Name: Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Öğrenin, geçici baskın seçim yöntemiyle floresan etiketli rekombinant vaksinia virüsleri üretmeyi. Bu modüler protokol, genetik mühendisliği ve viroloji araştırmalarında çoklu genetik modifikasyonlar için esneklik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi Federasyon Keşif Projesi hibe #1096623 tarafından finanse edildi.

1. Rekombinasyon Vektörü Oluşturma
<ol><li>N veya C-terminally ilgi çekici geni etiketlemek için gereken 150 bp uzunluğundaki homoloji bölgelerini (sol ve sağ kollar olarak adlandırılır) tanımlayın (Bkz. Şekil 1b).</li>
	<li>Tercih edilen bir çift kısıtlama bölgesi ile ayrılmış 150 bp sol ve sağ kollardan oluşan bir oligonükleotid dizisi tasarlayın. Tüm bu dizi, sentezlendikten sonra TDS vektörüne dahil edilmesine izin vermek için ikinci bir kısıtlama sitesi çifti (ilk çiftten farklı) tarafından da kuşatılmalıdır. Oligonükleotid'i, dizilerin istenen ekleme sitesiyle çerçevede olduğu kısıtlama siteleriyle tasarlarken dikkatli olun.</li>
	<li>Sentez için oligonükleotid tasarlarken sol ve sağ kollar arasındaki kısıtlama sitelerini dahil edin, bu da tercih edilen floresan etiketin açık okuma çerçevesini kuşatanlarla eşleşmelidir (bkz. Şekil 1b). NotI kısıtlama sitesini sol kol ile floresan etiketin başlangıcı arasında üç amino asit bağlayıcı olarak kullanmak mümkündür.</li>
	<li>Bu kısıtlama sitelerini PCR ile floresan etiketinin her iki tarafına da dahil edin (bkz. Şekil 1c).</li>
	<li>Sentezlenen parçayı TDS vektörüne klonla.</li>
	<li>Floresan etiketi, homolojinin sol ve sağ kol bölgeleri arasındaki kısıtlama alanlarını kullanarak ortaya çıkan rekombinasyon vektörüne klonlama (bkz. Şekil 1d).</li>
</ol>2. Rekombinant Virüs Üretimi
<ol><li>Şekil 2'yegöre, BS-C-1 hücrelerinin monolayerini serumsuz ortamda vaksinia virüsü ile enfekte edin, Enfeksiyon Çokluğu (MOI) > 1.</li>
	<li>Enfeksiyon sonrası 1 saat, Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) ile kurtarma hücreleri ve serumsuz ortamda 3:1 oranında rekombinasyon vektör plazmid ve transfection reaktif karışımı ile transfect.</li>
	<li>24 saat sonra, DMEM'de fetal sığır serumu (FBS) içermeyen hücreleri kazıyın ve kurtarın ve açık hücreleri kırmak ve virüs parçacıklarını serbest bırakmak için üç donma-çözülme döngüsü gerçekleştirin.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi% 10 FBS DMEM ve GPT seçim reaktifleri mikhenolik asit (25 μg / ml) ve ksantin (250 μg / ml) sıvı kaplaması ile bir plak analizi gerçekleştirin:<ol>
<li>BS-C-1 hücrelerinin monolayer ile 6 kuyulu bir plaka tohum.</li>
		<li>Tek tek plakların yeterli ayrılmasını sağlamak için% 100 birleştiği hücre monolayerlerini, virüs parçacıkları içeren dondurularak çözülmüş hücrelerin seri seyreltmeleriyle enfekte edin.</li>
		<li>GPT seçim reaktiflerini içeren DMEM içeren sıvı% 10 FBS ile kaplama - sırasıyla 25 μg / ml ve 250 μg / ml nihai konsantrasyonlarda mikophenolik asit ve ksantin.</li>
	</ol></li>
	<li>24 saat kuluçkadan sonra, sıvı kaplamayı çıkarın ve mCherry'nin TDS vektöründen virüse dahil edilmesine karşılık gelen dağınık kırmızı floresan gösteren plakları aramak için floresan bir mikroskop kullanın. Hedef gen ve seçilen floresan etiketine bağlı olarak, etiketli genin lokalize floresanları da aynı kırmızı plakta görülebilir.</li>
	<li>Hücreleri bir Eppendorf tüpüne aktarmak için bir pipet ucu ve DMEM içeren% 5 FBS'nin 100 μl'si ile lokalize kazıma yaparak her rekombinant virüs için birden fazla plak seçin, ardından rekombinant virüsleri serbest bırakmak için kazınmış hücrelerin üç tur dondurularak çözülmesi.</li>
	<li>Büyüme ortamlarındaki GPT seçim reaktifleri ile rekombinant virüsleri güçlendirmek için 12 kuyulu bir plakadaki tek katmanlı hücrelere dondurarak çözülmüş virüs içeren DMEM'i ekleyin. Başarılı amplifikasyonları 24 saat sonra enfeksiyon kazıyın.</li>
	<li>Kırmızı floresan sergileyen başarıyla yükseltilmiş plakların bir plak testini gerçekleştirin, bu kez agarose kaplama ve GPT seçimi ile aşağıdaki gibi:<ol>
<li>BS-C-1 hücrelerinin monolayer ile 6 kuyulu bir plaka tohum.</li>
		<li>Rekombinant virüslerin seri seyreltilmesini gerçekleştirin ve FBS içermeyen DMEM'de artan bir virüs seyreltme ile kuyuları enfekte edin.</li>
		<li>Enfeksiyon sonrası 1 saat, sıvı ortamı çıkarın ve GPT seçim reaktifleri ile birlikte% 2.5 FBS, 292 μg / ml L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve 100 μg / ml streptomisin içeren minimum esansiyel ortamda (MEM)% 0.5 agarose ile her kuyuyu kaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Enfeksiyon sonrası 2-3 gün, hem kırmızı hem de seçilen floresan etiketin rengini gösteren floresan gösteren plakları tekrar yükseltmek için seçin, bu sefer GPT seçimi olmadan.</li>
	<li>Bir sonraki plak testini, seçimsiz bir agarose kaplama ile gerçekleştirin.</li>
	<li>Dağınık kırmızı floresanlarını kaybetmiş plakları seçin, ancak tercih edilen etikete karşılık gelen lokalize floresanları koruyun.</li>
	<li>mCherry ve gpt seçim genlerini kaybetmiş ancak seçilen etikete karşılık gelen lokalize floresanları koruyan saf bir rekombinant virüs stoğu elde etmek için hiçbir seçim yapmadan plak saflaştırmaya devam edin. Kontrol stokları plak testine göre saftır, tüm plaklar benzer bir plak fenotipine sahip olmalıdır.</li>
	<li>Viral stokların saf olduğundan emin olmak için genomik DNA'nın PCR taramasını kullanın.<ol>
<li>Floresan gen ekleme bölgesini kuşaten astarlar ve eklenen floresan geninin kendisini güçlendiren astarlar tasarlayın. Bu astarların farklı kombinasyonları, gen yerleştirmeyi algılayacak ve saflığı gösterecek PCR ampliconları üretecektir.</li>
		<li>BS-C-1 hücrelerinin 12 kuyu plakalı monolayerinin bir kuyusunda PCR olarak taranacak viral stokları güçlendirin.</li>
		<li>Enfeksiyon sonrası 24 saat, enfekte hücreleri 250 μl DMEM'e kazıyın.</li>
		<li>Santrifüj enfekte hücreler (10 dk, 4 °C için 18.000 x g), %0,1 (v/v) SDS ile 500 μl TE'de (10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA, pH 8) süpernatant ve resüspend hücre peletini çıkarın. Girdap'dan Iyse hücrelerine.</li>
		<li>Karıştırmak için ters çevirin, 500 μl fenol-kloroform-izoamil akohol ekleyin. Santrifüj (4 dk, 4 °C için 18.000 x g). Üst saltanayı al ve tekrar et.</li>
		<li>Karıştırmak için ters çevirin, 1 ml 100% etanol (soğutulmuş) ve 50 μl sodyum asetat ekleyerek süpernatant üzerinde bir etanol çökeltisi gerçekleştirin.</li>
		<li>Gece boyunca -20 °C veya 1 saat boyunca -80 °C'de bırakın. Santrifüj (30 dk, 4 °C için 18.000 x g), tüm sıvıyı çıkarın ve çökemiş DNA'nın havayla kurumasını bekleyin. 50 μl TE'de yeniden dirildi.</li>
		<li>Bunu genomik DNA PCR taraması için bir şablon olarak kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Birden Fazla Etiket Taşıyan Rekombinant Virüslerin Üretimi
<ol><li>Çift veya üç etiketli virüsler oluşturmak veya Protokol 1'den prosedürü tekrarlamak için floresan rekombinant virüslerle aynı hücre monolayerini farklı bir etiketle coinfect edin.</li>
	<li>Virüsleri plak fenotipine veya virüs izole genomik DNA'sının PCR taramasına dayanarak arındırın.</li>
</ol>

