Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, floresan etiketli antifriz proteinleri tarafından bağlanan buz düzlemlerini görselleştirmektir. Bu, antifriz proteinlerinin ikinci bir adım olarak bağlanabileceği tek buz kristallerinin büyütülmesiyle elde edilir. Her kristal, tekilliğini ve yönelimini belirlemek için çapraz polarizörler aracılığıyla görüntülenir.

Daha sonra, bir buz kristali, sıcaklık kontrollü soğuk bir parmağa monte edilir ve bir yarım küre haline getirilir. Daha sonra, antifriz proteinini büyüyen yarım kürenin spesifik bağlanma düzlemlerine emmek için floresan olarak etiketlenmiş antifriz proteinlerinden oluşan bir çözeltiye daldırılır. Buz sonuçları, karanlık bir soğuk odada dalga boyuna özgü ışık ve filtreler kullanılarak, floresan etiketli antifriz proteini ile bağlanan buzun görselleştirilmesi ve görüntülenmesiyle elde edilir.

Bu tekniğin buzla aşındırma gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, antifriz proteinlerinin floresan olarak etiketlenmesidir Proteine bağlı buz düzlemlerinin anında görselleştirilmesine izin vermek için Eksi 0,5 santigrat derecede sıcaklık kontrollü bir etilen glikol banyosu hazırlayarak ve içine sığan ve üzerinde yüzebilen temiz bir metal tava bularak kristal büyümeye başlayın. Kristaller kalıplarda oluşturulur. Bir polivinil klorür borudan kesilmiş, üç ila dört santimetre yüksekliğinde silindirik kalıplar kullanın.

Her kalıbın bir tarafında bir milimetre genişliğinde, iki milimetre yüksekliğinde bir çentik bulunmalıdır. Çentiğin kesildiği halkanın yan tarafına hafif bir vakumlu gres tabakası uygulayın. Bu yağlanmış çentikli yüzeyi, çentik tavanın merkezinden uzağa bakacak şekilde metal tavaya kapatın.

Çentikleri gresle doldurmadığınızdan veya engellemediğinizden emin olun. Tavaya sığabileceği kadar çok kalıp hazırlayın. Ardından, kalıpların dışındaki tavanın ortasına filtrelenmiş Degas ve deiyonize su ekleyin.

Herhangi bir baloncuk sokmamaya dikkat edin. Su tabakası beş milimetreye yükseltildiğinde, su çentiklerden kalıplara yavaşça girmelidir. Bittiğinde, tavayı etilen glikol banyosuna mükemmel bir şekilde yerleştirin.

Tava ve su eksi 0,5 santigrat dereceye ulaştıktan sonra, kalıpların dışına tavanın ortasına küçük bir parça buz ekleyin. Önümüzdeki üç gün boyunca bir buz tabakası oluşturmak için gece boyunca kuluçkaya yatırın. Kalıplara su eklemek için banyoya dönün.

Her kalıba 13 mililitre dört santigrat derece, Degas ve deiyonize su bırakın. Suyu ekledikten sonra günde bir kez, etilen glikol banyosunun sıcaklığını düşürün. Dördüncü günde, kalıplar tamamen buzla doldurulmalıdır.

Kalıpları alın ve buz için temiz bir yüzey hazırlayın. Her kalıbı tavadan çekin ve buz kristalini dışarı itin. Temiz yüzeyi kalıplarla birlikte bir saat boyunca eksi 20 santigrat derece dondurucuya koyun.

Kullanmadan önce. Buz hazır olduğunda, tek bir kristal olup olmadığını belirlemek için bir dondurucu odaya veya soğuk odaya götürün. Buzu iki çapraz polarizör arasına yerleştirin.

Buz tek bir kristal ise, herhangi bir çatlak veya süreksizlik görülmemeli ve kristal içinde ışık yönü değişmemelidir. Polarizör hala yerindeyken, buz döndürüldüğünde iletilen ışığı gözlemleyerek C ekseninin yönünü belirleyin. A AE'lerin yönünü belirlemek için buzu alüminyum folyoya sıkıca sarın.

Normal bir iğneyi deniz eksenine yönlendirin ve folyodan buzun içine küçük bir delik açın. Ardından, buzu 20 dakika boyunca 0,5 milibarlık bir vakuma koyun. Kristal alındıktan sonra, soğuk odada ortaya çıkarın.

Bazal düzlemdeki altıgen aşındırmayı gözlemleyin. A AE'ler altı köşeli yıldızın köşelerinden geçer. Bu kristal, yıldızın zıt noktalarına paralel bir çizgi boyunca ikiye bölünecektir.

