Name: Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Öğrenin, beyin omurilik sıvısındaki mikroRNA'ları kantitatif real-time PCR ile profilleme yöntemini. Bu protokol, 742 benzersiz diziyi analiz ederek nörolojik hastalıkların tanısına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü: açıklanan proje Ödülü sayısı R01MH079751 (F. Peruzzi PI) tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Aşağıdaki protokol hazır PCR plakaları kullanılarak BOS ve profil mikroRNA&#39;lar RNA izole etmek için standart prosedür açıklanmaktadır. Organik faz özütleme isteğe bağlıdır, ve bir taşıyıcı RNA RNA maksimum iyileşme sağlanması çıkarma esnasında numuneye eklenir ki unutmayın. Sonuç olarak, RNA ölçmek için herhangi bir gerek yoktur. CDNA (yaklaşık 2 saat) bir gün önce sentez edilir, genel olarak, 6-8 plakaları arasında bir ortalama bir gün içinde çalıştırılabilir. Tüm örnekler profilli ve yazılım yüklenmiş olduğunda verilerin analizi gerçekleştirilir. Karşılaştırma için örnek / grupları veya bunların kombinasyonu sayısına bağlı olarak, veri analizi, bir ila birkaç saat gerekebilir. 1.. RNA Ekstraksiyon RNA ekstraksiyonu, CSF örneklerinden yapıldı depolanmış analiz edilinceye kadar alikotları -80 ° C&#39;de donduruldu. Bu işlem için Mirvana Paris izolasyon kiti, üreticinin aletler ile, ardından, kullanılmışToplam RNA izolasyonu için seksiyonlar. Küçük RNA türlerinin zenginleştirme bu kit ile mümkün olmasına rağmen, bu adım yapılmaz ve RNA ekstraksiyon prosedürü toplam RNA izolasyonu aşamasından sonra sona erer, unutmayın. (Piyasada mevcut diğer RNA izolasyon kitleri gibi) Mirvana Paris izolasyon kiti organik çıkarma gerektirmez rağmen ek olarak, bu işlem için bir protokol aşağıda bulabilirsiniz. RNA ekstre edilmesi için protokol, iki adımdan oluşur: 1.1. Organik Ekstraksiyon (Mirvana Paris RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak eğer gerekli değildir) 1.2.2. Total RNA izolasyonu 1.1. Organik ekstraksiyon 1.1.1. Reaktifler hazırlayın <ol><li> Denatüre edici bir çözüm 2x 2-merkaptoetanol ve 375 ul, ve 4 ° C&#39;de saklayın </li></ol> 1.1.2. CSF hazırlayın <ol><li> RNA ekstraksiyon önce buz üzerinde CSF her kısım Çözülme. Yavaşça 0.5 çözülmüş CSF ml ve MS2 RNA taşıyıcının 1 ug eklemekarıştırın. Organik ekstre atlanırsa, MS2 taşıyıcı, aşağıda 1.2.2.1 &#39;de tarif edilen örnek önce RNA izolasyonu eklenecektir unutmayın. </li><li> CSF, oda sıcaklığında 2 x denatüre çözeltiden 0.5 ml karıştırın. </li><li> CSF artı 2x denatüre Çözüm kloroform: asit-fenol 1 ml ekleyin kloroform, değil karışımın üstüne yatıyor sulu tampon: asit-fenol içeren alt fazı çekilmiş emin olun. Kloroform Bu reaktif ile çalışırken bir zehir ve bir tahriş edici, kullanımı eldiven ve diğer kişisel koruyucu ekipman fenol içerir: Ayrıca, asit-fenol unutmayın. </li><li> 30-60 sn karıştırmak için Vortex. Kolaylık sağlamak için, numunenin 2 ml / çözelti / asit-fenol, denatüre edici: kloroform karışımı iki 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine ayrılır. </li><li> Oda sıcaklığında maksimum hızda 5 dakika (10,000 xg) için santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle alt faz veya interfazda bozmadan sulu (üst) fazının ayrılması ve bir transfertaze tüp. Iyileşti hacmi unutmayın. </li></ol> 1.2. RNA izolasyonu Bu özel bir pipet seti tezgah, ve RNA örnekleri ele için rafları olması tavsiye edilir. Çalışma alanı ve araçları RNaz Zap sprey kullanılarak dekontamine ve önceden her bir deney mendil vardır. 