<ol><li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventures+with+poxviruses+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Adventures with poxviruses of vertebrates.</a> FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).</li>
<li>Goebel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Complete+DNA-Sequence+of+Vaccinia+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus.</a> Virology. 179, 247-266 (1990).</li>
<li>Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide-sequence+of+42+kbp+of+vaccinia+virus-strain+WR+from+near+the+right+inverted+terminal+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat.</a> J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).</li>
<li>Roberts, K. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+morphogenesis+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus morphogenesis and dissemination.</a> Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).</li>
<li>Gammon, D. B., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3+%27-to-5+%27+Exonuclease+Activity+of+Vaccinia+Virus+DNA+Polymerase+Is+Essential+and+Plays+a+Role+in+Promoting+Virus+Genetic+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The 3 '-to-5 ' Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination.</a> J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).</li>
<li>Yao, X. D., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DNA+structure+and+homology+length+on+vaccinia+virus+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination.</a> J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).</li>
<li>Ward, B. Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. Isaacs, S. N. 16, Humana Press. 205-218 (2004).</li>
<li>Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Poxvirus+Vectors+Have+Capacity+for+at+Least+25%2C000%5BTitle%5D)+AND+%22Base-Pairs+of+Foreign+DNA.+Gene%22%5BJournal%5D)">Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000.</a> Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).</li>
<li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep-etch+EM+reveals+that+the+early+poxvirus+envelope+is+a+single+membrane+bilayer+stabilized+by+a+geodetic+%26%2334%3Bhoneycomb%26%2334%3B+surface+coat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic &#34;honeycomb&#34; surface coat.</a> J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).</li>
<li>Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+host+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Poxvirus host cell entry.</a> Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).</li>
<li>Ward, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+characterization+of+the+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+intracellular+mature+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions.</a> J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).</li>
<li>Carter, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+cores+are+transported+on+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus cores are transported on microtubules.</a> J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).</li>
<li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).</li>
<li>Rodriguez, J. F., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+size+phenotype+as+a+selectable+marker+to+generate+vaccinia+virus+recombinants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants.</a> J. Virol. 63, 997-1001 (1989).</li>
<li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+on+the+basis+of+plaque-formation%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation.</a> Gene. 158, 157-162 (1995).</li>
<li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+-+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus - a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).</li>
<li>Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+vectors+utilizing+the+beta-galactosidase+assay+for+rapid+selection+of+recombinant+viruses+and+measurement+of+gene-expression%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression.</a> Gene. 47, 193-199 (1986).</li>
<li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia-coli+gpt+gene+provides+dominant+selection+for+vaccinia+virus+open+reading+frame+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors.</a> J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).</li>
<li>Liu, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+%28Tian-Tan+strain%29+expressing+hepatitis-B+virus+surface-antigen+by+using+beta-galactosidase+as+a+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+China+Ser.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker.</a> Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).</li>
<li>Domínguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+expressed+by+a+recombinant+vaccinia+virus+permits+early+detection+of+infected+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).</li>
<li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).</li>
<li>Cordeiro, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F11-Mediated+Inhibition+of+RhoA+Signalling+Enhances+the+Spread+of+Vaccinia+Virus+In+Vitro+and+In+Vivo+in+an+Intranasal+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection.</a> Plos One. 4, (2009).</li>
<li>Jensen, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+major+membrane+and+core+proteins+of+vaccinia+virus+by+two-dimensional+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis.</a> J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).</li>
<li>Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+Fine-Structure+of+a+Vaccinia+Virus+Gene+Encoding+an+Envelope+Antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen.</a> J. Virol. 58, 757-764 (1986).</li>
<li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">An improved cyan fluorescent protein variant useful for.</a> 22, 445-449 (2004).</li>
<li>Shu, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells%2C+Tissues%2C+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> Plos Biol. 9, (2011).</li>
<li>Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+recombinant+poxviruses+using+a+compact+GFP-blasticidin+resistance+fusion+gene+for+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection.</a> J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).</li>
<li>Broder, C. C., Earl, P. L. 62, 173-197 (1997).</li>
<li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vaccinia+virus+formation+and+cell-to-cell+virus+transmission+are+prevented+by+deletion+of+the+gene+encoding+the+37%2C000-dalton+outer+envelope+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein.</a> J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).</li>
<li>Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+Navigating+the+subcellular+space%3A+Lessons+from+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Transport%2C+Assembly+and+Egress%22%5BJournal%5D)">Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus.</a> Viral Transport, Assembly and Egress. Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. , Research Signpost. 155-177 (2011).</li>
<li>Jeshtadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Poxvirus+Intracellular+Mature+Virion+Proteins+with+the+TPR+Domain+of+Kinesin+Light+Chain+in+Live+Infected+Cells+Revealed+by+Two-Photon-Induced+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy.</a> J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).</li>
<li>Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+N-WASP+exchange+limits+the+extent+of+ARP2%2F3-complex-dependent+actin-based+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility.</a> Nature. 458, (2009).</li>
<li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid%2C+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).</li>
<li>Dénes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+oncolytic+Vaccinia+viruses+for+non-invasive+optical+imaging+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors.</a> Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+Potentiates+Vaccinia-Induced+Actin+Polymerization+to+Facilitate+Viral+Spread%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread.</a> Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).</li>
<li>Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-viral+imaging+of+vaccinia+virus+using+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy.</a> J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).</li>
<li>Horsington, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A36-dependent+Actin+Filament+Nucleation+Promotes+Release+of+Vaccinia+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
</ol>

