Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, floresan işaretli antifriz proteinleri tarafından sınırlandırılan buz düzlemlerini görselleştirmektir. Bu, ikinci bir adımda antifriz proteinlerinin bağlanabileceği tekil buz kristallerinin büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Her bir kristalin tekilliği ve yönelimi, çapraz polarizörler aracılığıyla incelenir.

Ardından, sıcaklığı kontrol edilen bir soğutma çubuğuna bir buz kristali yerleştirilir ve yarım küre şeklinde oluşturulur. Daha sonra, antifriz proteinini büyüyen yarım kürenin spesifik bağlanma düzlemlerine absorbe etmek amacıyla, floresan işaretli antifriz proteinleri içeren bir çözeltiye daldırılır. Buz sonuçları, karanlık bir soğuk odada, dalga boyuna özgü ışık ve filtreler kullanılarak floresan işaretli antifriz proteininin bağlandığı buzun görselleştirilmesi ve görüntülenmesiyle elde edilir.

Bu tekniğin buz aşındırma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, protein bağlı buz düzlemlerinin anında görselleştirilmesine olanak tanımak için antifriz proteinlerinin floresanla işaretlenmiş olmasıdır. Eksi 0.5 °C'de sıcaklık kontrollü bir etilen glikol banyosu hazırlayarak ve bu banyonun içine sığabilen ve üzerinde yüzebilen temiz bir metal kap bularak kristal büyütme işlemine başlayın. Kristaller kalıplarda oluşturulur. Polivinil klorür borudan kesilmiş üç ila dört santimetre yüksekliğinde silindirik kalıplar kullanın.

Her bir kalıbın bir tarafında bir milimetre genişliğinde ve iki milimetre yüksekliğinde bir çentik bulunmalıdır. Çentiğin açıldığı halka kenarına ince bir tabaka vakum gresi uygulayın. Greslenmiş bu çentikli yüzeyi, çentik tavanın merkezinden uzağa bakacak şekilde metal tavaya mühürleyin.

Çentiklerin gres ile doldurulmadığından veya tıkanmadığından emin olun. Tavaya sığabileceği kadar kalıp hazırlayın. Ardından, kalıpların dışında kalan tavanın merkezine filtrelenmiş Degas ve deiyonize su ekleyin.

Herhangi bir hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Su tabakası beş milimetreye yükseldikçe, su çentikler aracılığıyla kalıplara yavaşça girmelidir. İşlem tamamlandığında, tavayı etilen glikol banyosuna tamamen düz bir şekilde yerleştirin.

Tava ve su eksi 0,5 °C'ye ulaştıktan sonra, kalıpların dışındaki tavanın ortasına küçük bir parça buz ekleyin. Gelecek üç gün boyunca bir buz tabakası oluşması için gece boyunca inkübe edin. Kalıplara su eklemek için tekrar banyoya yerleştirin.

Her bir kalıba 13 milliliters, dört degrees Celsius sıcaklıkta, gazı alınmış ve deiyonize su ekleyin. Suyu ekledikten sonra, günde bir kez etilen glikol banyosunun sıcaklığını düşürün. Dördüncü güne gelindiğinde, kalıplar tamamen buzla dolmuş olmalıdır.

Kalıpları geri alın ve buz için temiz bir yüzey hazırlayın. Her bir kalıbı tepsideen çekerek çıkarın ve buz kristalini dışarı itin. Kalıpların bulunduğu temiz yüzeyi bir saat boyunca -20 °C dondurucuda bekletin.

İşleme başlamadan önce. Buz hazır olduğunda, tek kristal olup olmadığını belirlemek için onu bir dondurucu odaya veya soğuk odaya götürün. Buzu iki çapraz polarizör arasına yerleştirin.

Eğer buz tek kristalli ise, herhangi bir çatlak veya süreksizlik görülmemeli ve kristal içinde ışık yönü değişmemelidir. Polarizör yerindeyken, buz döndürüldüğünde iletilen ışığı gözlemleyerek C ekseninin yönünü belirleyin. A AE'lerinin yönünü belirlemek için buzu alüminyum folyo ile sıkıca sarın.

Bir iğneyi deniz eksenine dik olarak yönlendirin ve folyo üzerinden buzun içine küçük bir delik açın. Ardından, buzu 20 dakika boyunca 0.5 milibar vakuma yerleştirin. Kristal geri alındığında, soğuk odada açığa çıkarın.

Bazal düzlemdeki altıgen aşındırmayı gözlemleyin. A AE'leri, altı köşeli yıldızın köşelerinden geçer. Bu kristal, yıldızın karşıt noktalarına paralel bir hat boyunca ikiye bölünecektir.

