Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).</li>
<li>Lomonaco, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+autophagy+by+gamma-radiation+contributes+to+the+radioresistance+of+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells.</a> Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Uygun enzymatik tümör hücresi ayrışması bu protokolde kritik bir adımdır. Doku, 37 °C'de hücre ayrıştırma çözeltisinde inkübasyondan önce, en az 30 dakika boyunca, dokunun mekanik olarak üçe alınması ve ayrışma uzantısının doğrulanması gerektiğinde iyice kıyılmalıdır. Doku uyum derecesine bağlı olarak, kuluçka, tek hücrelere ayrışma işlemini tamamlamak için gerektiğinde 15-30 dakika daha uzatılabilir. Hücre canlılığının azalması nedeniyle 1 saatten uzun süre ayrışma çözümünde inkübasyon önerilmez. Optimal başlangıç dokusu miktarı 200-500 mg olmasına rağmen, bu protokol 50 mg kadar az tümör dokusundan başarılı nörosfer kültürlerine yol açmıştır.
Serumsuz NMGF seçici bir ortamdır ve tümörün büyük kısmını oluşturan neoplastik hücrelerin bir yüzdesi ve konak hücreler hayatta kalamazken, diğerleri kaplamadan sonra tedavi edilen şişeye bağlanacaktır. 1-3 hafta boyunca oluşacak nörosferlerin (Şekil 1B-E) farklılaşmış tümör hücrelerinden ve döküntülerinden ayrılmak için taze şişelere aktarılması kritik öneme sahiptir.
GBM hücreleri enzimmatik olarak ayrışır ve hiçbir zaman kültüre edilmez (adım 1.10), nörosfer kültürünün başarısız olması durumunda, alternatif medyada kültüre hücrelerin yedek kaynağı olarak kriyoprezer olarak saklanabilir. Bu tür donmuş stoklardan nörosfer kültürlerinin yanı sıra% 2 FBS / NMGF'de büyüyen monolayer hücrelerden başarıyla elde ettik.
Kavramsal olarak, "kanser kök hücresi" devam eden bir çalışmadır ve bu gelişmekte olan alan ek açıklamalardan yararlanacaktır, çünkü klinik etkileri, özellikle tümör heterojenliği, plastisite ve tedaviye direnç oluşturmada önemli ölçüde19,20. Nörosfer kültürleri, hastaya özgü GBM hayvan modelleri üretmek için hayati öneme sahip olmasının yanı sıra, büyüme faktörlerine yanıt olarak hücre sinyalizasyonunda değişiklik ve gen ekspresyonu, hipoksi ve farmakolojik ajanlar11,21gibi in vitro çalışmalar için de değerlidir. Tüm küreyi etiketleme ve görüntülemenin daha yaygın yöntemi ile ilgili üstün hücre altı lokalizasyonu nedeniyle, immünofizyömi11tarafından protein ekspresyasyonu ve çeviri sonrası modifikasyonları incelemek için 3D mimariyi koruyarak formalin sabit ve parafin gömülü nörosferlerin kesitlerini kullanmayı tercih ettik.
Yetişkin memeli beyninden elde edilen nörosferlerdeki tüm hücrelerin kök hücre olmadığı gösterilmiştir22. Benzer şekilde, GBM tümörlerinden kültürlenen nörosferler, daha farklı kanser progenitör hücrelerinin varlığı ve yüksek hücre yoğunluklarında ortaya çıktığı bilinen kendi kendine toplama nedeniyle klonal değildir23Bu yöntemin bazıları tarafından bir sınırlaması olarak kabul edilir. Nörosferler22olarak geçici olarak büyüyebilen sadece progenitörlerin aksine, uzun süreli kendi kendini yenileyen kök hücreler için zenginleşmeyi tercih etmek için, birincil nörosferler ikincil nörosfer oluşumu için ayrışır ve kök hücrelerde zenginleştirilmiş bir popülasyonun göstergesi olan sürekli kültürde kabaca 2 aya eşdeğer en az 10 pasaj için daha fazla geçiş yapılır22. Deneyimlerimize göre, bu işareti elde eden GBM nörosfer kültürleri süresiz olarak nörosfer olarak genişletilmeye devam edebilir. Tümör derecesi önemlidir, çünkü sırasıyla GBM'lerden ve anaplastik astrositomalardan, WHO sınıf IV ve III'ten başarılı kültürler elde ettik, ancak alt dereceli gliomalardan elde etmedik.
Glioblastoma hücrelerini kültlemenin en yaygın yöntemi, % 10 FBS ile desteklenmiş geleneksel büyüme ortamında, orijinal tümörlerden önemli genomik ve fenotipik ayrışmaya yol açar 4. Öte yandan, nörosfer kültürleri kanser kök hücre fenotipi4sunan kararlı ve uzun vadeli bir hücre kaynağıdır. Nörosfer yöntemi, bu yöntemin ana zayıflığını temsil eden tüm yüksek dereceli astrositom örnekleri için başarılı olmamasına rağmen, ortotopik fare ksinograft modelleri için uzun vadeli kültürlerde CSC'nin zenginleştirilmesi için giderek daha popüler hale gelmiştir. Ebeveyn tümörlerinin moleküler özelliklerinin nörosfer oluşumunu nasıl etkileyebileceğini anlamaya yönelik çalışmalar devam etmektedir. "Omics" bilgilerinin erişilebilirliği ve potansiyel hedefli tedavilerin sayısının artmasıyla beslenen kişiselleştirilmiş tıp çağına ilerlerken, hastaya özgü GBM modellerine sahip olmanın önemli avantajları göz önüne alındığında, kültür yüksek dereceli gliomalara pratik alternatif yöntemlerin araştırılması ve ardından kapsamlı doğrulama verilir.