Çıkar çatışması bildirilmedi.

Bu teknik, floresan etiketli viral proteinleri ifade eden rekombinant virüslerin oluşturulması için etkili ve modüler bir protokolü açıklar. Yöntem, viral genomdaki tek değişikliğin, geride seçim işareti bırakmadan bir etiket veya işaretleyici eklenmesi olmasını sağlar. Homolog rekombinasyon için gereken kısa kol uzunluğu, doğrudan sentezini sağlar, pcr ve klonlamanın birkaç zaman alıcı turunu ortadan kaldırırken, mCherry ve metabolik GPT seçiminin floresanları viral rekombinasyon aralarını izole etmek için kullanılır. Bu ara ürünler, seçimin kaldırılmasını takiben, etiketli bir gene sahip bir virüse veya ebeveyn tipine geri çözülebilir. Hem floresan hem de metabolik seleksiyon kullanımını içeren benzer bir yöntem daha önce27 olarak tanımlanmıştır, ancak bu çalışmada kullanılan yöntem homolojinin daha kısa, sentezlenmiş bölgelerini kullanarak, ilgi çekici etiketli genin floresanını görüntüleyerek istenen rekombinant virüsün tanımlanmasını sağlar. Bu ikincil seçim sadece bir plak testinde yeterli floresan üreten yüksek oranda ifade edilen viral genlerin etiketlenmesi için geçerlidir. Alternatif olarak, örneğin güçlü bir viral promotör altında floresan bir protein gibi tam bir ifade kasetinin yerleştirilmesini öngörebilirim. Bu durumda sol ve sağ kollar etiketlenecek viral gen yerine ekleme noktasını tanımlar.
Deneysel prosedür sırasında yararlı olduğu kanıtlandı bazı önemli adımlar vardır. Yukarıda açıklanan adım 2.3.3'teki sıvı kaplama, kırmızı/yeşil floresan plakların tespiti ve izolasyonu için çok önemli olduğunu kanıtladı. GPT seçim reaktifleri ve agarose kaplamasının kombinasyonunun rekombinant virüslerin büyümesini caydırdığını ve bu nedenle transfeksiyondan sonra virüsleri güçlendirmenin ilk adımı için sıvı bir kaplamaya geçtiğini inanıyoruz. Sol kol rekombinasyonundan kaynaklanan ara ürünler, sol kolda da bir promotör dizisi içeriyorsa plaklarda gözlenen yaygın floresan ile sonuçlanabileceğinden, zenginleştirme ve saflaştırma için lokalize etiket rengi floresan gösteren floresan plakların seçimi de önemlidir. TDS vektöründeki mCherry işaret geni de gfpile değiştirilebilir , örneğin, mCherry'nin floresan etiketi olarak kolayca birleştirilmesine ve seçilmesine izin vermek için.
Yukarıda açıklanan bazı teknikler, rekombinant vaksinia virüsü oluşturmanın yerleşik yöntemlerinden biraz farklılık gösterir. Örneğin, rekombinant oluşturmak için kullanılan virüsün MOI'si normalde1 28'den azdır , ancak daha yüksek MOI'lerin kullanımı bu yöntemle rekombinant vaksinia virüsünün oluşturulması için yeterli olmuştur. GPT seçim reaktiflerinin kullanımı normalde hücrelerin seçim reaktifleri18ile önkökasyonunu gerektirir , ancak enfeksiyon sonrası kurtarma aşamasında eklenmesi, özellikle floresan seçim işaretleyicisinin varlığı nedeniyle hala istenen rekombinantların yeterli seçimini sağladı.
Daha önce de belirtildiği gibi, bu tekniğin sınırlamalarından biri, ikincil floresan seçim adımının, bir plak testinde gözle algılanmasını sağlayan bir düzeyde, ilgi çekici etiketli proteinin yüksek oranda ifade edilmesine dayanmasıdır. Bu olmadan, sadece mCherry floresan sergileyen virüsleri arındırmak mümkün olacaktır, bunlardan en az% 50'si, yukarıdaki adım 2.12'de açıklanan PCR gibi moleküler stratejilerle tanımlanabilecek istenen rekombinant virüsleri içerecektir. Diğer bir sınırlama, etiketlemelerinin bir sonucu olarak bazı proteinlerin inaktivasyonu olabilir. Floresan etiketi mutasyona uğrayabilir veya zaman içinde geçen rekombinant virüs tarafından eksantasyona uğrayabilir. Bu nedenle rekombinant virüs stoklarının mikroskopi ve PCR ile düzenli örneklemesi önerilir. Son olarak, tek bir virüse dahil edilebilen floresan etiketli proteinlerin sayısının bir sınırı olabilir. Bunun bir yönü, hepsini aynı anda görselleştirme yeteneğidir; mevcut floresan etiketlerin emisyon spektrumunun çakışan doğası göz önüne alındığında, minimum spektral kanama sağlamak için bunları dikkatlice seçmek önemlidir. Ek olarak, GFP ve Cerulean gibi yakından ilişkili etiketlerin kullanılması, rekombinant genomdaki konumlarına bağlı olarak ikisi arasında yeniden birleştirme olasılığını açar.
Bu tekniğin modüler yapısı, floresan etiketlerin diğer boyama ve/veya etiket seçenekleriyle uyumluluğa dayalı olarak basit bir şekilde değiştirilmesini sağlar. Seçilebilir belirteçleri uyararak, TDS yöntemi çeşitli floresan proteinlerin seri olarak eklenmesine veya fenotipik analizler için TDS tabanlı gen silme ile TDS tabanlı etiketlemenin kombinasyonuna izin verir29. Bu yaklaşımın yararı için bir örnek olarak, virüs çekirdeklerini ve WV zarını etiketleyen çift etiketli bir floresan virüs oluşturuldu. Bu virüsle yapılan görüntüleme çalışmaları, virüs replikasyon sırasında virüsün hareketini, morfogenezini ve sarılmasını incelemek için kullanılabilir. Henüz keşfedilmemiş vaksinia viral proteinleri de bu teknikle etiketlenebilir ve incelenebilir.
Vaksinia virüsü, canlı hücreli mikroskopiye elverişli olan virüsün birçok özelliği nedeniyle görüntüleme çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Floresan etiketler viral genomdan ifade edilir, transfeksiyon ihtiyacını ortadan kaldırır, enfekte hayvanlardan veya dönüştürülemez hücrelerden elde edilen birincil hücrelerin kolayca analiz edilmesine olanak tanır. Başlangıçta, floresan VACV'ler virüs hareketinin basit hücre altı takibi için kullanıldı30, ancak daha yeni yaklaşımlar FRET çalışmaları31, tek virüs parçacıklarında FRAP32, promotör muhabirleri33, intravital görüntüleme34ve yapısal çalışmalar35-37'yi içerecek şekilde yardımcı programını genişletti. Tüm bu teknikler, rekombinant floresan virüsler oluşturma yöntemi ile birlikte daha kolay ve daha yakın ulaşılabilir olabilir.