1.2.1. Reaktifler hazırlayın: <ol><li> MiRNA Yıkama Çözeltisi 1,% 100 etanol içinde 21 ml ilave edilir ve yıkama çözeltisi 2/3 40 ml% 100&#39;lük etanol. MiRNA Yıkama Çözeltisi 1 potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir guanidiun tiyosiyanatını içerdiğini unutmayın. </li></ol> 1.2.2. Total RNA izolasyonu <ol><li> Organik ekstre gelen sulu faza oda sıcaklığında% 100 etanol içinde 1.25 hacim ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Toplama Tüpler birine bir Filtre Kartuşu yerleştirin. </li><li> Filtre Kartuş üzerine lizat / etanol karışımı Pipet fazla 700 ul. </li><li> En fazla 30 saniye boyunca santrifüjhızı. Aynı filtre arda uygulamalarda 700 ul aşan karışımı uygulayın. Her santrifüj sonra flow-through atın ve yıkama adımlar için Toplama Tüp kaydedin. </li><li> Maksimum hızda 15 saniye boyunca Filtre Kartuş ve santrifüj 700 ul miRNA Yıkama Çözüm 1 uygulayın. Toplama Tüp gelen akış atmak ve aynı Koleksiyonu Tüpüne Filtre Kartuşu değiştirin. </li><li> Maksimum hızda 15 saniye için 500 ul Yıkama Çözeltisi 2/3 ve santrifüj uygulayın. Toplama Tüp gelen akış atmak ve aynı Koleksiyonu Tüpüne Filtre Kartuşu değiştirin. Maksimum hızda 15 saniye süreyle ikinci bir 500 ul Yıkama Çözeltisi 2/3 ve santrifüj uygulayın. Toplama Tüp gelen akış atmak ve aynı Koleksiyonu Tüpüne Filtre Kartuşu değiştirin. Filtreden kalan sıvıyı almak için maksimum hızda 1 dakika için montaj dönerler. </li><li> Taze Koleksiyonu Tüpüne Filtre Kartuşu aktarın. Uygula 100 &amp; pl, Filtrenin merkezine önceden ısıtılmış (95 ° C) nükleaz içermeyen su içinde çözünmüş ve kapağı kapatın. RNA kurtarmak için maksimum hızda 30 saniye boyunca santrifüjleyin. </li><li> Seyrelti içeren RNA toplamak ve daha sonraki uygulama için -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> NanoDrop 2000C spektrofotometre kullanılarak RNA&#39;nın 1 ul ölçmek. Bir RNA taşıyıcı RNA ekstraksiyonu esnasında numuneye eklenir ise RNA miktar atlanabilir unutmayın. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bu durumda, RNA, 8 ul cDNA sentezine tabi tutulur. </li></ol> 2. miRNA bilgileri: Mah-PCR Protokolü MiRNA profilleme için protokol iki adımdan oluşur: <ol><li> Birinci-şerit cDNA sentezi </li><li> Gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu </li></ol> 2.1. Birinci-şerit cDNA sentezi 2.1.1. Şablonu RNA sulandırmak <ol><li> 5 ng / nükleaz serbest su kullanılarak ul bir konsantrasyona kadar şablon RNA numunelerinin her ayarlayın. EğerRNA (adım 1.2.2.9 bakınız) miktarı değil, daha sonra RNA 8 ul cDNA sentezi için kullanılmaktadır </li></ol> 2.1.2. Reaktifler hazırlayın <ol><li> Yavaşça 5x Reaksiyon tampon çözülme ve serbest su nükleaz ve hemen buz üzerine yerleştirin. </li><li> Vorteks ile karıştırın. Süspanse RNA başak-tüpe 40 ul nükleaz ücretsiz su ekleyerek ve vorteks karışım göre; 15-20 dakika buz üzerinde bırakın. Kullanımdan hemen önce, dondurucu enzim karışımı kaldırmak tüpleri hafifçe vurarak karıştırın ve buz üzerine yerleştirin. Tüm reaktifler aşağı spin. </li></ol> 2.1.3. Ters transkripsiyon reaksiyonu setup <ol><li> Bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne