Name: Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Öğrenin, sıtma sivrisineklerinde polten kromozomlarından DNA izolasyonu ve amplifikasyonu ile FISH deneyleri için kromozom boyama yöntemini. Bu teknik, hücre biyolojisi ve genetik çalışmalarında kromozom organizasyonunu görselleştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri 1R21AI094289'dan Igor V. Sharakhov'a verilen hibe ile desteklendi.

1) Lazer yakalama mikrodisksiyonu için politen kromozom slayt hazırlığı
<ol><li>Kan sonrası 25 saat beslenmede yarı gravid Anopheles kadınlarını parçalara ayırma. Yumurtalıkları yaklaşık beş dişiden 500 μl taze modifiye Carnoy çözeltisine (%100 metanol: buzul asetik asit, 3:1) 24 saat boyunca oda sıcaklığında sabitlayın. Uzun süreli depolama için yumurtalıkları -20 °C'ye aktarın.</li>
	<li>Kromozom slaytları yapmadan hemen önce Carnoy'un çözeltisini (%100 etanol: buzul asetik asit, 3:1) ve %50 propiyonik asit hazırlayın.</li>
	<li>Bir Zeiss 1.0 PET membran kaydırağına Carnoy çözeltisinin bir damlasına bir çift yumurtalık yerleştirin. Boyutuna bağlı olarak, yumurtalıkları diseksiyon iğneleri ile yaklaşık 2-4 bölüme bölün ve diseksiyon mikroskobu altında temiz slaytlarda% 50 propiyonik asit damlasına yerleştirin.</li>
	<li>Folikülleri ayırın ve diseksiyon stereomikroskopu altında kağıt havlu kullanarak kalan dokuyu çıkarın. Foliküllere% 50 propiyonik asit yeni bir damla ekleyin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika oturmalarını izin verin.</li>
	<li>Damlanın üzerine silikonize bir kapak kılıfı yerleştirin. Slaytı yaklaşık 1 dakika bekletin.</li>
	<li>Slaydı emici bir malzemeyle örtün (bu yöntem için filtre kağıdı kullanılır) ve bir kalemin silgi tarafını kullanırken, silgi ile tekrar tekrar dokunarak kapak ucuna bol miktarda basınç uygulayın.</li>
	<li>Politen kromozomlarının düzleştirilmesine yardımcı olmak için slaytı 15-20 dakika boyunca bir slayt denatürasyon / hibridizasyon sisteminde 60 °C'ye ısıtın. Asidin kromozomları daha da düzleştirmesini sağlamak için slaytları gece boyunca 4 °C'de nemli bir odaya yerleştirin.</li>
	<li>Slaytları 10 dakika boyunca soğuk% 50 etanol içine yerleştirin. Kapak kılıfını yavaşça çıkarın ve 10 dakika daha soğuk% 50 etanol değiştirin.</li>
	<li>Her biri 5 dakika boyunca% 70, % 90,% 100 etanolde dehidrat slaytlar. Hava kuru kaydıraklar.</li>
	<li>1 L damıtılmış suya tek bir tampon tablet ekleyerek gurr tampon çözeltisi çözeltisi hazırlayın. otoklav.</li>
	<li>50 ml GURR tampona 1 ml Giemsa boyama çözeltisi ekleyerek Giemsa çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>Hava kurutulmuş slaytları Giemsa çözeltisine 10 dakika yerleştirin ve 1X PBS'de üç kez yıkayın. Hava kuru, kirlenmeyi önlemek için kontrollü steril bir iklimde tekrar kayar.</li>
</ol>2) Tek bir politen kromozom kolunun lazer yakalama mikro disseksiyonu
Bu bölümde PALM MicroBeam Lazer Mikrodiseksiyon sistemi ile birlikte gelen PALMRobo yazılımının kullanımı ayrıntılı olarak açıklanıyor. 
<ol><li>Mikroskobu % 100 etanol ile temizleyin. Eldivenleri ve tüpleri UV çapraz bağlantıda UV ışığıyla sterilize edin.</li>
	<li>PALM MicroBeam Lazer Mikrodiseksiyon mikroskobuna güç katın ve lazeri açın. Lazer diseksiyon paketi PALMRobo'yu açın ve "Güç" ve "Odak" ayarlarını gerektiği gibi yapılandırın.</li>
	<li>İlgi çekici politen kromozom kolunu arayın.</li>
	<li>"Kurşun Kalem" aracını kullanarak seçili bölgeyi anahat uzadı.</li>
	<li>Menü çubuğundan "Öğeler penceresini" açın.</li>
	<li>"Çizilmiş öğeyi" seçin, "Kes"i seçtiğinizden emin olun.</li>
	<li>Yapışkan kapak tüpünü tutucuya takın ve kaydırağın üzerine yerleştirin, <1 mm boyutunda küçük bir boşluk bırakın ve lazer kesimini başlatın.</li>
	<li>"Mancınık seçimini" kenar ve kromozom arasında boşluk bırakarak kesim bölgesine yerleştirin.</li>
	<li>Açılan seçenekten "LPC" yi seçin ve mancınıklamaya başlayın.</li>
	<li>"Göz" simgesine basarak numunenin kapağa mancınıkla atıldığından emin olun.</li>
</ol>3) DNA'nın tek bir mikrodissektif politen kromozom kolundan arındırılması
Toplanan DNA'yı serbest bırakmak ve arındırmak için QIAamp DNA Mikro Kiti'nin talimatlarını izleyin. Adım 3.1 ters tüpe uyacak şekilde değiştirildi. 
<ol><li>Ters boruya (kapağın içine) 15 μl Tampon ATL ve 10 μl proteinaz K ekleyin ve 3 saat boyunca 56 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>25 μl tampon ATL, 50 μl tampon AL ve 1 μl taşıyıcı RNA ekleyin; karıştırın. 50 μl% 100 EtOH ekleyin; karışım.</li>
	<li>Lisat'ı QIAamp sütununa aktarın; merkezkaç. 500 μl tampon AW1 ekleyerek yıkayın; merkezkaç. Sütunu yeni toplama tüpüne yerleştirin, 500 μl tampon AW2 ekleyin; merkezkaç. Sütunu yeni bir tüpe yerleştirin; fazla sıvıyı çıkarmak için santrifüj.</li>
	<li>Sütunu 1,5 μl mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve elute etmek için 20 μl su ekleyin; merkezkaç.</li>
	<li>Taze elflenmiş DNA'yı vakumla 9 μl'lik son hacme kadar buharlaştır.</li>
</ol>4) Tek bir mikrodissektif politen kromozom kolundan DNA'nın amplifikasyonu
Tek bir kromozom kolunun WGA'ları için iki farklı protokol kullanılmıştır. 
<ol><li>GenomPlex WGA ile DNA amplifikasyonu ve prob hazırlama<ol>
<li>İlk güçlendirilmiş DNA grubunu üretmek için GenomePlex Tek Hücreli WGA4 Kit protokolünü izleyin:<ol>
<li>9 μl numuneye taze hazırlanmış Proteinaz K çözeltisi ekleyin; karıştırın. DNA'yı 1 saat boyunca 50 °C'de kuluçkaya bırakın, ardından 4 dakika boyunca 99 °C'ye ısıtın. Buzda kal.</li>
			<li>2 μl 1X Tek Hücreli Kütüphane Hazırlama Tamponu ve 1 μl Kütüphane Stabilizasyon Çözümü ekleyin; karıştırın. Numuneyi 2 dakika boyunca 95 °C'ye ısıtın. Buz ve santrifüj üzerinde serin.</li>
			<li>1 μl Kütüphane Hazırlama Enzimi ekleyin; karıştırın ve santrifüj. Aşağıdaki gibi kuluçkaya yaslanın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>7,5 μl 10X Amplifikasyon Ana Karışımı, 48,5 μl su ekleyin. 5.0 μl WGA DNA Polimeraz; karıştırın ve santrifüj.</li>
			<li>Termosikül aşağıdaki gibidir: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Genomik DNA Temiz ve Yoğunlaştırıcı Kiti kullanarak DNA'yı arındırın. Protokol aşağıdaki gibidir:<ol>
<li>5:1 DNA bağlama tamponu ekleyin:DNA örneği (özellikle 2 kb'den az genomik DNA için). Örnek DNA 2 kb'den büyükse, 2:1 oranı kullanın) ve sağlanan spin sütununa aktarın. merkezkaç.</li>
			<li>200 μl DNA Yıkama Tamponu ve santrifüj ekleyin. Yıkama adımlarını tekrarlayın. Ardından, 50 μl su ekleyin ve DNA'yı yeni bir 1,5 ml'lik tüpe dökin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>GenomPlex WGA3 Reamplification Kitini kullanarak örnek DNA'yı aşağıdaki gibi yeniden güçlendirin:<ol>
<li>PCR tüpüne 10 μl DNA ekleyin (kit toplam 10 ng DNA önerir) 49,5 μl su, 7,5 μl 10x Amplifikasyon Ana Karışımı, 3,0 μl 10 mM DNTP karışımı ve 5,0 μl WGA DNA Polimeraz. Karıştırın ve santrifüjlayın.</li>