Vaksinia virüsü (VACV) prototipik poksvirüstür ve çiçek hastalığının etken maddesi olan variola virüsü ile oldukça ilişkilidir. Bu virüslerin her ikisi de maymunpox ve ektromelia virüsü (mousepox)1gibi diğer önemli patojenleri içeren ortopedi cinsinin üyeleridir. Ortopediksler, tahmin edilen 200 açık okuma çerçevesinin2,3'ünekadar kodlayan büyük çift iplikli DNA genomlarına (180-220 kb) sahiptir. Bu virüslerin replikasyonu, olgun virüslerin (MV) yapıldığı bir perinükleer virüs fabrikasının ve MV'nin bir alt kümesinin sarılmış virüsler (WV) oluşturmak için iki ek membran edindiği trans-Golgi ağının oluşumunu içerir (Roberts ve Smith4tarafından incelenmiştir). Ortopedik genomlar, VACV genom replikasyonunun bir özelliği olan ve viral DNA polimeraz5tarafından aracılık edilen yüksek derecede genetik rekombinasyon nedeniyle genetik manipülasyona oldukça elverişlidir. Rekombinant virüslerin üretilmesi, vaksinia virüslü hücrelerde rekombinasyona aracılık etmek için yeterli olan 12 bp kadar küçük homologlara sahip homolog rekombinasyon ve doğrusal DNA moleküllerine dayanır6. Vaksinia virüsünün floresan etiketlemesi, virion başına birçok floresan proteinin birleştirilmesine izin veren ortopedik parçacıkların büyüklüğü nedeniyle son derece parlak virüs parçacıkları verebilir7. Vaccinia, yabancı DNA8'in büyük parçalarını taşıma kapasitesine sahiptir ve ayrıca, sert kapsid simetri eksikliği, endojen loci9'larındanviral protein gen füzyonlarını ifade ederken bir dereceye kadar esneklik sağlayabilir. VACV proteinlerinin floresan etiketlemesi, özellikle virüs girişi10, transport 11-13ve morfogenez, özellikle sarılmış virionlar7alanında, hücre altı düzeydekonak-patojenetkileşimlerinin incelenmesi için paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır.
Rekombinant virüsler zayıflatılmış büyüme fenotipi14,15, metabolik seleksiyon16-18veya bir işaret geninin ekspresy ekspresyasyonu ile seçilebilir (örneğin X-gal19 veya floresan protein13,20). Burada floresan ve metabolik seçimin güçlü bir kombinasyonunu kullanarak floresan virüslerin seçimini açıklıyoruz. Faulkner ve Moss (1990)21tarafından geliştirilen geçici baskın seleksiyon (TDS) vektörleri, işaretleyicilerin istenen floresan etiketli ilgi geni ile birlikte entegre edilmesine izin verir. Metabolik seleksiyon çıkarıldığında, seçim genlerini ekseren, ancak floresan etiketli virüs proteinini sağlam bırakan ikincil bir rekombinasyon olayı meydana gelebilir. Aşağıdaki Şekil 2 deneysel prosedüre genel bir bakış sunmaktadır. Bu çalışmada kullanılan seçim genleri mCherry ve Escherichia coli guanine fosforibosyltransfeaz(gpt)genidir, her ikisi de sentetik erken / geç viral promotörden ifade edilir ve daha önce Cordeiro ve ark. 22 Ek olarak, ilgi çekici etiketli füzyon proteininin floresan vardır. Metabolik seçim kaldırıldığında, seçilebilir belirteçler (mCherry ve gpt) çıkarılır, sadece doğru rekombinant virüslerin tanımlanmasına izin veren etiketli genin floresanını bırakır. Seçim işaretleyicilerinin eksizyonu, birden fazla floresan etiketi birleştirme imkanı sağlar ve aynı anda birkaç viral proteini floresan olarak etiketleme yeteneğine sahip virüsler oluşturmamızı sağlar. Önceki çalışmalar, vaksinia virüslü hücrelere transklüzyona bulaşan doğrusal ve dairesel DNA moleküllerinin vaksinia rekombinasyonu için minimum homoloji gereksinimlerinibelirlemiştir 6. Gpt-mCherry TDS vektöründeki farklı homoloji uzunluklarındaki kanatlanma kollarının rekombinasyon verimliliklerini vaccinia viral genomuna dahil edilmesi yoluyla belirlemek istedik. TDS vektöründeki 100 bp'lik homolog bölgelerin, homolog rekombinasyon ile rekombinant DNA'nın VACV genomuna yerleştirilmesini hedeflemek ve aracılık etmek için yeterli olduğu belirlenmiştir (Şekil 4). Daha küçük homoloji uzunlukları da rekombinasyona olanak sağlarken, 100 bp homoloji uzunlukları metabolik ve floresan seçimle kolayca tanımlanabilecek yeterli rekombinant virüs sağladı. Bu büyüklükteki DNA parçaları nispeten düşük maliyetle ticari olarak sentezlenebilir ve rekombinant virüslerin oluşturulması için birden fazla vektörün üretimini büyük ölçüde kolaylaştırır. Yan bölgelerin oligonükleotid dizisinin sentez maliyetlerini düşük tutarken daha fazla rekombinasyon sıklığı sağlamak için homoloji uzunluğunu 150 bp'ye çıkarmayı tercih ettik.