Birincil prizma düzlemini ortaya çıkarmak için kristali bir bankta güvenli bir şekilde tutun. Kristali ikiye bölmek için demir testeresi kullanın. Soğuk bir parmağa monte etmek için parçaları toplayın.

Buz kristali, soğuk bir parmağa monte edilmek için daha fazla hazırlanmalı, biraz farklı çaplara sahip, ancak boyut olarak soğuk parmakla karşılaştırılabilir iki alüminyum çubuk bulmalıdır. Alternatif olarak, soğuk parmağın sığabileceği bir boşluk olduğunda, kristalin tepesine bir boşluk eritmek için çubukları kullanın. Soğuk parmağınızı eksi 0,5 santigrat dereceye kadar soğutun ve buz boşluğuna yerleştirin.

Kristali metale donana kadar yerinde tutun. Daha sonra, yarım küre şeklindeki bir kabı, buz kristalinin çapının yaklaşık iki katı olan filtrelenmiş deiyonize su ile dört santigrat dereceye kadar doldurun. Soğuk parmağa bağlı buz kristalini bardağa batırın, fazla suyu alın, böylece buz kristalinin üst kısmı sıvı ile yaklaşık olarak aynı hizada olur ve buz birbirine değmez.

Bardak duvarları kabı yalıtımla kaplar ve sıcaklığı eksi beş santigrat dereceye düşürür. Buzun yaklaşık bir saat içinde bir yarım küre oluşturmasına izin verin. Floresan proteini eklemeye hazırlanın.

Yarım küre hazır olduğunda. Buz kristalini bardaktan çıkarın, bardaktaki suyu alın. Daha sonra istenen konsantrasyonda 25 ila 30 mililitre önceden soğutulmuş floresan etiketli protein çözeltisi ekleyin.

Toplam sıvı hacmini değiştirmeden tutarken, buz kristalini bardağa daldırın. Yine. Kristalin üst kısmının sıvı ile aynı seviyede olduğundan ve fincan duvarlarına temas etmediğinden emin olun. Soğuk parmak sıcaklığını eksi sekiz santigrat dereceye düşürün ve protein çözeltisinin kristalin içinde iki ila üç saat donmasına izin verin.

Protein çözeltisinden en az beş milimetre buz oluştuğunda buz büyümesini durdurun. Soğuk parmak hala takılıyken, buz kristalini bardaktan çıkarın. Soğutucuyu sıfır santigrat derecenin hemen üzerine ısıtarak soğuk parmağınızı ayırın.

Buz kristali eriyene kadar bekleyin. Kristal soğuk parmaktan eridiğinde, düz tarafı aşağı bakacak şekilde temiz bir yüzeye yerleştirin. Yeni oluşan buza dokunmamaya dikkat edin.

Kristali eksi 20 santigrat derecede en az 20 dakika saklayın Floresan çalışmasını görselleştirmeye devam etmeden önce, karartılabilen soğuk bir odada çalışın. Floresan etiketi ve kamera emisyon filtrelerini uyarmak için dalga boyuna özgü uyarma filtrelerine sahip lambalar hazırlayın. Spesifik olmayan ışığı engellemek için, buzu düz tarafı aşağı bakacak şekilde lambaların altına yerleştirin, odayı karartın ve aydınlatılan buzdaki desenleri gözlemleyin.

Antifriz proteinleri tarafından bağlanan buz düzlemlerini tahmin etmek için, geleneksel bir buz aşındırma görüntüsünü karşılık gelen floresan bazlı buz düzlemininkiyle karşılaştırın Trixy kullanılarak yapılan afinite analizinin her ikisi de kış pisi balığı pseudo pectus Americana tarafından üretilen tip bir antifriz proteinlerini gösterir. Teknik, farklı antifriz proteinlerinin buz bağlama modellerini aynı anda karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu durumda, Pasifik Mavisi etiketli tip üç NFEA FP sekiz ve trixy etiketli tip bir antifriz proteini.

Bu, yalnızca tip üç N-F-E-A-F-P sekizinin görselleştirilmesinin sonucudur, burada bu görüntüde yalnızca tip bir antifriz proteini görselleştirilmiştir. İkisi birlikte görselleştirilir. C ekseninin her görüntü için aynı olduğunu unutmayın.

Bu videoyu izledikten sonra, tek buz kristallerinin nasıl büyütüleceğini ve yönlendirileceğini iyi anlamalı ve floresan etiketli antifriz proteinlerinin buz ovası bağlanma modellerini değerlendirmek için floresan bazlı buz ovası afinite analizini kullanmalısınız.