			<li>Reaksiyon için aşağıdaki profili kullanın: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>DNA'ları -20 °C'de saklayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>GenomePlex WGA3 Reamplification Kitini kullanarak FISH için ETIKET DNA'sı aşağıdaki gibi:<ol>
<li>49,5 μl su ile PCR tüpüne 10 μl DNA ekleyerek GenomePlex WGA3 Reamplification Kitinden bir ana karışım oluşturun, 7,5 μl 10X Amplifikasyon Ana Karışımı, 3,0 μl 1 mM dNTP karışımı (1 mM dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP - etiketli dUTP kullanıyorsanız), 1 μl 25 nM etiketli dUTP ve 5.0 μl WGA DNA Polimeraz.</li>
			<li>Reaksiyon için aşağıdaki profili kullanın: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Etanol, 3 M Sodyum Asetat pH 5.2 ve %100 etanol 2-3 hacimli son reaksiyon hacmini (75 μl reaksiyon için 7.5 μl) 1/10 ekleyerek etiketli probu çökeltir. DNA örneğini -80 °C'de en az 30 dakika soğutun.</li>
			<li>Etiketli pelet oluşturmak ve süpernatant ve hava kuru pelet kaldırmak için 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj örneği.</li>
			<li>Karmalaştırma arabelleği aşağıdaki gibi oluşturun: 0.2 g Dektran Sülfat 1200 μl Deiyonize formamid 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>Havayla kurutulmuş pelete 40 μl hibridizasyon tamponu ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>REPLI-G Tek Hücreli WGA ile DNA amplifikasyonu ve prob hazırlama ve ardından nick çevirisi<ol>
<li>Güçlendirilmiş DNA'yı üretmek için REPLI-g Tek Hücreli WGA Kiti protokolünü izleyin:<ol>
<li>Tampon D2 'si (3 μl 1 M DTT + 33 μl Tampon DLB) hazırlayın.</li>
			<li>4 μl saflaştırılmış mikrodisektif malzemeyi 3 μl Buffer D2 ile karıştırın. Karıştırmak için fiske tüpü. 65 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatır. 3 μl Stop çözümü ekleyin; karışım.</li>
			<li>Numuneye 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g Reaksiyon Tamponu ve 2 μl REPLI-g DNA Polimeraz ekleyin. 8 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatır. DNA polimerazini 3 dakika boyunca 65 °C'ye ısıtarak etkisiz hale getirin. DNA'ları -20 °C'de saklayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>REPLI-g güçlendirilmiş DNA'yı etiketlemek için nick çeviri protokolünü izleyin:<ol>
<li>Aşağıdaki etiketleme karışımını hazırlayın: 1 μg güçlendirilmiş DNA 5 μl 10X DNA Polimeraz Tampon 5 μl 10X dNTP 5 μl 1X BSA 1 μl 1 mM Etiketli dNTP 4 μl 1 U/μl İNase I 1 μl 10 U/μl DNA Polimeraz I H2O ila 50 μl</li>
			<li>15 °C'de 2 saat kuluçkaya yatır. Reaksiyonun durdurulması için 2 μl 0,5 M EDTA ekleyin. Jel üzerinde çalıştırarak DNA parça boyutunu kontrol edin.</li>
			<li>Peleti çökeltmek ve çözünürlük hale getirmek için 4.1.4.3-4.1.4.6'dan adımları izleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) Politen ve mitotik kromozom kabak preparatları üzerinde 2D BALIK
Lütfen politen kabakları 47 ve mitotik kromozom slaytlarının preparatları hakkında FISH için ayrıntılı protokollere bakın 48. Burada kısa protokoller sunuyoruz.
<ol><li>Politen kromozomu kabak preparatları üzerinde BALIK<ol>
<li>RT'de slaytları 20 dakika boyunca 1X PBS'ye daldırın.</li>
		<li>Etanol yıkamalarında susuzluk kayar: %50, %70, %90, RT'de her biri 5 dakika boyunca %100.</li>
		<li>Probu 37 °C'de hibridizasyon tamponunda önceden ısıtın. Kaydırmak için 10-20 μl prob ekleyin. 22 X 22 mm kapaklı kapaklı kapak. Pipet ucu kullanarak hava kabarcıklarını bastırın.</li>
		<li>Denatüre kromozomları ve prob 90 °C'de 10 dakika boyunca. Kapak kenarlarını kauçuk çimento ile kapatın. Slaydı nemli odaya aktarın ve bir gecede 39 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Slaytları 39 °C'de 1X SSC ile 20 dakika boyunca yıkayın. Slaytları RT'de 1X SSC ile 20 dakika boyunca yıkayın. Slaytları 1X PBS'de durulayın, ardından DAPI ile Uzun süreli solmaya karşı ekleyin. Kapakçıkla örtün ve görselleştirmeden önce en az bir saat boyunca 4 °C'de slayt kutusunda saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mitotik kromozom kabak preparatları üzerine FISH<ol>
<li>An. gambiae'nin4.</li>
		<li>FISH'e uygun kromozom slaytları hazırlayın.</li>
		<li>Bir tüpteki hibridizasyon tamponuna 2-3 μl etiketli DNA probu ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Prob karışımının 10 μl'lik kısmını slayda uygulayın ve 22 X 22 mm kapaklı kapakla örtün. Pipet ucu kullanarak hava kabarcıklarını bastırın.</li>
		<li>Karşı koyma ve algılama için, dapi ile uzun süreli solmaya karşı uygulama hazırlığına uygulayın ve görselleştirmeden önce en az bir saat karanlıkta tutun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) Tüm mount yumurtalık dokusu üzerinde 3D BALIK
<ol><li>Aşağıdaki Arabellek A karışımını hazırlayın: 60 mM KCl 15 mM NaCl 0,5 mM Spermidin 0,15 mM Spermin 2 mM EDTA 0,5 mM EGTA 15 mM BORULAR</li>
	<li>Kapak kılıflarının boyutuna uyacak şekilde kare desenli bir çivi parlatıcısı katmanı ekleyerek slaytları nükleer görselleştirme için hazırlayın. Bu, gelecekte kapak ucuna yerleştirirken çekirdeklerin ezilmesini önlemek için yükseltilmiş bir yüzey oluşturur.</li>
	<li>Christopher'ın evre 3 dişilerinden taze yumurtalıkları parçalara ayrıştırın ve % 0,5 digitonin ile 150-250 μl Tampon A çözeltisinde tutun. Foliküler zarı yok etmek için foliküller üzerinde (%0,5 digitoninli A Tamponlu tüpte) daha büyük diseksiyon iğnesi çalıştırın.</li>
	<li>Folikülleri daha fazla rahatsız etmek için 5-10 dakika boyunca girdap. Dakikada ~500 devir (RPM) en düşük ayarda 30 saniye boyunca büyük foliküler parçaları ve santrifüj tüpünü kazıyın. Süpernatantı yeni bir 2 ml Eppendorf tüpüne aktarın ve 100 μl Tampon A ekleyin.</li>
	<li>Her iki tüpü de 2.000 RPM'de 10 dakika döndürün. Her iki tüpte de süpernatant atın. Not: Her iki tüp de son nükleer görselleştirme slaytlarını yapmak için kullanılacaktır. Toplanan süpernatant içeren tüp öncelikle çıkarılmış çekirdek içermelidir, doku ile orijinal tüp ise hemşire hücrelerine gömülü doku ve çekirdek karışımı içerecektir. 200 μl Tampon A – % 0,1 Triton ekleyin ve 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. 10.000 RPM'de (10.621 x G) 5 dk santrifüj ve süpernatant çıkarın.</li>
	<li>PBS'ye 200 μl %4 Paraformaldehit ekleyin. Termomikserde 30 dakika kuluçkaya yatırın, 450 RPM'de karıştırın. 5.000 RPM'de (2.655 x G) 5 dakika santrifüj ve süpernatant çıkarın. Termomikserde 450 RPM'de karıştırarak 5 dakika boyunca % 0,1 Triton ile Tampon A ile yıkayın. 5.000 RPM'de (2.655 G) 5 dakika santrifüj ve süpernatant çıkarın.</li>
	<li>Tüpe önceden ısıtılmış 37 °C etiketli prob ekleyin. Termomikserde 95 °C'de denature, 450 RPM'de 10 dakika karıştırılır. 80 °C'de denatürasyona devam edin ve karıştırmaya devam edin. Termomikserde 37 °C'de kuluçkaya yatırın, bir gecede 450 RPM karıştırın. 5.000 RPM'de (2.655 x G) santrifüj 5 dk. Üsttant kaldırın.</li>