WHO sınıf IV astrositom olan Glioblastoma (GBM), en yaygın ve agresif primer beyin tümörüdür. Nöral kök hücre (NSC) belirteçlerinin ekspresyotiği, uzun süreli kendini yenileme ve astrositik belirteçleri ifade eden vetümörünbüyük kısmını oluşturan daha farklı hücrelere yol verme potansiyeli gibi "kanser kök hücresi" (CSC) özellikleri sergileyen hücreler de dahil olmak üzere gbm tümör hücreleri tarafından çeşitli gelişimsel fenotipler benimsenmiştir. KSS moleküler kimliği ve klinik etkileri ile ilgili açıklama hala gerekli olmakla birlikte, mevcut çalışmanın odak noktası KSS'nin operasyonel tanımıdır: uzun süreli kendini yenileme in vitro ve immün sistemi baskılanmış kemirgenlerde ortotopik implantasyon üzerine orijinal tümörü ayırt etme ve çoğaltma yeteneği.
Glioblastoma hücreleri on yıllardır% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren geleneksel ortamda kültürlenmiştir ve piyasada bulunan birkaç yüksek geçişli serum kültürlü GBM hücre hatları immün sistemi baskılanmış kemirgenlerde tümörijeniktir, ancak orijinal tümörden önemli genomik ve moleküler ayrışma vardır4, klinik olarak ilgili modeller olarak kullanımlarını sınırlar. Daha yakın zamanda, EGF ve bFGF'ye duyarlı kök/progenitör fenotipli hücreler GBM2'detanımlanmıştır. Daha sonra, ayrışmış GBM tümör örnekleri serumsuz bir ortamda kültürlendi3, başlangıçta nöral kök hücrelerin yetişkin memeli beyninden seçimi ve genişlemesi için formüleedilmiştir 5. Bu kültür koşulları, çoğu nonneoplastik ve daha farklı tümör hücre popülasyonlarının büyümesini engellerken, kök ve progenitör hücrelerin yüzen çok hücreli sferoidler veya nörosferler olarak büyümesini destekler3, yetişkin memeli nöral kök hücrelerin davranışını takliteder 5. Büyüme faktörleri (NMGF) ile desteklenmiş nörosfer ortamında veya %10 FBS ile desteklenmiş geleneksel büyüme ortamında kültürlenen birincil GBM hücrelerinin kapsamlı bir şekilde yan yana karşılaştırılması, GBM nörosferlerinin tümörojenik olduğunu, çok satırlı farklılaşma potansiyeli sunduğunu ve düşük pasajlarda tümörijenik olmayan ve geç pasajlarda orijinal tümörlerden önemli ölçüde ayrılan% 10 FBS kültürlerinin aksine orijinal tümörün genotipini koruduğunu ortaya koydu4.
CSC'nin, putatif CSC işaretleyici CD133'ün ifadesine dayanarak hücre sıralama yoluyla ayrışmış GBM tümörlerinden izole edilmesi de önerilmiştir6,7, ancak daha fazla çalışma, CSC fenotipinin bu tür belirteçlerin ifadesiyle kesin olarak ilişkili olmadığını gösterdi8-10, bu strateji için ilk hevesi azaltırken, yeni belirteçler hala test edilmektedir10. KSS'yi tanımlayan doğrulanmış bir işaretleyici kümesinin bugüne kadarki kullanılamaması, bu hücrelerin klinik öncesi çalışmalar için büyük ölçekli amplifikasyonu hedefiyle birlikte, hücre sıralamanın rutin CSC ile zenginleştirilmiş kültürler için pratik olmayan kullanımını işlemez hale getirir. NMGF'de nörosfer olarak büyüme yeteneği ile seçilen GBM hücreleri, sinirsel kök hücre belirteçlerini her zaman ifade eder. Sox2 ve nestin'in nörosfer kültürlerinde her yerde ifade edildiğini, CD133 proteininin ise GBM nörosferlerinin bir alt kümesinde bulunduğunu gözlemledik (yayınlanmamış veriler ve referans11).
