Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Bu deney, geçici baskın seçime dayalı modüler ve hızlı bir yöntemle floresan etiketli rekombinant EO virüsleri üretir. İlk olarak, sentezlenmiş minimal homoloji bölgelerinin yanı sıra metabolik ve floresan seçimi için belirteçlerle çevrili bir floresan etiketi içeren bir rekombinant vektör oluşturun. Bu rekombinasyon vektörünü enfekte olmuş hücrelere aktarın ve metabolik seleksiyon ve floresan kullanarak rekombinant virüsler için çoğaltın.

Ardından, işaretleyici kaseti çıkarmak için metabolik seçimi çıkarın ve rekombinant virüsler içeren hücreleri floresan işaretleyici ile izole edin. Seleksiyon. Hücre tek katmanları üzerindeki viral plakların sonuçları, floresan etiketli genin karakteristiği olan bireysel virüs parçacıklarının görselleştirilmesine izin verir. Bu yöntemi, etiketten bağımsız olarak tekrar tekrar ve evrensel olarak kullanılabilecek bir seçim yöntemi kullanarak çoklu genetik modifikasyonlara sahip rekombinant virüsler oluşturmak istediğimiz için geliştirdik.

Geçici baskın seçilim ilkesi daha önce tanımlanmış olsa da, genomik modifikasyonlar yapmada bize daha fazla esneklik sağlamak için bunu daha büyük bir ölçekte ve modüler bir şekilde uygulamak istedik. Rekombinant viral plak taraması ve izolasyonu zor olabileceğinden, bu yöntemin görsel bir gösterimi kritik öneme sahiptir. Sıklıkları düşük olabilir ve bu nedenle virüsün verimli bir şekilde kurtarılması için bazı benzersiz yöntemler gereklidir.

Bu nedenle, proteinin N veya C terminalinde ilgilenilen viral bir gen olarak etiketlendi. Buna göre, 150 baz çifti uzun yan homoloji bölgesini tanımlayın. Ardından, 150 baz çifti sol ve sağ kolları içeren, tercih edilen bir çift kısıtlama bölgesi ile ayrılmış bir oligonükleotid dizisi tasarlayın.

Ayrıca, TDS vektörüne dahil edilmeye izin vermek için bu bölgeyi, ilk çiftten farklı olan ikinci bir kısıtlama alanı çifti ile çevreleyin. Sentezlendikten sonra, şimdi kısıtlama bölgelerine sahip oligonükleotidin istenen yerleştirme bölgesi ile çerçeve içinde olacak şekilde tasarlandığını doğrulayın. Oligonükleotid sentezi için, sol ve sağ kollar arasında bulunan kısıtlama bölgelerinin olduğundan emin olun.

Tercih edilen floresan etiketinin açık okuma çerçevesini çevreleyenleri eşleştirin. PCR ile floresan etiketinin her iki tarafına da aynı kısıtlama bölgelerini dahil edin. Sentezlenen parçayı TDS vektörüne klonlayın.

Ayrıca, sol ve sağ kol arasındaki kısıtlama bölgelerini kullanarak floresan etiketini elde edilen rekombinasyon vektörüne klonlayın. Homoloji bölgeleri. Tek katmanlı BSC tek hücrelerini vaccinia virüsü ve serum içermeyen medya ile enfekte edin.

Enfeksiyondan bir saat sonra. Serum serbest ortamda üçe bir oranında rekombinasyon, vektör plazmid ve transfeksiyon reaktiflerinin bir karışımı ile ECCO'ların modifiye edilmiş kartal ortamı transfect'i ile hücreleri kurtarın. 24 saat sonra, fetal sığır serumu içermeyen DMEM'deki hücreleri kazıyın ve kurtarın.

Açık hücreleri kırmak ve tek tek plakların yeterli şekilde ayrılmasını sağlamak için virüs parçacıklarını serbest bırakmak için hücreleri üç serbest çözülme döngüsüne tabi tutun. BSC tek hücrelerinin% 100 birleşen hücre tek katmanlarını, virüs partiküllerinin hazırlanmasının seri dilüsyonları ile enfekte edin. Sıvı% 10 FBS ve DMEM artı GPT seçimi, reaktifler ile kaplayın ve 24 saat inkübe edin.

Sıvı kaplamayı aspire edin ve plakları aramak için bir floresan mikroskobu kullanın. TDS vektöründen M kirazının virüse dahil edilmesine karşılık gelen dağınık kırmızı floresan sergiler. Hedef gene ve seçilen floresan etiketine bağlı olarak, etiket geninin lokalize floresansı aynı kırmızı plakta da gözlenebilir.

Şimdi her rekombinant virüs için birden fazla plak seçmek için, pipet ucuyla kazıyın ve DMEM içeren 100 mikrolitre% 5 FBS ile hücreleri bir einor tüpüne aktarın. Kazınmış hücrelerin üç tur donarak çözülmesini gerçekleştirin. Rekombinant virüsleri serbest bırakmak için.