veya eşdeğer bir RT çalışma çözeltisinin gerekli miktarda hazırlayın (oranlarda RNA şablonu haricinde, Tablo 1 &#39;de gösterilen), (maksimum hızda 1-2 saniye) vorteks karışım, kısa bir süre için (aşağı spin biz sabit hızda 10 sn) ile mini bir Eppendorf santrifüj kullanmak ve buz üzerine yerleştirin. Not UniSp6 RNA başak-(Tablo 1 e bakınız) olarak bir RT reaksiyonu önce numuneye eklenir. </li><li> Nükleaz ücretsiz PCR tüpleri içine RT çalışma çözüm dağıtmak. </li><li> Her bir tüp içinde template RNA dağıtın. Not:% 10 fazla hacmi / pipetle ve / veya robotik ölü hacim için her ayıraç hesaplamak için hatırlıyorum. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Panel I Hacim (ul) </td><td> Panel I + II Hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5x reaksiyon tamponu </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> Nükleazlar ücretsiz su </td><td> 9.9 </td><td> 19.8 </td></tr><tr><td> Enzim karışımı </td><td> 2.2 </td><td> 4.4 </td></tr><tr><td> UniSp6 RNA Spike-in şablonunda </td><td> 1.1 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Şablon total RNA (5 ng / ml) </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr&gt; <tr><td> Toplam Hacim </td><td> 22 </td><td> 44 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Transkripsiyon reaksiyonu kurulum Ters. </li></ol> 2.1.4. Mix ve reaktifler dönmeye <ol><li> Reaktif maddeler iyice karışmasını sağlamak için yumuşak (1-2 saniye) vorteks ile reaksiyonu karıştırın. Karıştırma işleminden sonra, (sabit hızda 10 sn mini Eppendorf santrifüj) aşağı doğru döndürün. </li></ol> 2.1.5. Inkübe ve ısı etkisizleştirilmiş <ol><li> Aşağıdaki gibi bir PCR Makinenizi programlamak: </li><li> 42 ° C&#39;de 60 dakika boyunca inkübe </li><li> 95 ° C&#39;de 5 dakika boyunca ters transkripsiyon Isı inaktive </li><li> 4 ° C&#39;ye hemen soğuk </li><li> 4 ° C veya dondurma depolayın Not: protokol bu aşamada kesilebilir. Seyreltilmemiş cDNA kadar 5 hafta (en fazla 4 gün süreyle 4 ° C&#39;de isteğe bağlı mağaza) boyunca -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol><pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.2. Gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu 2.2.1. Gerçek-zamanlı PCR için reaktifler hazırlamak <ol><li> Buz üzerine (aşama 2.1.5 &#39;dan itibaren) cDNA yerleştirin. </li><li> Buz Çözülme nükleaz ücretsiz su ve PCR Master mix. Alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan PCR Master mix şişeleri koruyun. Kullanımdan hemen önce, mini santrifüj 1-2 sn vorteks PCR Master mix mix ve 1 dakika boyunca 1.500 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li></ol> 2.2.2. SYBR Green ana karışımı, su ve cDNA birleştirin ve PCR plakaları ekle Aşağıdaki yordam tüp yüzeye yapışmasını cDNA düşük konsantrasyonlarını önlemek için tavsiye edilir: <ol><li> Plaka mühür çıkarmadan önce, kısaca 1 dakika boyunca 1.500 xg&#39;de soğutmalı santrifüj içinde plaka (lar) aşağı doğru döndürün. </li><li> 15 ml konik tüp, 2x PCR Master mix ve su birleştirir. Panel I: 2.000 ul 2x master miks ve 1980 ul su; Panel I + II: 4.000 ul 2x master miks ve 3.960 μ, L su. </li><li> 20 ul cDNA (panel I) ya da 40 ul cDNA (I + II panel) ekleyin ve karıştırın. </li><li> 1-2 saniye karıştırın hafifçe karıştırın ve 1 dakika boyunca 1.500 xg&#39;de soğutmalı