	<li>Tampon A ile 5 dakika boyunca% 0.1 Triton ile yıkayın. 5.000 RPM'de (2.655 x G) santrifüj 5 dk. 2 kez tekrarlayın. DAPI ile Uzun Süreli Solmaya Karşı damla uygulayın.</li>
	<li>Çekirdek/ DAPI çözeltisini dikkatlice boruleyin (kabarcıklardan kaçının), slayta uygulayın ve kapakla örtün.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mikrodisektif politen kromozom örneklerinden DNA'yı başarıyla yükseltmek için kritik olan birden fazla adım vardır. Protokol, hem genel verimliliği artıran hem de fiziksel araçların örnekle etkileşimini kaldırarak yabancı DNA'ya maruz kalmayı azaltan bir yöntem olan LCM'nin kullanımını kullanır. Bununla birlikte, yabancı DNA'nın amplifikasyonu hala bu deneyin en büyük potansiyel tuzaklarıdır. Bu nedenle, tüm süreç boyunca, numunelerin kirlenmeye karşı korunması esastır. Slayt hazırlama ve mikrodiseksiyon aşamaları boyunca, etanol yıkama diseksiyon iğneleri, slaytlar, kapak kaymaları ve çalışma alanı için gereklidir.  Ayrıca, UV'nin kullanımdan önce tüm uygulanabilir ekipmanları (iğneler, slaytlar, kapaklar) tedavi etmesi önerilir.
Diseksiyon slaytlarındaki zar, kromozomların yayılmasını çok zorlaştırır.  Bu slaytları yaparken daha fazla yumurtalık (yarım ila tam bir yumurtalık çifti) kullanmak, iyi yayılmış bir çekirdek bulma şansını sağlamak için önemlidir.  Ayrıca, 49 yaşındaki dokular ve kromozom yayılımları daha zor hale geldikçe amplifikasyon oranları düştüğü için slayt yaparken taze doku kullanılması önerilir.  Slaytların mikrodiseksiyon için hazırlanması, bu protokolde en çok zaman alan adımdır.  İstenmeyen malzemenin kazara edinilmesini önlemek için kromozomlar iyi yayılmalıdır.  Giemsa boyama, kullanıcının mikroseksiyon sistemini kullanmadan önce bir faz kontrast mikroskobu ile yayılma kalitesini kontrol etmesini sağlar.
Mikrodiseksiyon ve amplifikasyonun kombinasyonu, küçük ilgi çekici bölgelerden kolların çoğunluğuna kadar boyut olarak değişen kromozomal parçaları çıkarma ve analiz etme fırsatı sağlar.  Bu protokol, kullanıcının inversiyonlar, spesifik ökromatik bantlar ve interbandlar, telomerik, merkezkorik ve interkalary heterokromatin gibi morfolojik olarak farklı bölgelerden DNA elde etmesine izin verir. Kullanıcı, oluşturulan resim problarını anormal kromozomları incelemek, belirli bir loci'de türler arası homolojiyi incelemek veya sağlam bir 3D çekirdekte kromozomların mekansal organizasyonunu karakterize etmek için uygulayabilir. Kromozom boyaları geliştirmek için, tekrarlayan DNA'nın birden fazla kromozomal bölge ile melezleşmesini önlemek için ökromatik segmentler seçtik. Sonuç olarak, total genomik DNA veya C0 t-1DNA fraksiyonu gibi bir rakip kullanmadan kola özgü bir tablo elde ettik.
GenomPlex WGA ve REPLI-G kitlerini, birden fazla amplifikasyon kitinin verimliliğini ve bırakma oranını karşılaştıran incelemelere dayanarak kullanmayı seçtik 40,44.  Her iki kit de her iki bırakma oranında da mevcut yöntemler arasında en iyi performansı gösterdi (GenomePlex, REPLI-g'nin% 37.5'ine kıyasla% 12.5'lik bir orana sahipti) ve yükseltilmiş belirteçlerin yüzdesi (GenomPlex% 45.24 amplifikasyon oranına sahipti ve REPLI-g'nin% 30.0'ı) 40. GenomPlex kiti ayrıca daha yüksek miktarda DNA sağladı ve böylece birden fazla aşağı akış tekniği için daha iyi bir aday haline getirdi.  GenomPlex sistemi için DNA'nın daha da yükseltilmesini sağlayan bir yeniden amplifikasyon kiti de mevcuttur. Ancak, amplifikasyonun mükemmel olmadığını belirtmek önemlidir.  Başarılı amplifikasyonun hatalara yol açabilir veya hedef DNA'daki belirli bir loci'ye karşı önyargılı olma olasılığı devam etmektedir. Mevcut genom amplifikasyon yöntemlerinin son parça boyutunu göz önünde bulundurmak önemlidir.  GenomPlex parçalanması, 200-500 bp arasında değişen parçalara sahip bir kitaplıkla sonuçlanırken, REPLI-g kiti yaklaşık 10-20 kb boyutunda parçalar üretir. Bu protokolün amaçlanan aşağı akış uygulaması FISH'tir, böylece GenomPlex kiti istenen parça boyutunu ve DNA parçalarını doğrudan WGA aracılığıyla etiketleme yeteneğini sağladığı için daha uygulanabilir bir seçenek haline getirir. REPLI-g amplifikasyonu tarafından üretilen uzun DNA molekülleri aşağı akış nick çevirisi etiketleme reaksiyonunda parçalanmalıdır.
Bu protokol, tek bir politen kromozom kolundan DNA'yı başarıyla yükseltmek için uyarlanmıştır.  Diğer protokoller, örnek 7 , 11,28,40'ı başarıyla yükseltmek için birçok (tipik olarak10-30)kromozom parçasının birikmesini gerektirir.   Yöntemimizi kullanarak birden fazla kromozomun birleştirilmesi mümkün olsa da, numune kontaminasyon olasılığının artması, deneye mümkün olduğunca az kromozomla başlamanın önemini vurgulamaktadır. Politen kromozomları mevcut değilse, protokolümüz mitotik kromozomlarda kullanılmak üzere uyarlanabilir. Bununla birlikte, başarılı FISH 11 için amplifikasyondan önce 10-15 mitotik kromozom havuza almak gerekebilir. Amplifikasyon önyargısı, yüksek miktarlarda başlangıç şablonu DNA 50ile daha düşüktür. Politen kromozomları tek bir DNA dizisinin yaklaşık 512 kopyasını ve iki homolog DNA dizisinin 1024 kopyasını sağlar.  Bu nedenle, mitotik kromozomların havuza edilmesi, amplifikasyondan sonra DNA ürününün genel kalitesini artırmaya yardımcı olacaktır.
Bu prosedür sitogenetik ve genomik çalışmalarda birçok potansiyel kullanıma sahiptir. Burada, An. gambiae'de politen ve mitotik kromozom kollarının ökromatik segmentleri arasındaki yazışmaları kurmak için kromozom boyaları kullandık. Aynı boyama probları An. gambiae hücre çizgilerinin sitogenetik karakterizasyonuna uygulanabilir. Kromozom sayılarındaki kapsamlı genomik yeniden düzenleme ve değişiklikler hücre hatlarının ortak özellikleridir 51,52. Farklı sivrisinek hücre hatlarında translokasyonlar, inversiyonlar, delesyonlar ve halka kromozomları gibi aneuploidi, poliploidi ve kromozomal yeniden düzenlemeler tespit edilmiştir 53,54. Klasik sitogenetik gözlemler 55 ve fiziksel haritalama 56, sıtma sivrisineklerinin evriminde tam kol kromozomal translokasyonların meydana gelmesini göstermiştir. Bu nedenle, mikrodiseksiyonlu malzeme, türler arasındaki kromozomal bölgelerin homolojisini karşılaştırmak için FISH deneyleri ile birlikte kullanılabilir. Tüm mount yumurtalık hemşire hücrelerindeki politen kromozomları üzerinde 2R boyama probu ile 3D FISH'i başarıyla gerçekleştirdik. Bu yöntem kromozom yörüngelerinin izlenmesini ve Anopheles'tekinükleer mimarinin incelenmesini kolaylaştıracaktır. DNA genotipleme 57,58,yeni nesil genom dizilimi 26, 27,fiziksel ve bağlantı haritası geliştirme ve kromozom boyama 33,59 için probların üretimi gibi teknikler kol ve bölgeye özgü mikrodiseksiyondan yararlanabilir. LCM teknolojisini birleştirerek ve tek hücreli WGA'yı ilerleterek, tek bir politen kromozom kolundan makul miktarlarda DNA üretmek için verimli, pratik bir yöntem gösteriyoruz.

