Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

Bu prosedürün genel amacı, kantitatif PCR ile beyin omurilik sıvılarındaki mikroRNA'ların profilini çıkarmak ve verileri Gen X profesyonel yazılımını kullanarak analiz etmektir. Bu, önce beyin omurilik sıvısı örneklerinden toplam RNA'nın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, RNA'ları CDNA'lara kopyalamak için ters transkripsiyon yapmaktır.

Daha sonra, CDNA'lar, 742 benzersiz dizi için primerler içeren 384 oyuklu plakaya yüklenen bir siber yeşil ana karışım ile karıştırılır ve gerçek zamanlı PCR kullanılarak amplifiye edilir. Son adım, gerçek zamanlı amplifikasyondan elde edilen verileri analiz etmektir. Sonuç olarak, sonuçlar bir kontrol üzerinde kat değişikliği, artış veya azalma olarak ifade edilebilir ve çeşitli grafik temsillerde görselleştirilebilir.

Bu nedenle, tekniğimizin çip dizileri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, yöntemimizin oldukça hassas olması ve minimum miktarda RNA gerektirmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, üretilen yüksek miktarda veri ve yazılımın veri analizi için kullanılması nedeniyle mücadele edeceklerdir. İlk olarak, çalışma alanına ve pipetlere RNA Zap püskürtün.

Başlamak için, CDNA sentezi, şablon RNA örneklerini nükleaz içermeyen su ile mikrolitre başına beş nanogram konsantrasyona seyreltir. Ardından, çözülmesi için beş x reaksiyon tamponunu yavaşça buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, reaktifi yeniden süspanse etmek için RNA sivri ucuna 40 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin, tüpü girdaplayın ve 15 ila 20 dakika buz üzerinde bırakın.

Ardından, enzimleri dondurucudan çıkarın, tüpleri hafifçe vurun ve buzun üzerine yerleştirin. Ayrıca, tüm reaktifler çözüldükten sonra, bunları hızlı bir şekilde döndürün. Beş x reaksiyon tamponu enzimini ekleyerek 1.5 mililitrelik bir eph tüpünde ters transkriptaz çalışma solüsyonu hazırlayın.

Tablo bir'de belirtilen oranları kullanarak şablonda nükleaz içermeyen su ve RNA spike'ı karıştırın. Ardından, çalışma solüsyonunu maksimum hızda bir ila iki saniye girdaplayarak karıştırın. Solüsyonu 10 saniye boyunca kısaca döndürün ve ardından çalışma solüsyonunu nükleaz içermeyen PCR tüplerine dağıtın.

Ardından şablon RNA'yı doğrudan PCR tüplerine ekleyin. Tüm reaktiflerin iyice karıştığından emin olmak için reaksiyonu bir ila iki saniye boyunca hafifçe girdaplayın ve tüpleri 10 saniye boyunca döndürün. Numuneyi PCR makinesine yerleştirin ve burada gösterilen ayarları girin.

Ardından retro transkripsiyonu takip ederek programı başlatın. CDNA, gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu için hazırdır ve beş haftaya kadar negatif 20 santigrat derecede saklanabilir. Gerçek zamanlı PCR amplifikasyonuna başlamak için önce CDNA ve PCR ana karışımını buza yerleştirin.

Çözülmesi için, PCR ana karışım şişelerini çözülürken alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun. Girdap çözüldükten sonra, PCR ana karışımı bir ila iki saniye sürer. Daha sonra, 2000 mikrolitre iki XPCR ana karışımını ve 1.980 mikrolitre suyu 15 mililitrelik konik bir tüpte birleştirin.

Karışıma 20 mikrolitre CDNA ekleyin ve çözeltileri bir ila iki saniye boyunca hafifçe girdaplayın. Daha sonra çözeltileri soğutmalı bir santrifüjde 1.500 kez G'de dört santigrat derecede bir dakika boyunca döndürün. Ardından, PCR reaksiyon karışımını çok kanallı bir pipet haznesine yerleştirin.

Plaka contasını çıkarmadan önce kullanıma hazır plakaları soğutmalı bir santrifüjde 1.500 kez G'de kısaca döndürün. Daha sonra, 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna CD NA içeren 10 mikrolitre PCR ana karışımı dağıtın. 16 kanallı bir pipet kullanın ve plakayı bir optik sızdırmazlık filmi ile kapatın.