santrifüj içinde aşağı doğru döndürün. </li><li> Bir çok kanallı pipet haznesinde PCR Master mix / cDNA karışımı yerleştirin. Bu çok kanallı pipet uzunluğuna sahip olan bir rezervuar tespit etmek gerekebilir. Bu çok kanallı boyunca eşit hacim kesri izin yeterince yüksek hacimli düzeyde tutar. Bu son birkaç alikots eleştirmekte. </li><li> 10 ul PCR Master karışım dağıtın / cDNA 16 kanallı bir pipet kullanarak 384 oyuklu plakanın her oyuğuna karıştırın. </li><li> Optik conta ile plaka mühür. </li><li> Çözüm karıştırın ve hava kabarcıklarını çıkarmak için, soğutmalı santrifüj (1 dakika için 1.500 xg) kısaca plaka Spin. Not: deney bu noktada durdurulmuş olabilir. Kadar, 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de ışıktan korunmuş reaksiyonları saklayın. </li></ol> 2.2.3. Real-Time PCR Tablo 2 &#39;de ayrıntılı olarak aşağıdaki parametreler, gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu ve erime eğrisi analizi yapın. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Süreci Adım </td><td> Ayarlar, Roche LC480 </td></tr><tr><td> Polimeraz Aktivasyon / doğallık </td><td> 95 ° C, 10 dakika </td></tr><tr><td> Amplifikasyon </td><td> 45 Amplifikasyon döngüleri de 95 ° C, 10 saniye 60 ° C, 1 dakika Rampa-rate 1.6 ° C / sn Optik okuma </td></tr><tr><td> Erime eğrisi analizi </td><td> Evet </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Roche LightCycler 480 kullanarak gerçek-zamanlı PCR döngüsü koşulları. 2.3. Gerçek zamanlı PCR veri analizi Gerçek zamanlı PCR veri analizi, Exiqon genex Professional 5.0 ile yapılır aşağıdaki to talimatları tavsiye edilir. Genex adım adım kılavuzunu indirebilirsiniz <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> Veri analizi üç aşamadan oluşmaktadır: <ol><li> Veri ithalat </li><li> Veri Ön işleme </li><li> İstatistiksel analiz </li></ol> 2.3.1. Veri ithalat <ol><li> Roche LightCycler 480 yılında 2. türev analiz yöntemini seçin ve samid değerlerini hesaplamak. Veri bir tablo olarak ihraç ve metin dosyaları olarak kaydedilir. </li><li> Verileri, açık genex ithalat ve Exiqon ithalat sihirbazı butonuna tıklayın ve &quot;Başlat&quot; tıklayın. Biçimi, alet ve plaka düzeni dosya (lar) seçmek için yönergeleri izleyin. O tabak düzeni dosyaları (excel dosyaları) Exiqon web sitesinden (indirilen Not <a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files</a> ). </li><li> Import Panelleri I ve II ve &quot;İleri&quot; butonuna tıklayınız. </li><li> Dosyası ithalat sonrasında oluşturulan tablo önceden tanımlanmış sütun içerir. Örnekler isimleri düzenlenebilir ve sınıflandırma sütun eklenir veya bu aşamada çıkarılabilir. Bitirdiniz &quot;İleri&quot; yi tıklayın. </li><li> Verilerinizi kaydedin ve Veri Editör yükleyin. </li></ol> 2.3.2. Veri Ön işleme <ol><li> Exiqon ve Genex tarafından önerildiği gibi, birden fazla tabak karşılaştırırken, yapılacak ilk şey, ön işleme menüsünden arası plaka kalibrasyon seçerek plakalar arasında veri kalibre etmektir. </li><li> Bu üçlü çalışır miRNA dizileri çalıştırmak için tavsiye edilir. Bir miRNA üç kopyaları üzerinden en az ikisini içinde mevcut değilse o nonexpressed olarak kurulacaktır. </li><li> Ön işlem bir sonraki adımda, bir kesim yola. Bir kesme değeri olarak tanımlama bir eşik döngüsü (C t) bu değerden daha yüksek olan veri atılır