Kromozom boyama, karyotiplerin 1-5 evrimini incelemek ve floresan etiketli kromozomal DNA 1,6-8'inmelezlenmesi yoluyla sitogenetik anormallikleri görselleştirmek için yararlı bir tekniktir. Bu yöntem ayrıca, 9 ve patoloji 10gelişiminde kromozom bölgelerinin 3D dinamiklerinin incelenmesi için de uygulanır. Farklı etiketli kromozom boyaları, bireysel mitotik 11 , 12,meiotik13, 14veya interfaz politen olmayan15, 16ve politen 9,11 ,17 kromozomlarının görselleştirilmesi için kullanılır. Kromozom boyaları elde etmek için basit ve sağlam bir protokol, bu tekniği sivrisinekler gibi model olmayan organizmalara genişletmede çok yararlı olacaktır. Anopheles gambiae kompleksi, sıtmayı iletme yeteneği de dahil olmak üzere davranış ve adaptasyonda değişen yedi morfolojik olarak ayırt edilemeyen sivrisinek grubudur.  Bu sivrisinekler, vektörel kapasitelerinde büyük farklılıklar gösteren yakından ilişkili türlerin evrimini daha iyi anlamak için mükemmel bir model görevi görer.  Sıtma sivrisineklerinde çoğu sitogenetik çalışma iyi gelişmiş, yüksek politenize kromozomlar kullanılarak yapılmıştır (18,19'dagözden geçirilmiştir). Politen kromozomlarının okunabilir bantlama desenleri, araştırmacıların Anopheles gambiae 20'depolimorfik inversiyonlar ve ekolojik adaptasyonlar arasındaki ilişkiyi göstermelerini sağladı. Ayrıca, 3D politen kromozom organizasyonunun dokuya özgü 21 ve türe özgü 22 özelliği An. macullipennis kompleksinde karakterize edilmiştir. Bununla birlikte, mitotik kromozomların incelenmesi ek önemli bilgiler sağlayabilir. Örneğin, mitotik kromozomlarda gözlenen daha yüksek bir heterokromatin polimorfizmi seviyesi, An. gambiae 23'teçiftleşme aktivitesinin ve doğurganlığın azalmasıyla ilişkilendirilmiştir. Politen ve mitotik kromozom kollarının ökromatik segmentleri arasındaki yazışmaları ancak göreceli uzunlukları karşılaştırılarak kurmak zor olabilir. Bunun nedeni, heterokromatin'in mitotik kromozomların önemli bir kısmını oluşturur, ancak politen kromozomlarında yeterince temsil edilmemektedir 24. Sıtma sivrisinekleri için kromozom boyalarının mevcudiyeti, araştırmacıların ek türleri dahil ederek sitogenetik çalışmaları önemli ölçüde genişletmelerine izin verirken, bu epidemiyolojik olarak önemli böcekler grubundaki karyotipik evrim ve kromozomların 3D dinamiklerinin analizlerindeki maliyeti ve zamanı önemli ölçüde azaltacaktır.
Büyük kromozom esnemeleri elde etmek için, mikrodiseksiyon kromozomal tamamlayıcının belirli ilgi alanlarını manipüle etmek ve izole etmek için ayrılmaz bir teknik haline gelmiştir.  Tüm genom amplifikasyonu (WGA) ile birleştiğinde, mikrodiseksiyon FISH 11 , 12ve yeni nesil genom dizilemesi 25-27dahil olmak üzere güçlü aşağı akış uygulamaları ile sonuçlanır. Daha önce, teknik deneyimli bir kullanıcı tarafından manuel olarak kontrol edilmesi gereken özel mikrodiseksiyon iğnelerinin kullanılmasını gerektiriyordu 28.  Lazer yakalama mikroseksiyonunun (LCM) ilerlemesi, kontaminasyon riski azalmış olan 29, 30veya bireysel kromozomları 31-33 tek hücreleri izole etmek için daha uygun basitleştirilmiş bir aletle sonuçlanmıştır. Bu yaklaşım, kullanıcının birden fazla hücreyi bir araya getirmekten kaynaklanan bir konsensüs manzarası yerine, tek hücrelerde meydana gelen genetik heterojenlikleri ve kromozomal anormallikleri incelemesine izin verir 34-36. Mikrodiseksiyondan üretilen DNA'yı güçlendirmek için birden fazla yöntem kullanılmıştır.  Dop-PCR, son derece tekrarlayan dizilerin amplifikasyonu için yararlı bir teknik, çekirge 37, dikenli yılan balığı 38 ve Nil tilapia 39dahil olmak üzere türlerden mikrodissected kromozomları yükseltmek için kullanılmıştır.   Daha yakın zamanda, PCR tabanlı GenomPlex WGA4 Tek Hücre kiti ve çoklu yer değiştirme amplifikasyon tabanlı (MDA) Repli-G Tek Hücre kiti, tek insan hücrelerinin genetik analizinin yanı sıra kromozomların40-42, çekirge 37 ve çekirgelerdeki B kromozom sistemleri de dahil olmak üzere deneyler için değerli araçlar haline gelmiştir. Bu iki kitin her birinin avantajları ve dezavantajları vardır, ancak mevcut diğer amplifikasyon sistemlerinden daha belirgin üstünlükleri gösterilmiştir 44.
Tek bir kromozomdan veya kromozom segmentinden elde edilebilen DNA miktarı, tüm çekirdeğinkinden önemli ölçüde daha azdır. Bu nedenle, özellikle Drosophila veya Anophelesgibi küçük genomlara sahip organizmalarda mikrodiseksiyon, amplifikasyon ve daha sonra tek bir kromozomun analizi çok daha zordur.  Boyalar bir insan 33 ve bir yabanatı 45'intek mikrodisektif kromozomlarından geliştirilmiş olmasına rağmen, başarılı bir FISH deneyi bir meyve sineğinin birden fazla (en az 10-15) mikrodisetik kromozomunu gerektirdi 11. Bununla birlikte, tek bir kromozomu mikrodisisetleme ve güçlendirme yeteneği, (i) farklı bir kromozomdan elde edilen malzeme ile kontaminasyon şansını azaltmak, (ii) mikrodiseksiyon için gerekli kromozomal preparatların sayısını en aza indirmek, (iii) mikrodisektif numunenin nükleotid ve yapısal polimorfizmini hem FISH hem de aşağı akış uygulamalarında sıralamak için önemli olacaktır. Birçok Dipteran türünde bulunan politen kromozomları, çok daha yüksek bir başlangıç DNA miktarı elde etmek için eşsiz bir fırsat sunar. Ayrıca mitotik kromozomların kullanımı ile elde edilemeyen daha yüksek çözünürlük ve kromozom yapısı sağlarlar. Bu eklenen çözünürlük, kromozomal yeniden düzenlemelerin, kromatin yapısının ve kromozomal segmentlerin mikrodissected 28,46olarak görselleştirilmesinde kritik olabilir.
Burada, tek bir politen kromozom kolundan bir ökromatik segmenti verimli bir şekilde izole etmek, DNA'yı yükseltmek ve sıtma sivrisineklerinde aşağı akış BALIK uygulamalarında kullanmak için bir prosedür sunuyoruz.  İlk olarak, özel olarak hazırlanmış membran slaytlarından tek bir kromozom kolunu izole etmek ve çıkarmak için LCM uyguluyoruz. İkinci olarak, WGA mikrodisected malzemeden DNA'yı yükseltmek için kullanılır. Üçüncü olarak, FISH deneylerindeki güçlendirilmiş DNA'yı politen kabağı preparatları 47, metafaz ve interfaz kromozomu slaytları 48ve ayrıca 3D yumurtalık bütün montaj örneklerine melezleriz. Bu prosedür, ökromatin çoğunluğunu An. gambiae kromozomal kollarında başarıyla boyamak için yapılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Asetik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Propiyonik asit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>Membran slaytları 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415190-9051-000</td><td></td></tr><tr><td>Tampon tabletler " GURR"</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>KaryoMAX Giemsa Leke</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10092-013</td><td></td></tr><tr><td>ThermoBrite Slayt Denatürasyon/Hibridizasyon Sistemi</td><td>Abbott Molecular</td><td>30-144110</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge vakum konsantratörü</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td></td></tr><tr><td>Spektroline Mikroişlemci Kontrollü UV Çapraz Bağlayıcı XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific NanoDrop</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>REPLI-g Tek Hücre Kiti</td><td>Qiagen</td><td>150343</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex Tek Hücre Kiti (WGA4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WGA4-10RXN</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex WGA Yeniden Amplifikasyon Kiti (WGA3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WGA3-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>MZ6 Leica stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>VA-OM-E194-354</td><td>Farklı bir stereomikroskop kullanılabilir</td></tr><tr><td>Olympus CX41 Faz Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>CX41RF-5</td><td>Farklı bir faz mikroskobu</td></tr><tr><td>kullanılabilir PALM MicroBeam Lazer Mikrodiseksiyon Mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt & Öğr. s çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>%99 Formamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran sülfat sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>AM9765</td><td></td></tr><tr>ProLong DAPI <td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Fermentas</td> ile Altın antifade reaktifi <td>R0141, R0151, R0161, R0171</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td><td>GE Sağlık PA53022</td><td>, PA55022</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimeraz I</td><td>Fermentas</td><td>EP0041</td><td></td></tr><tr><td>DNaz I&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Spermin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3256-1G</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>BORULAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-25G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>AdhesiveCap 500 şeffaf</td><td>Zeiss</td><td>415190-9211-000</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mikro Kiti (50)</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>Genomik DNA Temiz ve Yoğunlaştırıcı Kiti</td><td>Zymo Research</td><td>D4010</td><td></td></tr><tr><td>%37 Paraformaldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr></tbody></table>