<table><tbody><tr><td>Mikofenolik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3536-50MG</td><td>0.1 N NaOH</td></tr><tr><td>Ksantin</td> içinde çözün <td>Sigma-Aldrich</td><td>X0626-5G</td><td>0.1 N NaoH</td></tr><tr><td>FuGENE HD transfeksiyon reaktifi</td><td>Promega</td><td>E2311</td> <td>içinde çözün ve nbsp;</td></tr><tr><td>Chroma filtreli floresan mikroskobu 31001, 31002</td><td>Olympus, Chroma</td><td>BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

floresan etiketli vaksinia virüs proteinlerinin verimli Üretimi için metodoloji

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Viral proteinlerin floresan proteinlerle etiketlenmesi, virüs konak etkileşimleri anlayışımızı ilerletmek için vazgeçilmez bir yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır. Çiçek hastalığının yok edilmesinde kullanılan canlı aşı olan Vaksinia virüsü (VACV), büyük virion büyüklüğü ve genom seviyesinde mühendislik kolaylığı nedeniyle floresan canlı hücreli mikroskopiye özellikle elverişlidir. Burada rekombinant virüsler üretmek için optimize edilmiş bir protokol bildiriyoruz. Yapı oluşturmanın basitleştirilmesine izin veren vaksinia replikasyonu sırasında hedeflenen homolog rekombinasyon için minimum gereksinimler belirlendi. Bu, geçici baskın seçimin (TDS) floresan bir muhabir ve metabolik seçim ile ittifakının, floresan olarak etiket viral proteinlere hızlı ve modüler bir yaklaşım sağlamasını sağladı. Floresan rekombinant virüslerin neslini kolaylaştırarak, virüs replikasyonu sırasında ortaya çıkan virüs ana bilgisayar etkileşiminin birçok yönünün gelişmiş görüntüleme analizi gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştırabiliyoruz.

