Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Bu prosedürün genel amacı, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme için standart bir iki foton mikroskobunu hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle lazerlerin ayarlanmasını içeren mikroskobun hizalanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, mükemmel ışın şekli ve ışın dizilimi elde etmek için ışın çoklayıcı hizalanır.

Çok ışınlı tarama durumunda, ham görüntüler numunenin çizgili aydınlatma deseniyle taranmasıyla elde edilir. Son olarak, yüksek çözünürlüklü nihai görüntüyü hesaplamak için bir algoritma uygulanır. Nihayetinde, çizgili aydınlatma mikroskobisi, farelerin lenf düğümlerindeki germinal merkezlerdeki bağışıklık sistemi davranışının detaylarını göstermek için kullanılır; bu detaylar daha önce canlı içi (intra vital) mikroskopi ile erişilemez durumdaydı.

Bu tekniğin yapılandırılmış aydınlatma veya lokalizasyon mikroskobisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, canlı örneklerde yüksek doku derinliklerinde uygulanabilmesidir. Lazer ışını şeklinin herhangi bir modifikasyon gerektirmemesi, yöntemin çok basit kalmasını ve herhangi bir çok fotonlu mikroskoba uygulanmasını kolaylaştırır. Çok ışınlı iki fotonlu çizgili aydınlatma mikroskobisi için kullanılan düzenek, en düşük fotobeyazlama seviyesi ve en hızlı görüntüleme ile optimal çözünürlük ve kontrast kalitesine ulaşmak için burada gösterilmiştir.

Metin protokolünde belirtildiği şekilde kurulumda ayarlamalar yapmayı değerlendirin. Ayarlamaları yaptıktan sonra, ışının, prizma tabanlı darbe sıkıştırıcısının sonundaki giriş aynasının hemen üzerinde bulunan aynaya geri döndüğünü kontrol edin. Işık yolu buradan itibaren ayarlandıktan sonra, ışın ışın çoklayıcıya yansıtılır.

Tarayıcı kapalıyken çok foton mikroskobisi ile çok ışınlı şerit aydınlatma yapılacaksa; sahneye homojen floresan veren bir numune yerleştirerek ve lazer ışınını numunenin içine, ancak üst yüzeye yakın bir yere odaklayarak ışın çoklayıcıdaki aynaları hizalayın. Objektifin ön lensine yakın bir konuma odaklayın.

Mikroskobu çoklu demet moduna getirin, demet sayısını ve polarizasyonu seçin. Örneğin, floresan lamı görüntüleyerek lazer demetini bulmak için P, P panjuru açık konuma getirilsin ve demete odaklanırken CCD kamera sürekli çalıştırılarak demetin merkez konumda olduğu onaylansın. P demeti hizalandığında, demet anahtarı 64 demet moduna getirilsin ve ilgili panjur açılsın.

Işının konumunu kontrol edin. Birinci ile beşinci ışın çoklayıcı aynaları ayarlayarak, ışık noktalarının eşit uzaklıkta olduğundan emin olun. Çizgili aydınlatma algoritmaları bu varsayıma dayandığı için, homojen floresan örneği heterojen yapılı olanla değiştirin.

Örneğin, Conval alan kök örneğini alın ve çok ışınlı bir görüntü taraması yapın. Görüntünün net, homojen ve düz göründüğünü kontrol edin. Heterojen örneği homojen örnekle değiştirin.

Tarama işlemini kontrol etmek için XY tarayıcıyı başlatın. Çok ışınlı tarama için çizgili görüntü uyarma deseni oluşturmak üzere, Y tarayıcı aynasını ışıklandırılan ışın hattına dik olacak şekilde hareket ettirin.

Dikdörtgen şeklinde çizgili bir görüntü oluşturmak için, burada blok kaydırma olarak adlandırılan X tarayıcı aynasını hareket ettirerek, burada blok sayısı ile belirtilen oluşturulmuş deseni tekrarlayın. Heterojen örneği geri yerleştirin ve tarayıcıyı ana tetikleyici olarak kullanın. Çizgili görüntüleri tekrar tekrar elde etmek için, çizgili bir görüntüyü otomatik olarak yakalayıp kaydetmek üzere kamerayı tarayıcı ile senkronize edin.

Yeterli tekrar adım sayısını, kaydırma miktarını ve uygun adım uzunluğunu seçerek X tarayıcı aynasını farklı konumlara taşıyın. İki ardışık şeritli görüntü arasındaki kaydırma adımı, iki ardışık ışın genişliği arasındaki mesafeyi kapsayacak şekilde ayarlanmalıdır. X kaydırmasını, verilen uyarım dalga boyundaki lateral çözünürlük sınırının altındaki bir değere ayarlayın.

Örneğin, her kaydırma başına X tarayıcı aynasının 10 adımı ve 12 veya 13 kaydırma kullanımı en iyi uzaysal çözünürlüğü sağlar. Konval alan görüntüsü en net hale gelene kadar bu iki değeri optimize etmek için konval alan kök lam sonuçlarını kullanın. Konvansiyonel CCD görüntüleri ve hesaplanmış çizgili aydınlatma görüntüleri üzerinde çizgi profili aracını kullanın.