sıtma sivrisineklerinde 2d ve 3d kromozom boyama

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Tüm kol kromozom problarının floresan yerinde hibridizasyonu (FISH), genomik ilgi alanlarını haritalamak, kromozomal yeniden düzenlemeleri tespit etmek ve hücre çekirdeğindeki kromozomların üç boyutlu (3D) organizasyonunu incelemek için sağlam bir tekniktir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) ve tüm genom amplifikasyonunun (WGA) ortaya çıkması, tek hücrelerden büyük miktarlarda DNA elde edilmesini sağlar. WGA kitlerinin artan duyarlılığı, kromozom boyaları geliştirmemize ve model olmayan organizmalarda kromozom organizasyonuni ve evrimini keşfetmek için kullanmamıza neden oldu. Burada, Afrika sıtma sivrisinek Anopheles gambiaeyumurtalık hemşire hücrelerinden tek politen kromozom kollarının ökromatik segmentlerini izole etmek ve yükseltmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, kromozom boyaları elde etmek için verimli bir platform sağlarken, numuneye yabancı DNA'nın sokulma riskini azaltır. WGA kullanımı, 2D ve 3D FISH de dahil olmak üzere birden fazla deney için kullanılabilecek yüksek miktarda DNA ile sonuçlanan birkaç yeniden amplifikasyon turuna izin verir. Geliştirilen kromozom boyalarının, An. gambiae'depoliten ve mitotik kromozom kollarının ökromatik kısımları arasındaki yazışmaları kurmak için başarıyla kullanılabileceğini gösterdik. Genel olarak, LCM ve tek kromozom WGA'nın birleşmesi, gelecekteki sitogenetik ve genomik çalışmalar için önemli miktarda hedef DNA oluşturmak için etkili bir araç sağlar.