Donmuş çözülmüş virüs içeren DMEM'i tek katmanlı bir hücreye ekleyin. Büyüme ortamındaki GPT seçim reaktifleri ile rekombinant virüsleri çoğaltmak için 12 oyuklu bir plakada. Daha sonra, başarılı bir şekilde amplifiye edilmiş plakların bir plak tahlili için enfeksiyondan 24 saat sonra başarılı amplifikasyonları kazıyın, kırmızı floresan C iki altı, tek katmanlı bir BSC bir hücre ile iyi oynanmıştır.

Rekombinant virüslerin seri seyreltmesini gerçekleştirin ve enfeksiyondan bir saat sonra FBS serbest DME M1'de artan bir virüs seyreltmesi ile kuyuları enfekte edin. Sıvı ortamı çıkarın ve enfeksiyondan üç gün sonra tam minimal esansiyel ortamda her bir kuyucuğu %0,5 agros ile kaplayın. Hem kırmızı hem de seçilen floresan etiketinin rengi olan floresan gösteren plakaları seçin.

GPT seçimi olmadan bunları tekrar yükseltin. Dağınık kırmızı floresansını kaybetmiş plakları seçin, ancak tercih edilen etikete karşılık gelen lokalize floresansı koruyun. M kirazı ve GPT seçim genlerini kaybetmiş, ancak seçilen etikete karşılık gelen lokalize floresansı koruyan saf bir rekombinant virüs stoğu elde etmek için seçim yapmadan plak saflaştırmaya devam edin.

Benzer bir plak fenotipine sahip tüm plakları hedefleyen bir plak tahlili ile stokların saflığını değerlendirin. Test viral stoklarını tek katmanlı bir BSC tek hücresinde çoğaltın. Enfeksiyondan 24 saat sonra, enfekte olmuş hücreleri 250 mikrolitre DMEM santrifüjüne kazıyın.

Supernat'ı çıkarın ve hücreleri parçalamak için TE tampon girdabında 500 mikrolitre% 0.1 SDS'de hücre peletini yeniden süspanse edin. Daha sonra 500 mikrolitre fenol, kloroform, izoamil alkol ekleyin ve santrifüjü karıştırmak için ters çevirin. Üst fazı hasat edin ve ekstraksiyonu tekrarlayın.

Daha sonra DNA'yı sulu tabakadan çökeltmek için bir mililitre soğutulmuş,% 100 etanol ve 50 mikrolitre sodyum asetat ekleyin. Ters çevirerek karıştırın ve numuneyi gece boyunca eksi 20 santigrat dereceye yerleştirin. DNA'yı santrifüjleme ile peletledikten sonra, tüm sıvıyı çıkarın ve DNA peletini havayla kurutun ve yeniden canlandırın.

50 mikrolitre TE tamponunda askıya alın. Viral yerleştirme için PCR taraması yapmak için bu genomik DNA şablonunu kullanın. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi birden çok etikete sahip rekombinant virüsler oluşturun.

Bu rekombinant vaccinia virüsleri, sırasıyla iç virüs çekirdeğinin ve dış zarfının bir parçası olan viral yapısal proteinler, A üç ve F 13'ü hedef alan floresan belirteçlerle etiketlenmiş proteinleri eksprese eder. Virüs partiküllerini görselleştirmek için virion lokalize proteinlere karşılık gelen genler seçildi. A üç, vaccinia virion'un çekirdek proteinidir ve F 13, viral bir zarf proteinidir.

Hem floresan olarak etiketlenmiş A üç hem de F 13'e sahip çift etiketli bir virüs, çift etiketli bir virüsle gerçek zamanlı floresan mikroskobu da gösterilebilir. Bu durumda, vaccinia virüsünün iç çekirdek proteini. A üç kırmızı ile etiketlenmiştir ve dış zarf proteini F 13 yeşil ile etiketlenmiştir.

Virüs fabrikasından gelen sarılmamış virüs parçacıkları kırmızı renkte görüntülenir ve sarılmış virion, kırmızı ve yeşil kanalların kolokalizasyonu ile temsil edilir. Rekombinant vektörler ve vaccinia virüs genomu arasındaki rekombinasyon etkinliklerini belirlemek için kantitatif analiz kullanıldı. Vektörlerin vaccinia virüsü genomu ile homolog rekombinasyonunun etkinliği, 70 baz çifti kadar düşük homoloji bölgesi ile tespit edilebilir.

Bu yöntem, birden fazla floresan etiketli ve/veya birden fazla gen delesyonlu virüsler oluşturmak için kullanılmıştır. Bunlar, virüsün enfeksiyöz yaşam döngüsünün, viral proteinlerin konak savunma sistemlerini yıkmadaki rolünün ve ayrıca konak sinyalleme süreçleriyle etkileşimlerin incelenmesinde kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kullanılan etiketlerde modüler, istenen rekombinantları çözmede titiz ve çeşitli araştırma bağlamlarında uygulanabilir bir yöntem kullanarak rekombinant aşı virüslerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.