Çeşitli laboratuvarlar, büyüme faktörleri 3 ,4,11-14ile desteklenmiş serumsuz ortamda aynı genel enzmatikayrışma ve kültleme yaklaşımını kullanarak glioblastoma tümörlerinden nörosfer kültürlerini takipederken,diğer meslektaşları gbm örneklerinden uzun vadeli nörosfer kültürlerini başarı olmadan büyütme girişimleri bildirmektedir. Burada sunulan yüksek dereceli gliomaların enzmatik ayrışması ve nörosfer kültürü için genel yöntem, yukarıdaki yayınlarda özetlenenlere benzer. Protokolü, 100 GBM'den fazla numuneyi ayrıştırma ve kültleştirme deneyimimize dayanarak optimize ettik. Burada sunulan protokolü uygulayan taze GBM örneklerinden uzun vadeli nörosfer kültürleri elde etmenin verimliliği% 40'ın üzerindedir, verimlilik verilerini gösteren birkaç raporabenzer3,15, EGF ve bFGF'nin ECMproteini 16ile kaplanmış yüzeylerde monolayer olarak serum içermeyen ortamda sürekli veya aralıklı olarak hücrelerin kültleşmesi gibi alternatif protokollerin araştırılmasına yol açmaktadır. Nörosfer kültürleri hala GBM tümörlerinin moleküler özelliklerini ve tümörijenik potansiyeli korumak için en doğrulanmış ve giderek daha popüler bir yaklaşımdır3,4,11-14, bu nedenle yaklaşımımız önce nörosfer kültürlerini denemektir, hayvan modellerinde kullanılabilecek GBM tümörlerinin temsilini artırmak için uzun süreli kendi kendini yenileyen nörosferler oluşturamayan GBM hücrelerini kültleme için alternatif yöntemleri birlikte test ederken ( Şekil1). Burada GBM'lerden nörosferleri kültleme protokolü sunuyoruz. Nörosfer oluşturamayan hücreler için, büyüme ortamında basit bir değişiklik gösteriyoruz, çünkü tümörosfer olmayan hücrelerden GBM'ler oluşturan, umut verici sonuçlar veren ve hala kapsamlı doğrulamadan geçen ilk girişim olarak basit bir değişiklik gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>DMEM / F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin - EDTA 0.05%</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Hank ' s Dengeli Tuz Çözeltisi, kalsiyum ve magnezyum içermeyen</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14170-120</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Kalsiyum ve magnezyum içeren Dengeli Tuz Çözeltisi&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip 4</td><td>Worthington</td><td>5004188</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin İnhibitörü</td><td>Sigma</td><td>T7659</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>N2 Takviyesi (100x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumundan Albümin, hücre kültürü sınıfı</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin Reaktif Çözeltisi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik/Antimikotik</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Lenfolit-Fare</td><td>Cedarlane Laboratories Ltd.</td><td>CL5031</td><td></td></tr><tr><td>Geri Kazanım Hücre Kültürü Dondurma Ortamı Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Steril Hücre Süzgeci, 40 &mu; m</td><td>Balıkçı</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Fosfat Tamponlu Salin (DPBS), kalsiyum ve magnezyum içermez</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke, %0.4Yaşam</td> <td>Teknolojileri</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Nötr Tamponlu Formalin</td><td>Protokolü</td><td>245-684</td><td></td></tr><tr><td>Histoplex Doku Kasetleri</td><td>Termo Bilimsel</td><td>22-146-426</td><td></td></tr><tr><td>Döndürücü</td><td>Miltenyi BioTec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX ve nbsp; Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Stem Pro Neural Supplement&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A1058-01</td><td></td></tr></tbody></table>