Birincil prizma düzlemini açığa çıkarmak için kristali bir tezgah üzerinde güvenli bir şekilde tutun. Kristali ikiye bölmek için bir demir testeresi kullanın. Parçaları soğuk parmak üzerine monte etmek üzere toplayın.

Buz kristali, soğuk parmağa monte edilmek üzere ayrıca hazırlanmalıdır; soğuk parmakla benzer boyutlarda ancak çapları hafifçe farklı iki adet alüminyum çubuk bulun. Kristalin üst kısmında bir boşluk eritmek için çubukları dönüşümlü olarak kullanın ve soğuk parmağın sığabileceği bir boşluk oluştuğunda işlemi durdurun. Soğuk parmağı -0,5 °C'ye kadar soğutun ve buz boşluğuna yerleştirin.

Kristal, metale donana kadar yerinde tutun. Ardından, yarım küre şeklinde bir kabı, buz kristalinin çapının yaklaşık iki katı büyüklüğünde olacak şekilde, dört santigrat dereceye (°C) soğutulmuş filtrelenmiş deiyonize su ile doldurun. Soğuk parmağa bağlı buz kristalini kabın içine daldırın ve buz kristalinin üst kısmı yaklaşık olarak sıvı seviyesinde olacak ve buz temas etmeyecek şekilde fazla suyu uzaklaştırın.

Kap duvarları kabı yalıtım ile kaplar ve sıcaklığı eksi beş derece Celsius'a düşürür. Buzun yaklaşık bir saat boyunca bir yarım küre oluşturmasına izin verin. Floresan proteini eklemek için hazırlık yapın.

Yarım küre hazır olduğunda, buz kristalini kaptan çıkarın ve kaptaki suyu boşaltın. Ardından, istenen konsantrasyondaki 25 ila 30 mililitre ön soğutmalı floresan işaretli protein çözeltisi ekleyin.

Toplam sıvı hacmini sabit tutarak, buz kristalini kabın içine daldırın. Kristalin üst kısmının sıvıyla aynı hizada olduğundan ve kap duvarlarına temas etmediğinden emin olun. Cold finger sıcaklığını -8 °C'ye düşürün ve protein çözeltisinin kristal içinde donması için iki ila üç saat bekleyin.

Protein çözeltisinden en az beş milimetre buz oluştuğunda buz büyümesini durdurun. Soğuk parmak hâlâ takılıyken, buz kristalini kaptan çıkarın. Soğutucuyu sıfır santigrat derecenin hemen üzerine ısıtarak soğuk parmağı ayırın.

Buz kristali eriyene kadar bekleyin. Kristal soğuk parmaktan eriyip ayrıldığında, düz tarafı aşağı gelecek şekilde temiz bir yüzeye yerleştirin. Yeni oluşan buza dokunmamaya dikkat edin.

Kristali, işleme devam etmeden önce en az 20 dakika boyunca -20 °C'de saklayın. Floresans görüntülemeye geçmeden önce, karartılabilen bir soğuk oda içerisinde çalışın. Floresan etiketi uyarmak için dalga boyuna özgü eksitasyon filtreli lambaları ve kamera emisyon filtrelerini hazırlayın. Spesifik olmayan ışığı engellemek için buzu düz tarafı aşağı gelecek şekilde lambaların altına yerleştirin, odayı karartın ve aydınlatılmış buzun içindeki desenleri gözlemleyin.

Antifriz proteinleri tarafından bağlanan buz düzlemlerini tahmin etmek için, geleneksel bir buz aşındırma görüntüsünü, trixy kullanılarak gerçekleştirilen ilgili floresans tabanlı buz düzlemi afinite analizi görüntüsüyle karşılaştırın; her ikisi de kış flounder'ı Pseudopectus americana tarafından üretilen tip 1 antifriz proteinlerini göstermektedir. Bu teknik, farklı antifriz proteinlerinin buz bağlama modellerini eş zamanlı olarak karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu örnekte, Pacific Blue ile işaretlenmiş tip 3 NFEA FP 8 ve trixy ile işaretlenmiş tip 1 antifriz proteini kullanılmıştır.

Bu, yalnızca tip üç N-F-E-A-F-P sekizinin görselleştirilmesinin sonucudur; burada yalnızca tip bir antifriz proteini görselleştirilmiştir. İkisi birlikte görselleştirilmiştir. C ekseninin her görüntü için aynı olduğuna dikkat edin.

Bu videoyu izledikten sonra, tekil buz kristallerinin nasıl büyütüleceği ve yönlendirileceği ile floresan işaretli antifriz proteinlerinin buz düzlemi bağlanma modellerini değerlendirmek için floresan tabanlı buz düzlemi afinite analizinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.