Şekil 1, bu yordam için gerekli olan ve sentezlenen (Şekil 1b ve 1c) veya klonlama adımlarıyla oluşturulan çeşitli yapıları listeler (Şekil 1d). Şekil 2, seçim sürecinin her adımı için gösterilen bir A3-GFP rekombinant VACV'nin temsili floresan plak görüntüleri ile deneysel prosedürün bir taslağını sağlar. Şekil 3'te, sırasıyla iç virüs çekirdeği23 ve dış zarf24'ünbir parçası olan viral yapısal proteinler A3 ve F13'ü hedefleyen floresan belirteçlerle etiketlenmiş proteinleri ifade eden rekombinant vaksinia virüsleri gösterilmiştir. Oluşturulan rekombinant virüslerin her biri için viral plakların ve enfekte hücrelerin gözlemleri tasvir edilir. Vektörlerin VACV genomuna homolog rekombinasyonunun verimliliği test edilmiş ve sonuçlar Şekil 4'tetasvir edilmiştir. 100 bp homoloji içeren vektörlerle rekombinasyondan yapılan viral plakların tanımlanmasının göreceli başarısı, 150 bp uzunluğundaki sol ve sağ homoloji kollarını hedef gen haline sentezlemeyi seçmenin arkasındaki nedendi.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> Şekil 1. Geçici Dominant Seçim (TDS) rekombinasyon vektörü. (a) GPT ve mCherry seçim işaretleyicileri ile TDS vektörü. (b) Homolojinin sol ve sağ kolları, homoloji kollarının arasında ve yanında belirli kısıtlama bölgeleri ile tasarlanmıştır. Bu yöntemde kullanılan sol ve sağ kollar arasındaki kısıtlama bölgeleri NotI ve BamHI, NotI sitesi de gen ve floresan etiketi arasında bir bağlayıcı olarak kullanılmaktadır. (c) Bu yöntemle uyumlu floresan etiketler ilgili kısıtlama siteleri tarafından kuşatıldı. Kullanılan bazı etiketler GFP (yeşil floresan protein), RFP (kırmızı floresan protein), Cerulean (EKFP üzerinde bir gelişme, bir camgöbeği floresan proteini, haline yönlendirilmiş mutagenezi25tarafından) ve aydınlatma26'daEM tarafından çözülebilir bir ürün oluşturan GFP'den tasarlanmış bir floresan protein olan mini SOG'dir. (d) Son TDS rekombinasyon vektörün üretilmesinde rol oynayan adımları klonlama. Sol ve sağ yan kolları içeren sentezlenmiş oligonükleotid ilk olarak TDS vektörüne klonlanır. Bu, sol ve sağ kollar arasında bulunan kısıtlama sitelerine klonlanarak herhangi bir seçim etiketinin içeri ve dışarı mekik dokuyabileceği bir rekombinasyon vektörü sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> Şekil 2. Rekombinant vaksinia virüsü oluşturmak için deneysel prosedürün ana hatları. Genetik ve hücresel düzeyde meydana gelen olaylar, A3-GFP etiketli floresan vaksinia virüsünün oluşturulmasını takip eden adımları özetleyen temsili plak görüntüleri ile birlikte tasvir edilir. (A) Vaksinia virüsü ile enfekte olan hücreler TDS rekombinasyon vektörü ile transkriptörlenir. (B) Bu şekilde, yalnızca sol rekombinasyonun sonucu gösterilmiştir ve örnek GFP'yi tercih edilen floresan etiketi olarak kullanır. Sağ el rekombinasyonu, tüm TDS plazmidinin genoma benzer şekilde dahil edilmesine neden olur, ancak etiket ara adımda, yani C adımında tüm hedef genle kaynaşır. Rekombinasyon karışımı ile bir hücre monolayer üzerinde plak tahlili yapılır ve GPT seçimine tabi tutulur. (C) Sırasıyla mCherry ve GFP ekspresyonlarına karşılık gelen hem kırmızı hem de yeşil floresan sergileyen plaklar toplanır ve yükseltilir. Seçim kaldırıldıktan sonra, gpt ve mCherry genlerinin(D)kaybına karşılık gelen kırmızı floresan kaybı olacaktır ve sadece yeşil floresan sergileyen plaklar toplanır ve yükseltilir (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> Şekil 3. TDS rekombinasyon sisteminin temsili sonuçları. Görüntüler, 48 saat sonra(a, c, e; ölçek çubuğu 100 μm) hücreleri enfekte eden rekombinant VACV'nin tüm plaklarını, karşılık gelen rekombinant virüsün 8 saat sonra enfekte ettiği tek bir hücrenin görüntüsü eşliğinde(b, d, f; ölçek çubuğu 10 μm) tasvir eder. Virüs parçacıklarını görselleştirmek için virion lokalize proteinlere karşılık gelen genler seçildi. A3, vaksinia virionunun (a, b) çekirdek proteinidir ve F13 (c, d) viral bir zarf proteinidir. Hem floresan olarak A3 hem de F13 (e, f) etiketli çift etiketli bir virüs de gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> Şekil 4. Rekombinant vektörler ile VACV genomları arasındaki rekombinasyon verimliliklerinin nicel analizi. BS-C-1 monolayerleri VACV ile enfekte oldu ve VACV genomuna 500 bp, 100 bp veya 70 bp homoloji bölgeleri içeren üç rekombinasyon vektörü ile enfeksiyon sonrası 1 saat trans enfekte oldu. Her vektör ayrıca gpt ve mCherry seçim genlerinden oluşan TDS kasetini de içeriyordu. Hücreler enfeksiyondan 24 saat sonra kurtarıldı ve oluşan rekombinant virüsleri serbest bırakmak için lysed edildi. GPT seçim ortamı ile hücre lysates üzerinde plak tahlilleri yapıldı ve mCherry floresan gösteren plaklar başarılı rekombinantlar olarak sayıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> Şekil 5. Birden çok klonlama sitesini gösteren gpt-mCherry TDS vektörün haritası. Vektör daha önce22 olarak tanımlanmıştır ve vektör haritası Zhang Lab Group'tan (SCU) EZ Plasmid Map v1.9 yardımıyla oluşturulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>

Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Bu deney, geçici dominant seçime dayalı modüler ve hızlı bir yöntemle floresan işaretli rekombinant vaccinia virüsleri üretmektedir. İlk olarak, sentezlenmiş minimal homoloji bölgeleriyle çevrelenmiş bir floresan etiketin yanı sıra metabolik ve floresan seçim için belirteçler içeren bir rekombinant vektör oluşturun. Bu rekombinasyon vektörünü enfekte hücrelere transfekte edin ve metabolik seçim ile floresans kullanarak rekombinant virüsleri amplifiye edin. Ardından, belirteç kasetini çıkarmak için metabolik seçimi kaldırın ve floresan belirteç seçimi ile rekombinant virüsler içeren hücreleri izole edin. Hücre monokatmanlarındaki viral plak sonuçları, floresan işaretli gene özgü bireysel virüs partiküllerinin görselleştirilmesini sağlar.Bu yöntemi, etiketden bağımsız olarak tekrar tekrar ve evrensel olarak kullanılabilecek bir seçim yöntemiyle birden fazla genetik modifikasyona sahip rekombinant virüsler üretmek amacıyla geliştirdik. Geçici baskın seçimin prensibi daha önce tanımlanmış olsa da, genomik modifikasyonlar yaparken bize daha fazla esneklik sağlaması için bu yöntemi daha geniş bir ölçekte ve modüler bir şekilde uygulamak istedik. Rekombinant viral plak taraması ve izolasyonu zorlayıcı olabildiğinden, bu yöntemin görsel bir gösterimi kritik öneme sahiptir. Plakların sıklığı düşük olabilir ve bu nedenle virüsün verimli bir şekilde geri kazanılması için bazı özgün yöntemler gereklidir.Böylece, ilgilenilen viral geni proteinin N veya C terminusünde etiketleyin. Buna uygun olarak, 150 baz çifti uzunluğundaki flanke edici homoloji bölgelerini belirleyin. Ardından, seçilen bir restriksiyon bölgesi çifti ile ayrılmış 150 baz çiftlik sol ve sağ kolları içeren bir oligonükleotid dizisi tasarlayın. Ayrıca, sentezlendikten sonra TDS vektörüne entegrasyonuna olanak sağlamak için bu bölgeyi, ilk çiftten farklı olan ikinci bir restriksiyon bölgeleri çifti ile çevreleyin. Şimdi, restriksiyon bölgelerini içeren oligonükleotidin istenen ekleme bölgesiyle aynı çerçevede (in frame) olacak şekilde tasarlandığını doğrulayın. Oligonükleotid sentezi için, sol ve sağ kollar arasına yerleştirilen restriksiyon bölgelerinin, seçilen floresan etiketinin açık okuma çerçevesini çevreleyen bölgelerle eşleştiğinden emin olun. PCR yoluyla floresan etiketin her iki yanına aynı restriksiyon bölgelerini ekleyin. Sentezlenen fragmanı TDS vektörüne klonlayın. Ayrıca, sol ve sağ homoloji kol bölgeleri arasındaki restriksiyon bölgelerini kullanarak floresan etiketi ortaya çıkan rekombinasyon vektörüne klonlayın. Serum içermeyen ortamda bir BS-C-one hücre monokatmanını vaccinia virüsü ile enfekte edin.Enfeksiyondan bir saat sonra, hücreleri Dulbecco's modified eagle medium ile kurtarın. Rekombinasyon vektör plazmidi ve transfeksiyon reaktiflerini, serumsuz medyada üçte bir oranında bir karışımla transfekte edin. 24 saat sonra, fetal bovine serum içermeyen DMEM içinde hücreleri sıyırarak toplayın. Hücreleri parçalamak ve virüs partiküllerini serbest bırakmak için üç kez dondurma-çözme döngüsüne tabi tutun. Ardından, tekil plakların yeterli şekilde ayrımını sağlamak için, %100 konfluen BS-C-one hücresi monoton katmanlarını, virüs partikülleri preparasyonunun seri dilüsyonları ile enfekte edin. %10 FBS ve DMEM ile GPT seçici reaktifleri içeren sıvı ile üst katman oluşturun ve 24 saat boyunca inkübe edin.Sıvı üst tabakayı aspire edin ve virüse TDS vektöründen M-cherry entegrasyonuna karşılık gelen yaygın kırmızı floresan gösteren plakları aramak için bir floresan mikroskobu kullanın. Hedef gene ve seçilen floresan etikete bağlı olarak, aynı kırmızı plağın içinde etiket geninin lokalize floresansı da gözlemlenebilir.Şimdi, her rekombinant virüs için birden fazla plak seçin, pipet ucuyla kazıyın ve 100 µL %5 FBS içeren DMEM ile hücreleri bir Eppendorf tüpüne aktarın. Rekombinant virüslerin salınması için kazınan hücrelere üç döngü dondurma-çözdürme işlemi uygulayın.Rekombinant virüsleri, büyüme ortamındaki GPT seleksiyon reaktifleri ile amplifiye etmek için, dondurulup çözülmüş virüs içeren DMEM'i 12 kuyucuklu bir plakadaki hücre monokatmanına ekleyin. Ardından, enfeksiyondan 24 saat sonra başarılı amplifikasyonları kazıyarak toplayın. Kırmızı floresan sergileyen, başarıyla amplifiye edilmiş plakların plak analizi için, altı kuyucuklu bir plağa BS-C-one hücrelerinden oluşan bir monokatman ekleyin.Rekombinant virüslerin seri dilüsyonunu gerçekleştirin ve kuyucukları FBS içermeyen DMEM içindeki artan virüs dilüsyonları ile enfekte edin. Enfeksiyondan 1 saat sonra sıvı medyumu uzaklaştırın ve her kuyucuğun üzerine complete minimal essential medium içinde %0,5 agaroz ekleyin. Enfeksiyondan üç gün sonra, hem kırmızı hem de seçilen floresan etiketin renginde floresans gösteren plakları seçin.Bunları GPT seçimi olmadan tekrar amplifiye edin. Yaygın kırmızı floresansı kaybetmiş ancak seçilen etikete karşılık gelen lokalize floresansı koruyan plakaları seçin. M-cherry ve GPT seçim genlerini kaybetmiş fakat seçilen etikete karşılık gelen lokalize floresansı koruyan rekombinant virüslerin saf bir stokunu elde etmek için seçim yapmadan plak temizleme işlemine devam edin.Benzer plak fenotipine sahip plaklar elde etmeyi hedefleyerek, stokların saflığını bir plak deneyi ile değerlendirin. Test viral stoklarını bir BS-C-one hücre monokatmanında amplifiye edin. Enfeksiyondan 24 saat sonra, enfekte hücreleri 250 µL DMEM içerisine kazıyarak toplayın. Enfekte hücreleri santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini TE tamponundaki %0,1 SDS içeren 500 µL içerisinde yeniden süspande edin. Hücreleri liz etmek için vorteksleyin. Ardından 500 µL fenol, kloroform, izoamil alkol ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Santrifüjleyin. Üst fazı toplayın ve ekstraksiyon işlemini tekrarlayın.Ardından, DNA'yı sulu katmandan çöktürmek için bir mililitre soğutulmuş, %100 etanol ve 50 µL sodyum asetat ekleyin. Ters çevirerek karıştırın ve örneği -20 °C'de gece boyunca bekletin. DNA'yı santrifüjle çöktürdükten sonra tüm sıvıyı uzaklaştırın, DNA çökeleğini havada kurutun ve 50 µL TE tamponunda yeniden süspande edin. Viral insersiyon için PCR taraması yapmak amacıyla bu genomik DNA şablonunu kullanın. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde, çoklu etiketlere sahip rekombinant virüsler üretin.Bu rekombinant vaccinia virüsleri, sırasıyla virüsün iç çekirdeğinin ve dış zarının parçaları olan A3 ve F13 viral yapısal proteinlerini hedefleyen, floresan markörlerle etiketlenmiş proteinler eksprese eder. Virüs partiküllerini görselleştirmek için virion lokalize proteinlere karşılık gelen genler seçilmiştir. A3, vaccinia virionunun bir çekirdek proteinidir ve F13 bir viral zar proteinidir.Hem floresan işaretli A3 hem de F13 içeren çift etiketli bir virüs de gösterilmiştir. Çift etiketli bir virüs ile gerçek zamanlı floresan mikroskopisi gerçekleştirilebilir. Bu örnekte, vaccinia virüsünün iç çekirdek proteini A3 kırmızıya, dış zarf proteini F13 ise yeşile işaretlenmiştir.Virüs fabrikasından çıkan paketlenmemiş virüs partikülleri kırmızı renkte görüntülenmiş olup, paketlenmiş viriyonlar kırmızı ve yeşil kanalların kolokalizasyonu ile temsil edilmiştir. Rekombinant vektörler ile vaccinia virüsü genomu arasındaki rekombinasyon verimliliklerini belirlemek için kantitatif analiz kullanılmıştır. Vektörlerin vaccinia virüsü genomu ile homolog rekombinasyon verimliliği, 70 baz çifti kadar düşük homoloji bölgeleri ile tespit edilebilmektedir.Bu yöntem, çoklu floresan etiketlere ve/veya çoklu gen delesyonlarına sahip virüsler oluşturmak için kullanılmıştır. Bunlar, virüsün enfeksiyöz yaşam döngüsünün, viral proteinlerin konakçı savunma sistemlerini etkisiz hale getirmedeki rolünün ve konakçı sinyalizasyon süreçleriyle olan etkileşimlerin incelenmesinde kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kullanılan etiketler bakımından modüler, istenen rekombinantların çözümlenmesi konusunda titiz ve çeşitli araştırma bağlamlarında uygulanabilir bir yöntem kullanarak rekombinant vaccinia virüslerinin nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.