klinik olarak İlgili hayvan modellerinde ve 3d İmmün entrikalarda kullanılmak Üzere cerrahi Örneklerden yüksek dereceli glioma hücre kültürünün optimizasyonu

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Astrositomların en yaygın ve agresif formu olan glioblastomalar, tedaviye refrakter ve moleküler olarak heterojendir. Ebeveyn tümörlerinin genomik profilini koruyan hücre kültürlerini, hastaya özgü in vitro ve in vivo modellerinde kullanılmak üzere oluşturabilme yeteneği, her tümörün moleküler özelliklerine göre uyarlanmış glioblastoma için yeni tedavilerin preklinik gelişiminde devrim yaratma potansiyeline sahiptir.
Tek hücrelere ayrışmış taze yüksek dereceli astrositoma tümörleri ile başlayarak, nörosfer testini, nöral kök hücre belirteçlerinin ekspresyonu, uzun süreli kendini yenileme in vitrove ortotopik ksinograft tümörleri oluşturma yeteneği de dahil olmak üzere kanser kök hücre fenotipini sunan hücreler için bir zenginleştirme yöntemi olarak kullanıyoruz. Bu yöntem daha önce önerildi ve şimdi birkaç araştırmacı tarafından kullanılıyor. 125 glioblastoma örneğini ayrıştırma ve kültleştirme deneyimimize dayanarak, burada sunduğumuz ayrıntılı protokole ulaştık, yüksek dereceli astrositomaların rutin nörosfer kültleme ve preklinik çalışmalar için tümörojenik hücrelerin büyük ölçekli genişlemesi için uygun. Bu protokolü kullanarak başarılı uzun vadeli kültürlerin verimliliği hakkında rapor veriyoruz ve nörosfer olarak büyümeyen ayrışmış glioblastoma hücrelerini kültleme için uygun fiyatlı alternatifler öneriyoruz. Ayrıca immünostokimya için nörosferler 3D mimarisini korumak için bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. GBM'lerin moleküler imzalarını ve heterojenliğini koruyan ortotopik ksinograft modelleri üretebilen CSC'lerde zenginleştirilmiş hücre kültürleri, GBM'lerin biyolojisinin incelenmesi ve potansiyel tedavilerin klinik öncesi testlerinin geliştirilmiş tasarımı için giderek daha popüler hale gelmektedir.