Ana karışımı ekledikten sonra, çözeltiyi kuyucukların dibine çekmek için plakayı soğutmalı bir santrifüjde 1.500 kez G'de kısaca döndürün. Deneyi duraklatmak için numuneleri karıştırın ve hava kabarcıklarını çıkarın. Bu noktada, reaksiyonları 24 saate kadar dört santigrat derecede ışıktan korunan bir alanda saklayın.

Ardından, tablo ikide ayrıntıları verilen parametreleri izleyerek gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu ve erime eğrisi analizi gerçekleştirin. Analize başlamak için, Roche ışık döngüleyicisinde ikinci türev analiz yöntemini seçin. Ardından niceleme döngüsünü veya CQ değerlerini hesaplayın.

Verileri tablo olarak dışa aktarın ve metin dosyası olarak kaydedin. Ardından, önce gon içe aktarma sihirbazı düğmesine tıklayarak ve ardından bir sonraki pencerede başlat'a tıklayarak verileri Gen X'e aktarın, format enstrümanını ve plaka düzeni dosyalarını seçin. Plaka düzeni Excel dosyaları GON web sitesinden indirilebilir.

Ardından birinci paneli içe aktarın ve ileri'ye tıklayın. Dosya içe aktarma işleminden sonra oluşturulan tablo önceden tanımlanmış sütunlar içerir, örnek adlarını düzenler ve bu adımda sınıflandırma sütunları ekler veya kaldırır. İşiniz bittiğinde ileri'ye tıklayın ve verileri kaydedin.

Ardından veri düzenleyicisine yükleyin İlk olarak, tüm plakaların aynı parametreler kullanılarak hesaplandığından emin olmak için ön işleme menüsünden INTERPLATE kalibrasyonunu seçerek plakalar arasındaki verileri kalibre edin. Ardından, eşik döngüsünden veya ct'den daha yüksek verileri atacak bir kesme değeri tanımlayın. Bir mikro RNA, üç kopyadan biri için daha büyük bir BT'ye sahipse, bu okuma diğer iki probdan alınan BT'nin ortalaması ile değiştirilecektir.

Tüm örneklerde benzer CQ değerlerine sahip mikroRNA'ların bir listesini seçerek referans genleri tanımlayın ve gen normunu çalıştırın. Ardından, elde edilen referans genleri kullanarak verileri normalleştirin. Elde edilen değerler delta ct'ye karşılık gelecektir.

Ön işleme penceresini açıp sayfayı doğrula'yı seçerek ve ardından aşağıdaki satırda yer alan boş sütunları kaldır satırında Uygula'yı seçerek boş ve neredeyse boş sütunları kaldırın. İstediğiniz geçerli veri yüzdesini seçin ve uygula'yı tıklayın. Yalnızca tüm örneklerde ortak olan mikroRNA'ları karşılaştırmak istiyorsanız %100'ü seçin.

Son MDF dosyasını Gen X'e yükleyin ve mikroRNA'ları ve örnekleri ısı haritaları ve dendro gramlarında sınıflandırmak, kümelemek ve görselleştirmek için veri yöneticisini açın. Ardından örnek gruplarını seçip oluşturun ve işiniz bittiğinde uygula'yı tıklayın. Ardından, kontrol paneli penceresinde çalıştır'ı tıklayın.

Isı haritasını TIFF veya bitmap gibi istediğiniz formatta kaydedin ve ardından ısı haritasını gerektiği gibi kopyalayın ve değiştirin. Bu grafik çubuğu, 10 olası mikro RNA referans genini analiz etmek için Gen X içindeki G normu uygulamasından elde edildi. Bu sonuçlar, MIR 622 ve MI 1, 266'nın en kararlı şekilde ifade edilen mikroRNA'lar olduğunu göstermektedir.

Burada görüntülenen kutu grafiği, ensefalitsiz HIVE ve HIV plus grupları içindeki istatistiksel olarak anlamlı 11 mikroRNA'nın her biri için veri dağılımını göstermektedir. Her sütunda çizim, maksimum ve minimum değerlerle birlikte medyan ve birinci ve üçüncü çeyrekleri gösterir. Bu prosedürü takiben, herhangi bir vücut sıvısı, doku örneği ve kültürlenmiş hücre üzerinde mineral profilleme yapılabilir.