Meme Kanseri Bir Roman Transgenik Fare Modeli: Adenovirüs-Kretasedekine ile epiteli Hedefleme ile Metastatik Meme Kanseri Başlatma

Klinik açıdan uygun bir metastatik meme kanseri duktal meme sistemi sonuçları içine adenovirüs-Cre ile gizli mutasyonlar aktivasyonu. YFP bir promoter dahil edilmesi uzak metastatik tümör hücrelerinin izleme sağlar. Bu model, latent metastazı, anti-tümör bağışıklık ve meme kanseri tedavisi için yeni immünoterapiler tasarımı için incelemek için yararlı olan.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sonunda sağlıklı bir bağışıklık sisteminin varlığında metastaz yapan bir fare meme kanseri modeli geliştirmektir. Bu, ilk olarak, deney hayvanlarının meme duktal kanalına adenovirüs eksprese eden bir Cree uygulanarak elde edilir. Meme bezi daha sonra tümör ilerlemesini izlemek için düzenli olarak palpe edilir.

Sonuç olarak, tümör metastazı ve aksiller lenf noduna lökosit infiltrasyonu akım sitometrik analiz ile değerlendirilebilir. Bu tekniğin mevcut meme tümörü modellerine göre en büyük avantajı, olgun bir bağışıklık sistemi varlığında gelişebilen ve YFP ekspresyonu ile izlenebilen tümörlerin hassas bir şekilde başlatılmasına izin vermesidir. Giriş enjeksiyon adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.

İğnenin doğru yerleştirilmesi hassasiyet ve pratik gerektirir. Deney gününde, sekizinci plak oluşturan adenovirüs Cree birimlerinin 10'unun dört katı Eloqua'yı kuru buz üzerinde saklayın, virüsü oda sıcaklığında çözün ve son hacmi 10 mikrolitreye çıkarmak için steril suda yeterli% 3 sükroz ile karıştırın. Daha sonra, 34 mikrolitre mem ve dört mikrolitre taze hazırlanmış kalsiyum klorürü virüse yavaşça karıştırın ve çözeltiyi oda sıcaklığında inkübe edin.

15 ila 20 dakika sonra, ortam adenovirüs çökeltilerinin oluşumunu gösteren bulanık görünecektir. Virüs parçacıklarının süspansiyon boyunca eşit olarak dağıldığından emin olmak için tüpü hafifçe vurun ve ardından virüs parçacıklarını enjekte etmek için virüsün üç mikrolitresini 10 mikrolitrelik bir şırıngaya çekin. Daha sonra, anestezi uygulanmış bir fareyi temiz bir diseksiyon mikroskobunun aydınlatılmış aşamasına sırtüstü yerleştirin.

Karnı ekstra bir ışık kaynağı ile aydınlatın ve sol dördüncü veya sağ dokuzuncu kasık meme bezini, her bir meme ucunu çevreleyen küçük beyaz kürk parçalarıyla bulun. Şimdi meme ucunu steril etanole batırılmış pamuk uçlu aplikatör ile nazikçe ovalayın. Daha sonra meme ucunu ince cerrahi forseps ile sabitleyin ve hafif bir kuvvetle yukarı çekin.

Keratin tıkacını çıkarmak için, meme ucunu forseps arasında sabitleyin ve iğneyi yavaşça uçların arasına sokun. Uygun enjeksiyon derinliğini sağlamak için kanal kanalını 90 derecelik bir açıyla kanüle edin, iğneyi kanalın lümenine yerleştirdikten sonra yavaşça yukarı çekin ve meme ucunu yukarı çekilirken iğnenin kenarları boyunca yukarı çekin. İğne uygun şekilde yerleştirildiğinde, şırınganın tüm içeriğini nazikçe daldırın.

Sıvı eklendikçe meme başı hafifçe şişmelidir. Enjeksiyondan sonra, anesteziden kurtulmaya başlayana kadar fareyi tekrar ısıtma yastığına yerleştirin. Daha sonra hayvanı tekrar temiz bir kafese koyun ve tam iyileşme gözlenene kadar izleyin.

Bezin genişlemesi ve şişmesinin değerlendirilmesi için enjekte edilen hafıza bezini 30. günde palpe edin. Tümör ilerlemesini her beş ila yedi günde bir izleyin. Şişmiş ve genişlemiş bir meme bezi gözlendiğinde, tümör büyüme kinetiği için tümör hacimlerini her üç ila dört günde bir ölçün.

Palpe edilebilen tümörler başarılı bir şekilde ortaya çıktıktan sonra, meme duktal ağacının hedeflenmesi, uygun enjeksiyonu doğrulamak için trip ve mavi enjeksiyonundan sonra veya sünek epitel hücrelerinin uygun viral hazırlığını ve enfeksiyonunu doğrulamak için M kirazını eksprese eden bir adenovirüs enjeksiyonundan sonra meme bezinin tüm montajlarının hazırlanmasıyla görselleştirilebilir. F Fluxed P 53 LSLK RAs transgenik farelerde tümörler indüklendiğinde, ilk tümörler, meme bezlerinin genişlediği ve şiştiği yaklaşık 40. güne kadar belirgin hale gelmeyecektir. 56. günden başlayarak, tümörler katlanarak büyümeye başlayacaktır.

Bu noktada, tümör hacimlerinin her üç günde bir ölçülmesi kritik öneme sahiptir. Kinetik çalışmalar isteniyorsa, tümör ilerlemesinde normal bir fareden fareye değişkenlik olacağından, 80. güne kadar büyük abdominal kitleler ortaya çıkacaktır, bundan sonra tümörler hayvanın vücut ağırlığının% 10'undan fazlasını aşarsa farelere ötenazi yapılmalıdır. Akı P 53 LSL KRAS transgenik farelerde meme tümörlerinden türetilen üç hücre hattının CDNA analizi, tümörlerin mezotelin sitokeratin sekiz, HER iki yeni ve östrojen reseptörü alfa eksprese ettiğini ortaya koydu, insan meme kanserinde hücresel mikroçevreye benzer şekilde alfa, beta ve gama delta T hücrelerinin infiltrasyonunun yanı sıra miyeloid türevli baskılayıcı hücreler ve tümörlere makrofajlar gözlendi.

Aksiller lenf noduna boşalan damar sistemi, tümörler büyümeden önce tıkanmaya başlayacak ve sonunda enjeksiyonun yapıldığı tüm hafıza dokusunu kapsayacaktır. Kasık ve koltuk altı lenf bezleri arasındaki yüzeyel epigastrik vende de belirgin bir büyüme olacaktır. Yedi ila sekiz hafta sonra, tümör hücrelerinin lenfovasküler istilası nedeniyle aksiller lenf nodu genişleyecektir.

Tümör hücrelerinin lenfovasküler invazyonu ve metastazı, Flocked P 53 LSLK RAs transgenik fareleri L-S-L-E-Y-F-P fareleri ile çaprazlayarak izlenebilir. Premediad eksizyondan sonra, tümörde hem yüksek hem de düşük YFP seviyeleri eksprese eden hücreler tespit edilir ve metastazları drene aksiller lenf noduna kadar izlenebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse iki ila üç saat içinde 20 fareden oluşan deneysel bir kohortta gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü takiben, farklı onkogenlerin patolojiyi, bağışıklık mikroçevresini ve meme kanserinin metastatik invazyonunu nasıl etkilediği gibi soruları yanıtlamak için ek kilitler, p transgenleri olan fareler yetiştirilerek başka tümör modelleri geliştirilebilir.