Bu örnekte konval hücre duvarlarından gelen floresan sinyali olan hat profillerinin genişliğini karşılaştırın. Her bir ham çizgili görüntüyü tarayıcı hareketiyle senkronize ederek edinin ve bunları ayrı ayrı, örneğin TIFF veya ikili dosyalara kaydedin. Yüksek çözünürlüklü çizgili aydınlatma görüntüsünün iki boyutlu bir matrisini oluşturmak için, ham çizgili görüntülerden oluşan tam seti değerlendirme rutini içinde matrisler olarak açın.

Derin dokuda çizgili aydınlatmalı, çok ışınlı, çok fotonlu mikroskopi gerçekleştirmek için daha önce ayrıntılı olarak açıklanan minimum maksimum algoritmasını veya Fourier dönüşümü tabanlı bir algoritmayı kullanın. Canlı organizmalarda, farklı doku derinliklerinde zamanla çizgili görüntüler elde edin ve germinal merkez, B hücreleri ve foliküler dendritik hücreler arasındaki dinamik etkileşimin yüksek çözünürlüklü 3B bir filmini oluşturmak için bunları daha önce açıklanan şekilde değerlendirin. Efektif nokta yayılım fonksiyonunun boyutları, bir mikroskobun uzaysal çözünürlüğüne karşılık gelir.

Bu üç boyutlu fonksiyonu, lipoprotein lenf düğümlerinde ya kolajen liflerinin ikinci harmonik üretimi sinyalini ya da 515 nanometre dalga boyunda yayan 100 nanometrelik polistiren boncukların floresan sinyalini elde ederek ölçtük. Çok huzmeli çizgili aydınlatmalı T-P-L-S-M sistemimizi; CCD kameralar aracılığıyla alan tespiti yapan T-P-L-S-M ve nokta tespiti yapan T-P-L-S-M gibi yerleşik iki foton lazer tarama mikroskopisi teknikleriyle karşılaştırdık. Bu ölçümlerden, numunenin yüzeyinde hem lateral hem de aksiyel çözünürlüklerin, difraksiyon teorisi tarafından öngörülen beklenen değerlerle örtüştüğü açıkça görülmektedir.

Ancak, görüntüleme derinliğinin artmasıyla ve dolayısıyla yüksek derecede değişen kırılma indislerine sahip ortam üzerinden hem uyarılma hem de emisyon radyasyonlarının optik yolunun uzamasıyla, kullanılan düzeneğe bağlı olmaksızın uzamsal çözünürlük önemli ölçüde bozulur. Görüntüleme derinliğinden bağımsız olarak M-B-S-I-T-P-L-S-M kullanarak, standart T-P-L-S-M yaklaşımlarına kıyasla yaklaşık %20 daha iyi lateral çözünürlüğe ve %220 daha iyi aksiyal çözünürlüğe ulaştık.

Yetişkin farelerin sekonder lenfoid organlarındaki immün yanıt sırasında B hücrelerinin klonal seçilimi, bellek B hücrelerine veya plazma hücrelerine farklılaşma yolundaki ilk adımdır. Bu süreçte, germinal merkezlerdeki immün kompleks yapılar düzeyinde foliküler dendritik hücreler ve B hücreleri arasındaki oldukça dinamik etkileşimin merkezi bir rol oynadığına inanılmaktadır. Hücresel iletişimi ve bunun immün yanıt üzerindeki etkilerini analiz etmek, ancak yüksek çözünürlüklü intra-vital mikroskopi teknolojisi kullanılarak mümkündür; burada foliküler dendritik hücreler üzerinde anti CD 2135 FAB ATO five 90 ile işaretlenmiş hali görülmektedir.

M-B-S-I-T-P-L-S-M, popal lenf düğümlerinin germinal merkezlerinde 120 micron derinliğe kadar olan immün kompleks çökelti kümelerinin boyutlarının ilk kez canlı olarak görüntülenmesi ve nicelendirilmesi imkanını sunmaktadır. Bu görüntüler, bir germinal merkezdeki immün kompleks çökelitilerinin geleneksel PMT tabanlı sistem ve M-B-S-I-T-P-L-S-M ile elde edilen 3D floresan görüntülerinin doğrudan karşılaştırmasını göstermektedir. Ayrıca, immün kompleks çökelitilerinin germinal merkez B hücreleri ile olan etkileşimleri yüksek çözünürlükte belirlenebilmiş olup artık proliferasyon, diferansiyasyon veya apoptoz için kullanılan intra vital fonksiyonel problarla kombine şekilde incelenebilmektedir.

Bu prosedürü uygularken, kamera tespitine dayalı bir teknikle görüntüleme hızının yaklaşık sekiz kat daha yüksek olduğunun, ancak maksimum görüntüleme derinliğinin standart bir fotomultiplier tabanlı çok fotonlu mikroskoba göre yaklaşık %25 daha düşük olduğunun göz önünde bulundurulması önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra; mikroskop ışık yolunun ayarlanması, ışınlatma plakalarının hizalanması, tarama parametrelerinin hesaplanması ve nihai yüksek çözünürlüklü görüntünün hesaplanma yöntemleri dahil olmak üzere, çok odaklı mikroskobunuzu çizgili aydınlatma yöntemiyle çalıştırmak için nasıl kuracağınız konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. İntravital derin doku deneyleri için.