Yukarıda açıklanan protokolü, onaylanmış hasta onayı ile ve kurumsal yönergeler altında 125 taze cerrahi glioblastoma örneği (Şekil 1), 88 yeni tanı konmuş ve 37 tekrarlayan tümör (Tablo 2) ile ayrıştırmak ve kültüre etmek için uyguladık. Uzun vadeli nörosfer kültürleri kurma protokolünün verimliliği % 41,6 ve yeni teşhis edilen tümörler ve tekrarlayan tümörler için benzerdi (Tablo 2). Bazı GBM örnekleri için, nörosferler ilk birkaç gün içinde oluşur (Şekil 1B ve 1C), diğerleri için daha uzun kültleme süresi gereklidir (Şekil 1D ve 1E).
Nörosfer oluşumunun verimliliği, her ikisi de nörosfer kültürü kazandıran Protokol 1 ve 2'ye göre işlenen yüksek hücre yoğunluğuna (GBM1) ve tekrarlayan ve nekrotik tümörden (GBM2) elde edilen sonuçlarla örneklendir edildiği gibi, sadece dokudaki nekroz seviyesine bağlı değildi (Şekil 2).
İmmün olarak bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde her nörosfer kültürünün tümörojenik potansiyelinin test edilmesi, CSC'lerin zenginleştirilmesi için bu yaklaşımın çok önemli bir doğrulamasıdır. Daha önce açıklanan18, GBM1 ve GBM2 nörosferlerine benzer bir protokol kullanılarak, kurumsal ve IACUC hayvan bakım yönergeleri altında, bağışıklık sistemi baskılanmış farelerin beyinlerine implante edilmiştir. Ksenograft tümörleri, beyin parankim ve nekroza invazyon gibi GBM'lerin morfolojik özelliklerini sunar (Şekil 2).
GBM3 ayrıştı (Şekil 1A) ve nörosfer ortamında kültürlendi (Şekil 1D ve 1E) ve% 2 FBS / NMGF (Şekil 1D, 1G ve 1H). %2 FBS/NMGF'de kültürlenen monolayer hücreler ve NMGF'de kültürlenen nörosfer hücreleri ayrıştırıldı ve Şekil 2'dekiyleaynı prosedür kullanılarak çıplak fareye aynı sayıda hücre yerleştirildi. İki preimplant kültür yöntemi arasında sağkalım, tümör büyüme dinamikleri veya morfolojide farklılık gözlenmedi (Şekil 3A-C). Tümör büyüme özellikleri test edilen en son pasaj, nörosferler için P20 ve% 2 FBS / NMGF için P10'a kadar değişmez. Sox2 de dahil olmak üzere nöral kök hücre belirteçleri% 10 FBS 3,4,11'de kültürlenen çoğu birincil GBM hücresinde küçültülürken, % 2 FBS ile desteklenmiş NMGF, Sox2 ekspresyonunun tutulmasına izin verir (Şekil 3D).
Nörosferler Protokol 4'e göre işlendi ve H&E (Şekil 4A), anti-Sox2 antikoru, nükleer lokalizasyon (Şekil 4B) ve EGFR antikoru, hücre zarı lokalizasyonu (Şekil 4C)ile etiketlendi. Bu protokol nestin, GFAP ve çoğalma işareti Ki6711ifadesinde uyaranlara bağlı değişikliklere erişmek için uygulanmıştır.
Tablo 2. GBM'lerden uzun süreli kendi kendini yenileyen nörosfer kültürlerini türetmenin verimliliği.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>patoloji</td>
			<td>n</td>
			<td>Uzun süreli kendini yenileyen nörosferler sağlayan örneklerin yüzdesi (n)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma - tedavi edilmemiş, ilk ameliyat</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma - tekrarlayan</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
<tr>
<td>toplam</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
</tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg"> Şekil 1. Taze glioblastoma cerrahi örneklerinden hücre kültürü. Taze tümörler enzmatik olarak tek hücreye ayrışır. Yoğunluk ayırma ortamından çekirdeklenmiş hücre arayüzü daha sonra NMGF ile kaplanır. Ayrışmış nörosferler NMGF'de kaplanır ve genellikle kaplamadan 1 gün sonra ölü hücreler, döküntüler, bağlı tek hücreler ve süspansiyondaki hücrelerin bölünmesi (A). Nörosfer oluşumu bazı vakalar için daha hızlıdır (B,C) ve diğerleri için daha yavaştır (D,E). Tüm nörosferler en az 10 pasaj için ayrıştırilir ve yeniden tabaklanır, % 41,6 GBM'ler uzun süreli kendi kendini yenileyen nörosferler verir. Nörosfer (F) olarak büyümeyen canlı GBM ayrışmış hücreler alternatif kültür koşullarına aktarılabilir, örneğin% 2 FBS / NMGF (G, H). Çubuk (A), 100 μm, tüm görüntüler için geçerlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg"> Şekil 2. Nörosfer üretimi ve GBM tümörlerinden ortotopik fare ksinograftları. Protokol 1 ve 2'ye göre yüksek hücre yoğunluğu (GBM1) ve yüksek nekrotik içeriğe (GBM2) sahip bir tümör örneği ayrıştırıldı ve nörosferler 1 ve 2 nolu protokollere göre 10 pasaj için kültürlendi. İmmün sistemi baskılanmış farelere 3 x 105 ayrışmış nörosfer hücresi yerleştirildi ve moribund olduğunda kurban edildi. Fare beyinleri, insan belirteçlerinin, insan mitokondrilerinin (hMit) veya büyük histocompatibility sınıfı I alt birasının (MHC-I) H&E lekeleme ve immünofizyokimya tespiti için sabit ve parafin gömülü olarak sabitlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg"> Şekil 3. NMGF'de nörosfer veya %2 FBS/NMGF'de monolayer olarak kültürlenen GBM3 hücreleri ile intrakranially implante edilen farelerde benzer tümör büyümesi. (A) NMGF'de nörosferler veya %2 FBS/NMGF'de monolayer olarak kültürlenmiş GBM3 için Kaplan-Meier sağkalım eğrileri (her iki geçiş <10) sağkalımda hiçbir fark göstermez (n=10, p=0.7174, log-rank testi). (B) Canlı biyolüminesans görüntüleme (BLI) ile izlenen tümör büyümesi, iki grup arasındaki tümör büyüme dinamiklerinde anlamlı bir fark göstermez. (C) Tümör morfolojisi 4 GBM3 ksinograft, 2 kültür NMGF ve 2 kültürlü 2% FBS / NMGF için ayırt edilemez. Şekil 2için açıklandığı gibi MHC-I lekesi . Ölçek, 600 μm. (D) Kök hücre üreticisi Sox2 ekspresyonunu gösteren batı lekesi, ksinograft tümörlerini(A-C)başlatmak için kullanılan% 2 FBS / NMGF kültürlerinde tutulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg"> Şekil 4. İmmünohistokmiya ile nörosfer bölümlerinde protein ekspresyonunun analizi. Nörosfer kültürleri Prosedür 4'te açıklandığı gibi formalin sabit ve parafin gömülü ve H&E (A), anti-Sox2 antikor (B) ve anti-EGFR antikor (C) ile lekelenmiştir. DAB substratı görselleştirmek için kullanıldı (B,C). Bar, 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>

Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

Bu prosedürün genel amacı, yüksek dereceli astrositomların rutin nörosfer kültürlerini geliştirmek ve preklinik çalışmalar için tümörojenik hücrelerin büyük ölçekli ekspansiyonunu sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle taze tümör örneklerinin akut olarak disosiye edilmesi ve tekil hücrelerin kırmızı kan hücrelerinden ve döküntülerden ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, tümör hücreleri nörosferler gözlemlenene kadar büyüme faktörleri ile desteklenmiş nörosfer ortamında kültüre edilir.Nörosferler, in vivo deneyler ve moleküler karakterizasyon için kültüre edilebilir veya immünolojik karakterizasyon için formaldehit ile fikse edilip parafine gömülebilir. Nihayetinde, nörosfer kültürlerinin uzun süreli kendi kendini yenileme kapasitesi, ortotopik tümör oluşumu ve moleküler profillemesi değerlendirilebilir. %10 FBS içeren uzun süreli serum kültürleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu tekniğin orijinal tümörün moleküler ve genetik özelliklerini korumasıdır.Bu yöntem, klinik olarak ilgili araştırmalar için hastaya özgü glioblastoma hücre kültürlerinin ve hayvan modellerinin oluşturulmasına yönelik canlı bir tümör bankasının kurulmasını mümkün kılmaktadır. Bu modelin, malign glioma hastaları için terapötik testlerdeki etkileri aşikardır. Model, primer tümörü en yakın şekilde temsil eder ve preklinik bir ortamda terapötik testlerin yapılmasına olanak tanır.Bu yöntem yüksek dereceli gliomlar hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer insan ve hayvan tümörlerine de uygulanabilir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, uygun steril teknikler ve dikkat gerektirdiği ve uzun süreli hücre canlılığını desteklemek için çok sayıda adım içerdiği için zorluk yaşayacaktır. 3D histoloji yöntemine dair fikri ilk olarak, işaretli proteinlerin üstün hücre altı lokalizasyonu ve kesitlerin, tüm nörosferlerin işaretlenip görüntülenmesi veya hücrelerin disosiye edilmesi gibi daha yaygın yöntemlere kıyasla sağladığı avantajlar nedeniyle geliştirdik.Tespit, şeffaflaştırma, işleme ve gömme aşamalarının öğrenilmesinin zor olması nedeniyle, bu histoloji yönteminin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Tüm nörosferlerin reaktiflere yeterince maruz kaldığından ve morfoloji ile immünohistokimya için mevcut olan en iyi peletin elde edilebilmesi adına eşit şekilde işlendiğinden emin olmak için dikkatli olunmalıdır. 200 ila 500 miligram tümör örneği ile başlayarak, dokuyu ince parçalara ayırmak için bir bisturi ucu kullanın.Parçaları 10 mL besiyeri içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve ardından doku solüsyonunu karıştırmak için süspansiyonu birkaç kez altüst edin. Tümör parçalarının yerçekimiyle çökelmesini bekleyin ve ardından besiyerini uzaklaştırın. Besiyeri bulanıklaşmayana kadar tümör parçaları üzerindeki kalıntıları yıkamaya devam edin.Ardından, besiyerini uzaklaştırın. 0,5 gram karışık tümör örneği başına iki mililitre enzimatik doku disosyasyon çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi ters çevirerek nazikçe karıştırın. Doku çözeltisini, bir doku kültürü inkübatöründe, rotasyon altında 37 °C'de inkübe edin.30 dakika sonra, süspansiyonu iki mililitrelik bir pipetle üç kez aspire edin. Tümör çoğunlukla tek hücreli bir süspansiyon haline gelene kadar sindirildiğinde, enzimleri iki hacim durdurma çözeltisi ile durdurun ve hücre süspansiyonunu beş mililitrelik bir serolojik pipetle karıştırın. Şimdi, sindirilmemiş materyalleri 40 µm'lik bir hücre süzgeciyle süzün ve hücreleri oda sıcaklığında, 800 ×g'de beş dakika boyunca pelletleyin.Ardından, 10 mililitre besiyerinde üç kez yıkama yaptıktan sonra, nihai hücre peletini beş mililitre besiyerinde yeniden süspanse edin. Bu hücre süspansiyonunu beş mililitre lympho light M üzerine yavaşça katmanlar halinde ekleyin ve ardından hücre popülasyonlarını oda sıcaklığında 1300 ×g hızında 20 dakika boyunca ayırın. Şimdi, çekirdekli hücreleri içeren ara tabakayı, 10 mililitre besiyeri içeren 15 mililitrelik bir tüpe toplayın.Ardından hücreleri, büyüme faktörleri eklenmiş nöroküre (neurosphere) besiyerinde yeniden süspande edin ve 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründeki standart T 25 doku kültürü flasklarına mL başına 1x10⁵ hücreden daha az olacak şekilde ekleyin.Bir ila üç hafta içinde oluşan yüzer nörosferleri, onları yapışık hücrelerden ve döküntülerden ayırmak için taze bir flaska aktarın. Nörosferleri immünohistokimya ile analiz etmek için önce nörosferleri çöktürün, ardından pelletlemiş olan tabakayı rahatsız etmemeye dikkat edin. Süpernatantı uzaklaştırın ve tüpe 10 mililitre DPBS ekleyin.Ardından DPBS'yi uzaklaştırın, peleti %10 nötr tamponlu formalin içinde yeniden süspande edin ve hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Steroidleri tekrar çöktürdükten sonra, onları bir dizi etanol inkübasyonunda yeniden süspande edin. İkinci %95 etanol inkübasyonundan sonra, hücreler parlak, beyaz ve yoğunlaşmış hale gelene kadar PHE'yi mutlak etanol ile yeniden süspande edin.Ardından, lens kağıdından küçük bir koni yapın. Bunu bir beher içindeki küçük bir huninin içine yerleştirin ve lens kağıdını absolut alkol ile ıslatın. Peleti taze %100 etanol ile hafifçe gevşetin ve ardından fazla alkolü dökün.Küreleri, uç kısmına kadar ulaştıklarından emin olarak lens kağıdı konisine dökün ve tüpü ek mutlak etanol ile durulayın. Kalan tüm steroidleri lens kağıdı konisinden dökün ve ardından koniyi huniden çıkarın. Daha sonra, steroidlerin mümkün olduğunca güvenli bir şekilde kapatıldığından emin olarak lens kağıdını kare şeklinde katlayın ve paketlenmiş nörosferleri bir kasede aktarın.