Şekil 1, bu makalede açıklanan protokolün genel akışını açıklar.  Kullanıcı başlangıçta membran slaytlarından kromozom DNA örneklerini mikro olarak ayrı göstererek başlar.  Mikrodissected malzeme çıkarılır ve saflaştırilir. Saflaştırılmış DNA daha sonra yükseltilir, yeniden yükseltilir, etiketlendi ve daha sonra FISH için kromozom yayılımlarını etiketlemek için kullanılır.
LCM protokolü üç genel adıma ayrılabilir: 1) İlgi çekici kromozomların bulunması ve bölgenin kesime hazırlanması (Şekil 2A), 2) İlgi çekici kromozom bölgesinin lazerle kesilmesi ve mancınık yapılması (Şekil 2B) ve 3) Numunenin gerçekten yapışkan kapağa mancınık olup olmadığının kontrol edilmesi (Şekil 2C). An. gambiae Sua sua sutene kromozomlarında kullanılan LCM işlemi Video 1'de gösterilmiştir. Video, önemli yazılım işlevleri ve ipuçları da dahil olmak üzere programın başlangıcından itibaren tüm süreci detaylandırıyor.
Bu protokolde kullanılan GenomPlex ve REPLI-g tek hücreli WGA kitleri, ortaya çıkan ürün büyüklüğünün yanı sıra genel verim açısından da büyük farklılıklar gösterir.  Şekil 3, GenomPlex ve REPLI-g kitleri için yürütülen jel elektroforezi sonuçlarını ve örneklerin Nanodrop tarafından nicelleştirilmesini göstermektedir.
Mikrodisektif malzeme, kromozomun ökromatik bölgelerini hedefleyen FISH probları oluşturmak için kullanılmıştır.  Şekil 4, An. gambiaepoliten kromozomları üzerinde mikrodisektif malzemeden üretilen beş probun FISH'ini göstermektedir.  WGA3 kiti kullanılarak dört otozomal kol üç floroforla etiketlenmiştir: 3R kromozomu yeşil (floresan), 3L kromozom kırmızı (Cy-3) ve sarı (Cy-5), 2R kromozom sarı (Cy-5) ve 2L kromozom kırmızı (Cy-3) olarak etiketlenmiştir. X kromozomu, ayrı bir deneyde REPLI-g materyalinin nick çevirisi kullanılarak turuncu (Cy-3) olarak etiketlenmiştir. Politen ve mitotik kromozom kollarının ökromatik kısımları arasındaki yazışmaları kurmak için kromozom boyaları An. gambiae'nin ara faz, profaz, prometafaz ve metafaz kromozomlarına melezlenmiştir (Şekil 5).  Hücre çekirdeğindeki tek bir politen kromozom kolunun 3D organizasyonunu görselleştirmek için, tüm mount FISH, An. gambiae Sua strain yumurtalık hemşire hücrelerine yapıldı (Video 2).  Farklı kromozom kol bölgeleri nüklelerde interfaz (Şekil 5D) ve politen (Video 2) kromozomları ile açıkça görülmektedir.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> Şekil 1. Kromozom boyalarının hazırlanmasına yönelik deneysel prosedürlerin şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> Şekil 2. Kromozom mikroseksiyonunda önemli adımlar. A) Membran yoluyla ilgi çekici kromozomal bölgenin lazer destekli kesilmesi. B) Mancınık işleminden sonra delikli zar. C) Yapışkan kapağa bağlı olarak içinde kromozomal bir segment bulunan membran mancınıklı parçasının görünümü. Ok, slaytta kalan X kromozomunun heterokromatinini gösterir. Yıldız işareti, slaytta kalan başka bir kromozomun bir parçasını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> Şekil 3. WGA'dan sonra DNA gösteren agarose jel görüntüleri. A) WGA4 ve WGA3 GenomPlex kitlerini kullandıktan sonra kol 3R'den düşük moleküler ağırlık (200-500 bp) DNA. B) REPLI-g amplifikasyonundan sonra kol 2L'den yüksek moleküler ağırlık (10-20 kb) DNA. 100 bp merdiven sol şeritlerde gösterilir. Jel görüntülerin altındaki tablolarda Nanodrop ile ölçülen DNA konsantrasyonları göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> Şekil 4. Mikrodisektif malzemeden üretilen dört prob kullanılarak An. gambiae'nin yumurtalık hemşire hücrelerinden politen kromozomlarının boyanma. X kromozomu, REPLI-g malzemesinin nick çevirisi ile turuncu (Cy-3) olarak etiketlenmiştir. 2R kol sarı (Cy-5) ile etiketlenmiştir; 2L kol kırmızıdır (Cy-3); 3R kol yeşil (floresan) olarak etiketlenmiştir; 3L kol kırmızı (Cy-3) ve sarı (Cy-5) karışımında etiketlenmiştir. Otomatikleştirmeler WGA3 amplifikasyon kiti ile etiketlenmiştir. Kromatin mavi (DAPI) ile boyanmıştır. Kromozom isimleri telomerik bölgelerin yakınına yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> Şekil 5. An. gambiae Mopti suşunun larval imaginal disklerinden interfaz (A), profaz (B), prometaphaz (C) ve metafaz (D) kromozomlarının WGA3 tarafından etiketlenmiş mikrodissected malzemeden oluşturulan üç prob kullanılarak boyanır. 2R kol yeşil (floresan) ile etiketlenmiştir; 2L kol etiketsizdir; 3R kol pembe, kırmızı (Cy-3) ve turuncu (Cy-5) karışımındadır; 3L kol turuncu (Cy-5) olarak etiketlenmiştir. X kromozomu 18S rDNA probuna karşılık gelen kırmızı bir etikete sahiptir. Kromatin mavi (DAPI) ile boyanmıştır. Kromozomların parlak lekeli bölgeleri heterokromatin'e karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
Video 1. An. gambiae politen kromozomlarının LCM süreci. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">Video 1'i görüntülemek için tıklayınız.</a>
Video 2. Tüm mount 3D FISH, An. gambiae yumurtalık hemşiresi hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Prob Cy-3 (mavi ile tasvir edilir) ile etiketlenmiştir ve mikrodissected 2R kromozom kolundan yapılmıştır.  Kromatin DAPI ile boyanmıştır ve siyan sahte renklendirme (açık mavi) ile tasvir edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">Video 2'yi görüntülemek için tıklayınız.</a>

Kromozom boyama, hücre çekirdeğinin organizasyonunu ve karyotipin evrimini incelemek için yararlı bir yöntemdir. Burada, daha sonra iki ve üç boyutlu floresan in situ hibridizasyon (FISH) için kullanılan tek politen kromozomlarından belirli ilgi alanlarını izole etmek ve güçlendirmek için bir yaklaşım sergiliyoruz.

Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Bu prosedürün genel amacı, balık deneylerinde doğrudan kullanmak üzere, mikrodiseksiyona tabi tutulmuş tek bir politan kromozom kolundan yeterli miktarda DNA amplikonu üretmektir. Bu işlem, öncelikle mikrodiseksiyon için özel olarak tasarlanmış membran lamlar üzerinde politan kromozom ezmeleri hazırlanarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise, lazer mikrodiseksiyon ile tekil politan kromozom kollarının izole edilmesi ve yakalanmasıdır.Üçüncü adım, mikro diseksiyonla ayrılmış örnekten DNA izole etmek ve iki tur tüm genom amplifikasyonu kullanarak DNA'yı çoğaltmaktır. Son adımlar, amplifiye edilen DNA'yı işaretlemek ve bunları balık deneylerinde kullanmaktır. Nihayetinde, sonuçlar ilgi duyulan bir bölge için bol miktarda floresan işaretli DNA sağlayabilir.Bu tekniğin, geri klonlar veya PCR fragmanları ile yapılan FISH gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kromozomların geniş kısımlarının bu işaretli problarla floresan şeklinde boyanabilmesidir. Ayrıca, kromozom boyaları sağlam kromozom kollarından mekanik olarak izole edildikleri için herhangi bir sekans bilgisinin bilinmesine gerek yoktur. İlk olarak, bu durumda, taze karnoy çözeltisinde fikse edilmiş yaklaşık beş sivrisineğin overlerinden kromozomları izole edin.Uygun bir kromozom yayılımı doğrulandıktan sonra, kromozomlar denatürasyon ile düzleştirilir ve ardından gece boyunca soğuk inkübasyona bırakılır. Ertesi gün, mikrodisseksiyona hazırlamak için kromozomlar dehidre edilir ve yıkanır. Mikrodisseksiyon mikroskobunu etanol ile temizlediğinizden ve eldivenler ile tüpleri uv ile sterilize ettiğinizden emin olun.Ardından, metin protokolünde sağlanan ikincil videoyu takip ederek kromozomları mikrodiseke edin. Ters çevrilmiş bir tüpü uyumlu hale getirmek için yapılan bir modifikasyonla, bir cogen kiti kullanarak DNA'yı toplayın. Bunu, kolon saflaştırma ve su içinde elüsyon ile takip edin.Tek bir kromozom kolunun tüm genom amplifikasyonu için iki yol mevcuttur. Ley g yolu başlangıçta daha yüksek verim sağlar, ancak DNA'yı etiketlemek için NIC translasyonu gerektirir. Genome plex yolu ise hem birden fazla replikasyon döngüsüne izin vermesi hem de sonuç problarının doğrudan etiketlenmesine olanak tanıması avantajına sahiptir.Kontaminantların amplifikasyonu oldukça muhtemel olduğundan, mümkün olan en steril koşulların kullanıldığından emin olun. Genome plex kökü için; ilk olarak, single cell WGA four kitinin ilk amplifiye DNA grubunu üretmesini sağlayın. İkinci olarak, genome clean and concentrator kitini kullanarak DNA'yı saflaştırın.Yıkama DNA'sını TE tamponu ile değil, su kullanarak elüe etmeyi unutmayın. Üçüncü olarak DNA'yı yeniden amplifiye edin ve dördüncü olarak her iki balık adımı için etiketleyin. WGA three re amplification kiti kullanın.DNA'nın işaretlenmesi, işaretli DUTP'nin yanı sıra nükleotidlerin belirli bir oranını içeren özel bir DNTP karışımının kullanılmasını gerektirir. Rege kitini uygularken, root önce taze sterilize edilmiş su ve yakın zamanda hazırlanmış D iki tamponu kullanarak tek hücreli WGA kitlerini kullanmıştır. Ardından, amplifiye edilmiş DNA'yı işaretlemek için NIC translasyon protokolünü izleyin.DNA fragman boyutunun bir jel üzerinde kontrol edildiğinden emin olun. Fragmanlar yaklaşık 200 ila 500 baz çifti olmalıdır. İşlemi tamamlamak için, işaretli DNA'yı etanolden çöktürün ve örneği 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, geri kazanılan peleti havada kurutun ve 40 µL hibridizasyon tamponu ekleyin. Kurutma işlemi öncesinde, lamların üzerine örtü lamlarının yerleşeceği oje ile kare duvarlar hazırlayın; böylece çekirdekler örtü lamı tarafından ezilmeyecektir. Şimdi, Christopher'ın üçüncü evre yarı-gravid dişi sivrisineklerinden taze yumurtalıkları diseke edin.Overleri, içinde 150 ile 250 µL tampon çözelti ve ek olarak %0,5 digitonin bulunan bir tüpe aktarın. Foliküler membranları parçalamak için büyük bir diseksiyon iğnesi kullanın. Ardından, folikülleri daha fazla dağıtmak için tüpü beş ile 10 dakika boyunca vorteksleyin.Büyük folikül parçalarını sıyırın ve tüpü yaklaşık 500 RPM'lik düşük hızda 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Süpernatanları yeni bir tüpe aktarın ve parçalanmış folikülleri içeren orijinal tüpe 100 µL tampon A ekleyin. Şimdi, görünür doku sadece küçük partiküller haline gelene kadar parçalanmış foliküller üzerinde nükleer izolasyon adımlarını tekrarlayın.Süpernatantların tamamını aynı tüpe toplayın çünkü bunların hepsi çoğunlukla çekirdek içerecektir. Ardından, süpernatantı içeren tüpü ve önlem olarak işlenen kalan dokuyu içeren tüpü santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve %0,1 Triton içeren 200 µL tampon A ekleyin; peletler parçalanana kadar tüpleri kuvvetlice vorteksleyin ve ardından örnekleri dört °C'de gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, tüpleri 10,000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj edin, süpernatanları uzaklaştırın ve PBS içinde %4 paraformaldehit'ten 200 µL ekleyin. Ardından tüpleri bir termo mikserde, 450 RPM'de karıştırarak 30 dakika boyunca inkübe edin. Fiksatifi, 5,000 RPM'de beş dakikalık bir çevirme işlemiyle uzaklaştırın ve ardından süpernatanları dökün.Ardından, %0,1 Triton içeren tampon A ekleyin ve tüpleri bir termo mikserde 450 RPM santrifüj hızında beş dakika boyunca inkübe edin, hücreleri beş dakika daha yıkayın. 5.000 RPM hızda, 37 °C'ye ısıtılmış işaretli probu hazır bulundurun. Hücreler pelitleştiğinde, süpernatantları en az 20 µL işaretli prob ile değiştirin.Konsantrasyonu hakkında endişelenmeyin. Ardından, DNA'yı Thermo mixer'da 450 RPM'de 10 dakika boyunca 95 °C'de denatüre edin ve denatürasyon işlemini karıştırmaya devam ederek 80 °C'de 15 dakika boyunca sürdürün. Daha sonra sıcaklığı 37 °C'ye düşürün ve örneği gece boyunca karıştırmaya devam edin.Ertesi gün, çekirdekleri 5.000 RPM'de (2.655 G) beş dakika santrifüjleyerek geri kazanın. SUPERNAT'ı %0,1 Triton içeren bir yıkama tamponu ile değiştirin. Hücrelerin, oda sıcaklığında yaklaşık 500 RPM'de ajitasyonla beş dakika boyunca yıkanmasını sağlayın.Yıkama çözeltisini başka bir santrifüj işlemiyle uzaklaştırın ve yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Üçüncü yıkamayı uzaklaştırdıktan sonra çekirdekleri doğrudan DPI içeren bir damla prolonged anti fade çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Kabarcık oluşumunu önleyerek çekirdekleri dikkatlice hazırlanmış bir lama aktarın ve üzerine genome plex ve ee kapak lamelini yerleştirerek işlemi tamamlayın.Tek hücreli WGA kitlerinin her ikisi de sivrisinek dokusu üzerinde açıklandığı şekilde kullanılmıştır. Elde edilen DNA, jel elektroforezi ile karşılaştırılmıştır. Verimin belirgin şekilde farklılık gösterdiği görülmüş ve bu durum spektroskopi ile de doğrulanmıştır.Sivrisinek politen kromozomları üzerindeki mikro diseke materyaller için beş prob kullanılarak FISH uygulandı. Dört otozom, WGA three kiti kullanılarak üç florofor ile işaretlendi. Üçüncü R kromozomu ise yeşil floresein ile işaretlenmiştir.Üç L kromozomu kırmızı ve sarı karışık renktedir. İki R kromozomu sarı ve iki L kromozomu kırmızı renktedir. X kromozomu, ley G materyalinin NIC translasyonu ve politen ile mitotik kromozom kolları arasındaki ekromatik kısımların karşılığını belirlemek için yapılan ayrı bir deney kullanılarak turuncuya boyanmıştır.Kromozom boyaları, interfaz kromozomlarına hibridize edilmiştir. 2. R kolu yeşil ile işaretlenmiştir. 3. R kolu pembe, 3. L kolu ise turuncu ile işaretlenmiştir.Kromatin, DPI ile maviye boyanmış ve profaz kromozomları gözlemlenmiştir. X kromozomu, 18 S-R-D-N-A probuna karşılık gelen kırmızı bir etikete sahiptir. Ardından prometafaz kromozomları incelenmiştir. Metafaz kromozomları da tespit edilmiştir.Hücre çekirdeğindeki tek bir politan kromozom kolunun 3D organizasyonunu görselleştirmek için parlak mavi boyalı bölgeler heterokromatine karşılık gelmektedir. Sue strain üzerinde bütün mount balık çalışması gerçekleştirilmiştir. Politan kromozomlar üzerinde sivrisinek over hemosit hücreleri kromozom kol bölgeleri net bir şekilde görülmektedir.Benzer şekilde, interfazdaki çekirdeklerde belirgin kromozom kol bölgeleri açıkça görülür. Bu prosedür uygulanırken, tüm adımların kontaminasyon riskleri göz önünde bulundurularak gerçekleştirilmesi önemlidir. Numunelerin kontamine olması oldukça kolaydır ve bu durum, hedeflenen DNA'nın düşük amplifikasyon verimiyle sonuçlanır.