methodology-for-efficient-generation-fluorescently-tagged-vaccinia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Synaptically bağlı nöronların izleme için bir yöntem tarif edilmektedir. Biz bir ilgi hücre popülasyonu tanımlı genetik hücre tiplerinden sinaptik girdi alıp almadığını soruşturma yönündeki bir hücrenin TVA özgüllüğü kullanın.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the expansion of plaque-derived recombinant virus in adherent mammalian cells. The virus carries a fluorescent reporter in place of a virulent gene, enabling infection tracking. Infected cells are harvested for PCR verification of the genetic modification.

Expansion of Mutant Vaccinia Virus in Mammalian Cells

Kaynak: Rozelle, D. K., et al. Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression. J. Vis. Exp. (2014)Bu video, evreye özgü promotörler tarafından düzenlenen floresan raporlar kullanarak vaccinia virüsü replikasyonunun izlenmesine yönelik bir yöntemi göstermektedir. Yeşil, kırmızı ve mavi floresan proteinlerin ardışık ekspresyonu; enfeksiyonun erken, orta ve geç evrelerini işaretleyerek evreye özgü viral gen ekspresyonunun yüksek çıktılı analizine olanak...

Floresan Raporlayıcılar Kullanarak Vaccinia Virüsünde Evreye Özgü Gen Ekspresyonunun İzlenmesi

Kaynak: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, viral antigenomu ve temel yardımcı proteinleri kodlayan plazmidleri üretici hücrelere iletmek için lipozomlar kullanılarak rekombinant kızamık virüslerinin üretilmesini göstermektedir. Transkribe edilen ve replike olan RNA, immünostimülatör ve floresan raporlayıcı proteinler eksprese eden viral partiküllerin oluşumuna yol açar. Ardından,...

İmmünostimülatör Protein Kodlayan Rekombinant Kızamık Virüsünün Üretimi

Kaynak: Marzook, N. B., et al., Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (2014)Bu video, enfekte epitelyal hücrelerde plazmit aracılı homolog rekombinasyon kullanılarak rekombinant vaccinia virüslerinin üretilmesini göstermektedir. Floresan ve metabolik belirteçler, etiketli proteinleri eksprese eden virüslerin seçilmesini ve tanımlanmasını sağlar.

Metabolik ve Floresan Seçim Kullanılarak Rekombinant Vaccinia Virüsü Enfekte Hücrelerin Tanımlanması

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Vaccinia virüsü (W), yaygın olarak biyomedikal araştırmalar ve insan sağlığının iyileştirilmesi kullanılmıştır. Bu makalede, bir CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak VV genom düzenlemek için basit, yüksek verimli bir yöntem açıklanır.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

Hindi (galiba yüksek değerli hedef) Herpesvirus yaygın bir vektör platform olarak kuş hastalıkların bir dizi karşı rekombinant aşı üretimi için kullanılır. Bu makalede bir entegre NHEJ-CRISPR/Cas9 ve Cre-Lox sistemi kullanılarak rekombinant galiba yüksek değerli hedef yönlendirdik aşı üretimi için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar.

Rekombinant kuş Herpesvirus vektörleri ile CRISPR/Cas9 üreten gen düzenleme

Bu konak aralığı seçimi ve rekombinant virüslerin görsel kimlik kullanarak "scarless" rekombinant vaccinia virüsler oluşturmak için bir yöntemdir.

Host Aralığı ve Görsel Seçimi Kullanarak Rekombinant Poxviruses Hızlı, Sorunsuz Nesil

Öğrenin, geçici baskın seçim yöntemiyle floresan etiketli rekombinant vaksinia virüsleri üretmeyi. Bu modüler protokol, genetik mühendisliği ve viroloji araştırmalarında çoklu genetik modifikasyonlar için esneklik sağlar.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Daha fazla video keşfet