Şimdi kaseti otomatik bir doku işlemciye yerleştirin ve işlemciyi çalıştırın. Ardından kaseti çıkarıp bir parafin gömme sisteminin ısıtılmış kısmına yerleştirin. Yüzeyin parçacıklardan, tozdan veya diğer kalıntılardan arındırıldığını doğruladıktan sonra, penslerdeki tüm parafini ısıtma kuyucuklarına sifonlayın.Ardından, parafin içermeyen temiz bir pens setini ısıtın ve ısıtılmış bir taban kalıbına az miktarda parafin ekleyin. Şimdi paketi kasetten çıkarın ve gömme sisteminin ısıtılmış kısmına yerleştirin. Küreler görünür hale gelene kadar kağıdı dikkatlice açın.Materyalin mümkün olduğunca fazlasını toplamak için ön ısıtmalı pensleri kullanın ve ardından sferoidleri taban kalıbındaki sıvı parafine aktarın. Topaklanmış bölgeleri dikkatlice açın ve sferoidleri köşelerden uzaklaştırarak merkezde homojen bir tabaka oluşturun. Sferoidi sabitlemek için taban kalıbını soğutma alanına taşıyın.Son olarak, kaseti ekleyin ve yavaşça parafinle doldurun. Kaset tamamen soğuduğunda, nörosfer parafin bloğu tabloda açıklandığı şekilde immünohistokimya için kesite ayrılabilir. Toplamda 88 yeni tanı konmuş ve 37 nüks eden tümörden uzun süreli nörosfer kültürleri oluşturmak için bu protokolün etkinliği, hem yeni tanı konmuş tümörler hem de nüks eden tümörler için benzer şekilde %41,6 idi.Bazı glioblastoma örneklerinde, nörosferler ilk birkaç gün içinde oluşurken diğerleri için daha uzun kültürleme süresi gerekmiştir. Nörosfer oluşum verimliliği, yüksek hücre yoğunluğuna sahip yeni tanı konmuş bir tümör ile hem belirtildiği şekilde işlenen hem de her nörosferin tümörjenik potansiyelini test eden rekürren ve nekrotik bir tümörden elde edilen sonuçların örneklendirdiği üzere, dokudaki nekroz seviyesine münhasıran bağlı değildi. İmmünokompromize farelerdeki kültürleme, kanser kök hücrelerinin zenginleştirilmesine yönelik bu yaklaşımın kritik bir doğrulamasıdır.Bu deneyde, iki farklı glioblastoma nörosfer kültürü immün yetmezliği olan farelerin beyinlerine implante edilmiştir. Ksenogreft tümörler; beyin parankimine invazyon ve nekroz gibi glioblastomalara özgü morfolojik özellikler göstermiştir. Bu deneyde, nörosfer oluşturmayan hücreler %2FBS ile desteklenmiş nörosfer ortamında kültüre edilmiş ve bu alternatif ortamdaki hücrelerin tümör oluşumları incelenmiştir.Glioblastoma ile karşılaştırıldığında, nude fare alıcılara ksenogreft olarak nakledilen nörosfer kültürleri değerlendirildi. İki ön ekim kültürü yöntemi arasında sağkalım, tümör büyüme dinamikleri veya morfoloji açısından herhangi bir fark gözlemlenmedi.SOX2 dahil olmak üzere nöral kök hücre belirteçleri, %10 FBS içeren ortamda kültüre edilen çoğu primer glioblastoma hücresinde azalırken, %2 FBS ile desteklenen nörosfer ortamında büyütülen glioblastoma hücreleri, az önce gösterilen işlemden sonra SOX2 ekspresyonunu korumaktadır. Bu deneyde, nükleer lokalizasyonu göstermek için nörosferler H&amp;E ve anti-SOX2 antikoruyla, hücre membranı lokalizasyonunu göstermek için ise epidermal büyüme faktörü antikoruyla işaretlenmiştir. Ortaya çıkan görüntülerden anlaşılacağı üzere, gösterilen yöntem nörosferlerin 3D mimarisini korurken protein ekspresyonu ve post-translasyonel modifikasyonların analizini optimize etmektedir. Uzmanlaşıldığında, bu doku disosiyasyon tekniği doğru şekilde uygulandığında yaklaşık iki saatte tamamlanabilir. Prosedür uygulanırken, cerrahi işlem ile disosiyasyon arasındaki zaman aralığının yanı sıra yüksek derece gliomların heterojen moleküler kompozisyonunun sonuçları etkileyebileceğini hatırlamak önemlidir.Hayvan modellerinde orijinal tümörü yeniden oluşturmak amacıyla intrakraniyal implantasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Klinik olarak anlamlı bir ortamda preklinik testlere olanak tanıyan bu teknik, nöro-onkoloji alanında devrim yaratmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, uzun süreli nörosferlerin nasıl geliştirileceği ve sürdürüleceği ile moleküler analizler için formaldehitle tespit edilmiş ve parafine gömülmüş nörosferlerin nasıl üretileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.İnsan dokusuyla çalışmanın son derece riskli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman kullanımı ve uyumlu ancak potansiyel olarak tehlikeli ajanlara karşı önlemler gibi tedbirler her zaman alınmalıdır.