olduğunu gösterir. Beyin omurilik sıvısı örneği kullanılarak, bu deneylerde, kesme kapalı 39 olarak belirlenmiştir. Oradaefore, üç kopyaları içinde 39 daha C ton daha yüksek olan tüm örnekler atılır. Bir miRNA bir prob (üç kişiden birinin kopya) için&gt; 39 C t varsa, bu okuma, diğer iki sondaları C t ortalama ile değiştirilir onlar 39 ikisi de aşağıda sağlanacaktır. </li><li> Referans genleri tanımlamak. Genex Profesyonel referans genleri tanımlamak için geNorm ve / veya NormFinder kullanmak için seçeneği vardır. Tüm örneklem genelinde benzer samid değerlere sahip ve geNorm ve / veya NormFinder çalıştırmak miRNA&#39;ların bir liste seçin. Bu analize göre, burada verilen örnekte, miR-622 ve miR-1266 örneklerin arasında en düzgün değerleri vardı (Şekil 1) referans genler olarak seçilmiştir. </li><li> Daha sonra, veriler, referans genler kullanılarak normalize edildi ve elde edilen değerler ΔC t uyuşmaları </li><li> CDNA sentez reaksiyonları üçlü olarak gerçekleştirildi, bu noktada değerler ortalaması alınmalıdır. </li><li> Yeniden sayfasını doğrulamakboş ve neredeyse boş sütunları taşımak. Ön işleme penceresinde seçin &quot;Ön Onaylayın&quot; ve Kaldır boş sütunlar hattında uygulamak daha. Aşağıdaki satırda, geçerli verilerin istenilen yüzdesini seçti ve uygulamak tıklayın. Tüm örneklerin ortak sadece miRNA&#39;lar karşılaştırmak istiyorsanız Örneğin,% 100 seçin. </li><li> Eksik veri işlemek. Ön işleme menüsünden &quot;Eksik veri&quot; seçin ve eksik verileri işlemek için seçeneklerden birini seçti. Bu adım gereklidir. Eğer işlenmeyen eksik veri içeren dosyaları yüklemeye çalışırsanız genex size hata verecektir unutmayın. </li><li> Örnekler (örneğin, kontrole karşı. Deneyi) grupları arasında nispi miktarını belirler. Gruplar arasında rölatif ölçümü ΔΔ C t yöntemi kullanılarak hesaplanır. Genex yılında, ön işleme sekmesini tıklatın ve nispi miktarını seçin. Penceresinde referans grubu seçin ve uygulayın vurdu. İfade, grafiksel gösterimleri ve / veya ileri istatistiksel analizler için unutmayınEssion verileri bir logaritmik ölçeğe dönüştürülmesi gerekir. Ön işleme menüsünde, Log2 seçin. </li></ol> 2.3.3. İstatistiksel Analiz Genex yazılım T-testi ve ANOVA gibi istatistiksel analizler, geniş bir yelpazede sağlar. <ol><li> Genex ve açık veri yöneticisi içine nihai mdf dosya yükleyin. Bu istatistiksel analiz yapılır hangi örneklerin doğru örnekleri veya grupları seçmek için önemlidir. </li><li> &quot;İstatistik&quot; seçeneğini seçin ve istenen teste karşılık simgesini seçti. </li><li> Kontrol paneli pencerede &quot;Çalıştır&quot; a tıklayın. Excel veya mdf dosyaları gibi sonuçları kaydedin. </li></ol> 2.3.4. İfade profilleme Aşağıdaki gibi MikroRNA&#39;lar ve numuneler, sınıflandırılmış kümelenmiş ve ısı haritaları ve dendogramlardaki görüntülendi olabilir <ol><li> Genex ve açık veri yöneticisi içine nihai mdf dosya yükleyin. Numune veya miRNA&#39;ların grupları seçmek ve oluşturmak için bu pencereyi kullanın. İşiniz bittiğinde &quot;Uygula&quot; yı tıklayın. </li> &lt;Sol üst köşesinde seçin kümede li&gt; ve heatmap simgesine tıklayın </li><li> Kontrol paneli pencerede &quot;Çalıştır&quot; a tıklayın. Heatmap TIFF veya bmp gibi çeşitli biçimlerde kaydedilebilir, aynı zamanda kopyalanan ve gerektiğinde değiştirilebilir. </li></ol>