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Sıtma için potansiyel bir gen refrakter olarak tespit edildikten sonra, bu sivrisinek içinde Plasmodium enfeksiyonları önlemede rolü için değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, sivrisinek Plasmodium enfeksiyonların ölçüde test nasıl göstermektedir. Gametocyte kültür, membran beslenmesi sivrisinek insan kanı hazırlamak ve sivrisinek midgut viral titreleri assaying teknikler gösterilmiştir.

Sivrisinekler ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi Plasmodium falciparum Enfeksiyonlar Protokol

Kemirgen sıtma parazitleri Genetik haçlar sivrisineklerin genetik olarak iki farklı parazitler besleyerek yapılmaktadır. Rekombinant döl sivrisinek enfekte farelerde ısırık izin sonra fare kandan klonlanmış. Bu video genetik haçlar üretmek nasıl...

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Kitlesel paralel DNA dizileme teknolojilerine dayalı genom dizilimleri genellikle oldukça parçalıdır. Fiziksel kromozom haritalarının geliştirilmesi, genom dizilimlerini potansiyel olarak iyileştirebilir. Burada, fiziksel harita geliştirme verimliliğini önemli ölçüde artıran kromozom hazırlama, floresan in situ hibridizasyon ve görüntüleme yöntemlerine yönelik yenilikçi yaklaşımları sunmaktayız.

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Bu video, serebral sıtmanın deneysel bir fare modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Plasmodium berghei ile enfekte dişi sivrisineklerden izole edilen sporozoitler, kısıtlanmış bir farenin kuyruk damarlarına enjekte edilir, bu da kan-beyin bariyerinin bozulmasına ve beyin iltihabına yol açarak serebral sıtmaya neden olur. Bu enfekte fare modeli, serebral sıtma ile ilişkili in vivo mikrovasküler patolojiyi incelemek için değerli bir araç sunar.

Konakçı sivrisinek türevli sporozoitler kullanılarak deneysel serebral sıtmanın bir fare modelinin oluşturulması

Sıtma bulaştıran sivrisinekler, yalnızca moleküler teknikler kullanılarak tespit edilebilen epidemiyolojik olarak önemli bir dizi özelliğe sahiptir. MALDI-TOF tabanlı bir SNP genotipleme platformu kullanarak, sıtma vektörlerinin birden fazla temel özelliğini (tür, böcek ilacı direnci, parazit enfeksiyonu ve konakçı seçimi) aynı anda tespit etmek için bir test geliştirdik.

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

Deneysel serebral sıtmanın bir fare modelini tarif ediyoruz ve manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak inflamatuar ve mikrovasküler patolojinin in vivo olarak nasıl izlenebileceğini gösteriyoruz.

Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak Deneysel Serebral Sıtma Bir Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo Takibi

İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Protokol, φC31 sistemini kullanarak Anopheles sıtma sivrisineklerinin genomunda bölgeye yönelik değişikliklerin nasıl eldeılacağını açıklar. Açıklanan değişiklikler, attP taşıyan yerleştirme hatlarının genomunda transgenik kasetlerin hem entegrasyonunu hem de değişimini içerir.

Sıtma Anopheles Vektörlerinde SiteYe Yönelik φC31 Aracılı Entegrasyon ve Kaset Değişimi

Basit anatomileri göz önüne alındığında, Anofel testisleri spermatogenezi incelemek için iyi bir sitolojik model sunar. Bu protokol, bu biyolojik süreci araştırmak için kullanılan bir teknik olan tam montajlı floresan in situ hibridizasyonun yanı sıra sperm üretiminde yer alan genlerde mutasyonları barındıran transgenik suşların fenotipini açıklar.

Anofel Sivrisineklerinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon

Kimyasal genetik, bir kapı bekçisi kalıntısının, hedef lokusta farklı bir yan zincir içeren bir amino asit ile değiştirilmesini içerir. Burada, cdpk1'in hipomorfik bir alelini içeren mutant bir parazit oluşturduk ve mutant arka planda parazit tarafından benimsenen telafi edici yolları belirledik.

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

Öğrenin, sıtma sivrisineklerinde polten kromozomlarından DNA izolasyonu ve amplifikasyonu ile FISH deneyleri için kromozom boyama yöntemini. Bu teknik, hücre biyolojisi ve genetik çalışmalarında kromozom organizasyonunu görselleştirmeyi sağlar.

Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Daha fazla video keşfet