optimization-high-grade-glioma-cell-culture-from-surgical-specimens

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Malign gliomalar, farklı klinik ve moleküler özelliklere sahip heterojen bir yüksek infiltive glial neoplazm grubunu oluşturur. Primer ortotopik ksinograftlar preklinik hayvan modellerinde malign glioma alt tiplerinin histopatolojik ve moleküler özelliklerini rekapitulate eder.

Primer Ortotopik Glioma Xenografts Infiltratif Büyüme ve İsocitrat Dehidrogenaz I Mutasyonu Rekapitulate

Biz, tümörün büyüme sırasında oynayan normal biyo-fiziksel kısıtlamalar tekrarıdır intravital iki foton mikroskopi için farelerde kortikal glioblastoma ortotopik bir model oluşturduk. Tümörün yukarıdaki kafatasını yerine bir kronik cam pencere, iki-foton mikroskobu ile zamanla tümörün ilerlemesinin takibini sağlar.

Ortotopik Glioblastoma Fare Modeli Beyin parankim fiziksel kısıtlamaları bakımı ve Intravital İki foton Mikroskopi için uygundur

Glioblastoma multiforme'nin hasta kaynaklı ksenogreftleri, 3D insan biyojel kültür sistemi kullanılarak canlı mikrotümörlere minyatürleştirilebilir. Bu in vivo benzeri 3D tümör testi, kinom analizi de dahil olmak üzere ilaç yanıt testi ve moleküler profilleme için uygundur.

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

3D kültürler yetiştirilen Neurospheres tümörü biyoloji eğitim için güçlü bir araç oluşturur. Burada parafin katıştırma üzerinden tümörü neurospheres 3D yapısını koruyarak immünhistokimya gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem, tümörü neurosphere özellikleri stemness ve sinirsel farklılaşma gibi karakterizasyonu sağlar.

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Lazer mikrodisesi ( LMD) glioma heterojenite ve invazyon aracılık yolları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek hassas ve son derece tekrarlanabilir bir tekniktir. Burada lazer LMD kullanarak glioma dokusundan ayrık alanları izole etmek ve ardından transkripsiyonanalizi yapmak için optimize edilmiş bir protokol tanımlıyoruz.

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Burada glioblastoma için kullanımı kolay bir istila çıktısını tanımlıyoruz. Bu töz glioblastoma kök benzeri hücreler için uygundur. İstilanın, göçün ve çoğalmanın kolay ölçülmesi için bir Fiji makrosu da tanımlanmıştır.

Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Bir fare modelinde floresan etiketli demir oksit nanopartiküllerinin glioblastoma tümör iletiminin iki foton mikroskobu için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Bir Murin Modelinde Glioblastomun İki Fotonlu İntravital Mikroskobu

IDH1-mutant diffüz düşük dereceli gliomlar kültüre edilmesi zor olan nadir tümörlerdir. IDH1 mutant protein ekspresyonunu koruyan ve kültürleri aylarca sürdüren basit, enzimatik olmayan bir eksplant yöntemi sunuyoruz. Daha da önemlisi, bu teknik dondurularak saklanmış tümörlerle çalışır ve glioma araştırmaları için değerli bir kaynak sunar.

IDH1-mutant Diffüz Düşük Dereceli Gliomların Eksplant Kültürleri için Bir Protokol

Bu protokolün amacı, araştırmacılara intrakraniyal implantasyonlar için son derece tekrarlanabilir bir teknik sunmaktır.

Farelerde glioblastoma hasta kaynaklı ksenograft hücre hatlarının stereotaktik intrakranial implantasyonu

Biyopotansiyel sürekli ölçümü için kullanılan piyasada bulunan telemetri vericileri implantasyonu için cerrahi tekniği (tek-lead EKG), serbestçe hareket eden farelerde kalp hızı, çekirdek vücut sıcaklığı ve lokomotor aktivite gösterilmiştir. Öneriler ve kurtarma iyileştirilmesi, post-operatif bakım ve ağrı kesici protokolleri, refahı ve hayatta kalma oranı da sunulmaktadır.

EKG, Nabız, Core Vücut Sıcaklığı ve Serbest hareket eden Laboratuar Fare Etkinlik Veri Verimli Radiotelemetry Vericiler implantasyonu

Keşfedin, yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinden nörospher kültürü optimizasyonunu ve 3D immünohistokimya için parafin gömme tekniğini. Bu yöntem, kanser kök hücre benzeri hücreleri zenginleştirir ve preklinik araştırmalar için hasta özgü glioblastoma modelleri oluşturur.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu (Video) | JoVE Journal

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Daha fazla video keşfet