<ol><li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet.%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li>
<li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li>
<li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNA+in+body+fluid%3A+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA%3A+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li>
<li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

MicroRNA çeviri engellenmesi ve / veya mRNA bozulmasını 2 teşvik gen ekspresyonunu regüle küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar bulunmaktadır. Nedeniyle hücre içermeyen koşullarda yüksek kararlılık, microRNA birçok vücut sıvılarında tespit edilmiştir. Ayrıca, microRNA ayrı ekspresyon profili, insan kanserlerinin 3-9 çeşitli sahne ve / veya ilerlemesi ile ilişkili olmuştur. Klasik çip dizilimleri veya son derin sıralama teknolojisi dahil microRNA profil mevcut çeşitli araç...

MikroRNA&#39;lar post-transkripsiyonel gen ifadesini düzenleyen noncoding RNA (uzunluğu nt 21-23) küçük ailesine aittir. microRNA nispeten kararlı olduğu görünen hücre dışı boşlukta salgılanabilir. MiRNA ifade değişiklikleri belirlemek miRNA profillerini performans ve veri büyük miktarda taşıma, biyolojik belirteçlerin belirlenmesi yönünde önemli bir adım olabilir iken korkutucu olabilir. Burada, bir hassas, gerçek zamanlı PCR ile (veya diğer vücut sıvıları için geçerlidir) beyin-omurilik sıvısında miRNA ifade değişiklikleri belirlemek için bir protokol açıklar. Ayrıca, istatistiksel analiz ve sonuçların grafik gösterimi de dahil olmak üzere, veri analizi için yazılım kullanımını tarif eder. Tüm prosedür nispeten kolay ve basittir ve, profil ve gerçek zamanlı PCR makinelerin sayısı mevcut değil, aynı zamanda nispeten hızlı edilecek numune sayısına bağlı olarak değişebilir. Deneysel bölüm işlemedeki doğruluk gerektirir384-iyi plaka içine RNA ve pipetleme, genex kullanarak veri analizi bölümünde bilişim ve istatistik bazı temel bilgi gerektirir iken.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tablo 3. Ekipman listesi.</td></tr><tr><td> Finnpipette Novus Çok Kanallı Pipetleyici </td><td>Thermo Scientific</td><td>HH05279</td><td></td></tr><tr><td> Finntip Pipet Uçları </td><td>Thermo Scientific</td><td>9400613</td><td></td></tr><tr><td> Termal Döngüleyici C1000 </td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ml Düşük Profilli, Şeffaf PCR tüpleri </td><td>Biorad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td> Düz Kapaklı Şeritler </td><td>Biorad</td><td>TLS0803</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Sızdırmazlık Folyosu</td><td>Roche</td><td>04 729 757 001</td><td></td></tr><tr><td> Soğutmalı Santrifüj 5804R </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Döner Kovalı Rotor, 4 yerli </td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td> Tezgah Üstü Mini Santrifüj </td><td>Fisher</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td> Tezgah Üstü Vorteks </td><td>Balıkçı</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ml Mikrosantrifüj Tüpleri, Sterilize </td><td>Fisher</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td> Matris Reaktif Haznesi, 25 ml </td><td>Thermo Scientific</td><td>8093</td><td></td></tr><tr><td> Termomikser Konforu </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tezgah Üstü Mini Santrifüj Sigma 1-15</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tezgah Üstü Girdap </td><td>Velp Scientifica</td><td>F202A0173</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 4. Reaktiflerin listesi.</td></tr><tr><td> Evrensel c-DNA sentez kiti, 16-32 rxns </td><td>Exiqon</td><td>203300</td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green ana karışımı, Evrensel RT, 25 ml </td><td>Exiqon</td><td>203400</td><td></td></tr><tr><td> Ultra Saf Damıtılmış Su Dnase, Rnase ücretsiz </td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td> MicroRNA Kullanıma hazır PCR İnsan Panelleri (I+II) V2.R </td><td>Exiqon</td><td>203608</td><td></td></tr><tr><td>p><mirVana miRNA izolasyon Kiti, 40 izolasyon</td><td>Ambion</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td> MS2 RNA taşıyıcısı </td><td>Roche Applied Science</td><td> 10165948001</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol %98</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-25ml</td><td></td></tr><tr><td> Etanol %100 </td><td>Carlo Erba</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td> nükleaz içermeyen su </td><td>Qiagen</td><td>1039480</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</s></td><td></td></tr></tbody></table>

kantitatif real time pcr kullanarak beyin omurilik sıvısı microrna profil

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

<html> MikroRNA&#39;lar (miRNA&#39;lar) onların dönüşümsel baskıyı modüle ederek, dolayısıyla, mRNA&#39;ların üzerinde bulunan siteleri hedef ve RISC yönlendirerek gen regülasyonu güçlü bir katman oluşturur. MiRNA ifadesindeki değişiklikler tüm önemli kompleks hastalıkların gelişimi dahil olmak üzere gösterilmiştir. Ayrıca, son bulgular miRNAs hücre dışı çevreye salgılanır ve yüksek stabiliteye sahip dolaşabilir kan ve diğer vücut sıvıları butonu edilebileceğini göstermiştir. Bu tür dolaşan miRNAs fonksiyonu büyük ölçüde zor olmaya devam etmektedir, ancak bu miRNA profil dizileri gibi sistematik bir yüksek veri akışı yaklaşımlar, nörodejeneratif hastalıklar ve kanser dahil olmak üzere birçok çeşitli patolojik koşullarda, miRNA imzaların tanımlanmasına yol açmıştır. Bu bağlamda, beyin-omurilik sıvısında miRNA ifade profilinin tanımlanması, bizim son çalışmada rapor edildiği gibi, biyolojik analiz için miRNAs cazip adaylar yapar. _content &quot;&gt; gibi microarrays gibi microRNA, profilleme için çeşitli araçlar vardır, kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR), ve derin sıralama. Burada, kantitatif gerçek zamanlı PCR ile beyin omurilik sıvılarında microRNA profili için hassas bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Exiqon mıkroRNA hazır kullanımlı PCR insan panelleri kullanılan I ve II sağlar V2.R, 742 eşsiz insan microRNA algılama. Biz üçlü çalıştırır diziler gerçekleştirilen ve biz genex Profesyonel 5 yazılımı kullanarak veri işleme ve analiz. Bu protokolü kullanarak, başarılı bir şekilde hücre hatları ve primer hücreler, CSF, plazma ve formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku türlerinde microRNA profilli var.

Bu çalışmanın sonuçları, daha önceden 1 yayımlanmıştır. GeNorm uygulamasını kullanarak aday referans microRNA analizi 1. sonuçlarını gösterir Şekil. Bu duruma göre, iki microRNA, miR-622 ve miR-1266, referans genler olarak tespit edilen ve miRNA değerlerini normalize etmek üzere kullanılmıştır. CSF çalışma için numuneler üç grup vardı: HIV-(n = 10), HIVE Ensefalit olmayan (n = 4) ve HIV + (HIV +, n = 5). İki grup, HIVE +...

Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) microRNA profili gerçek zamanlı PCR bir protokol açıklar. RNA ekstre etme protokolleri hariç, prosedür diğer vücut sıvıları, kültürlenmiş hücreler ya da doku örneklerinden elde edilen RNA ile uzatılabilir.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Bu prosedürün genel amacı, kantitatif PCR ile beyin omurilik sıvılarındaki mikroRNA'ların profilini çıkarmak ve verileri Gen X profesyonel yazılımı kullanarak analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle beyin omurilik sıvısı örneklerinden toplam RNA'nın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, RNA'ları cDNA'lara transkribe etmek amacıyla ters transkripsiyon işleminin yapılmasıdır.Ardından, cDNA'lar, 742 benzersiz sekans için primerler içeren 384 kuyucuklu plaklara yüklenmiş bir cyber green master mix ile karıştırılır ve gerçek zamanlı PCR kullanılarak amplifiye edilir. Son adım, gerçek zamanlı amplifikasyondan elde edilen verilerin analiz edilmesidir. Sonuçlar nihayetinde, bir kontrole kıyasla kat değişimi, artış veya azalış olarak ifade edilebilir ve çeşitli grafik gösterimlerle görselleştirilebilir.Yöntemimizin, çip dizileri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, oldukça hassas olması ve minimum miktarda RNA gerektirmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, üretilen veri miktarının yüksekliği ve veri analizi için kullanılan yazılım nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Öncelikle, çalışma alanını ve pipetleri RNA Zap ile spreyleyin.Başlangıç olarak, cDNA sentezi i

cerebrospinal-fluid-microrna-profiling-using-quantitative-real-time

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Kantitatif Real Time PCR (qPCR) tümör örneklerinde çeşitli mikroRNA ifade seviyeleri (miRNA) molekülleri araştırmak için hızlı ve duyarlı bir yöntemdir. Farklı miRNA moleküller yüzlerce bu yöntem ifadesi kullanılarak, amplifiye miktarı, ve aynı cDNA şablon ile analiz edilebilir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

Mikroglia merkezi sinir sisteminin savunma ve bağışıklık gözetim ilk satırı sağlamak makrofajlar ikamet ediyorsanız. MicroRNA aktivasyonu ve makrofaj farklılaşma da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik süreçlerin önemli bir rol oynar düzenleyici moleküllerdir. Bu yazıda, mikroglia yılında microRNA ölçümü için bir yöntem sunduk.

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Östrojen ve mikroRNA'lar hem aracılığıyla sinyal Moleküler meme kanseri gelişiminde ve büyümesinde önemli olan. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan östrojen reseptörleri aktive eder. Pek çok transkripsiyon faktörleri microRNA ekspresyonunu düzenleyen ve estrojen ile düzenlenen microRNA farklı büyük ölçekli teknikler kullanılarak profilli olabilir.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Farklılaşmış insan nöral kök hücreleri (hNSC'ler) üzerindeki miRNA'lardaki değişiklikleri karakterize etmek amacıyla, üç boyutlu bir sistemde hNSC farklılaşmasını, miRNA PCR dizisi ile mikroRNA ekspresyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesini ve miRNA hedef tahmini için hesaplamalı analizi ve ikili lusiferaz testi ile doğrulanmasını açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Burada, kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak sıçan peritoneal membranda mikroRNA ekspresyonunun saptanması için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, çeşitli patolojik koşullardaki sıçan peritoneal membrandaki mikroRNA ekspresyon profilini incelemek için uygundur.

Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Kullanarak Sıçanların Periton Membranındaki MikroRNA İfadesinin Saptanması

Bu rapor plazma miRNA, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR ile veya öncesi amplifikasyon olmadan kullanarak mutlak düzeylerini ölçmek için bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı plazma miRNAs miktarı daha iyi anlaşılmasını tanıyor ve nitel karşılık gelen verilerden farklı çalışmalar veya laboratuvar değerlendirmesini sağlar.

Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

Öğrenin, beyin omurilik sıvısındaki mikroRNA'ları kantitatif real-time PCR ile profilleme yöntemini. Bu protokol, 742 benzersiz diziyi analiz ederek nörolojik hastalıkların tanısına katkı sağlar.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

Daha fazla video keşfet