Name: Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-15T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Öğrenin, floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi yöntemiyle antifriz proteinlerinin buz kristallerine bağlanma düzlemlerini görselleştirmeyi. Bu teknik, kriyobiyolojide protein etkileşimlerini anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PLD, Protein Mühendisliğinde Kanada Araştırma Başkanı'na sahiptir. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden PLD'ye verilen bir hibe ile finanse edildi. Bu çalışma ayrıca Japonya Bilimi Destekleme Derneği (JSPS) (No. 23310171) ve Japonya Biyo-odaklı Teknoloji Araştırma İlerleme Kurumu'ndan (BRAIN) bilimsel araştırmalar için bir Grant-in-Aid tarafından desteklendi. Dr. Chris Marshall ve Mike Kuiper'e FIPA'ya yol açan öncü çalışmalar için minnettarız. Ayrıca, bu çalışmaların bazıları için olanak sağladığı için Dr. Sakae Tsuda'ya ve floresan ışık ekscitasyon ve emisyon filtrelerini kurduğu için Dr. Laurie Graham'a minnettarız.

1. Büyüyen Tek Buz Kristalleri
<ol><li>Etilen glikol soğutma banyosuna uyan ve üzerinde yüzebilen temiz bir metal tava (15 cm çapında, 4,5 cm yüksekliğinde) alın.</li>
	<li>Bir borudan kesitler keserek polivinil klorür (PVC) silindirik kalıplar (4,5 cm çapında, 3-4 cm yüksekliğinde, 4 mm kalınlığında) hazırlayın.<ol>
<li>Bir tarafta (1 mm genişliğinde, 2 mm yüksekliğinde) bir çentik kesin (Şekil 1A).</li>
		<li>Tavaya rahatça sığabilecek kadar kalıp hazırlayın (Şekil 1B). Not: Bir çalışma polivinil alkolün (PVA) buz çekirdeğini etkileyebileceğini göstermiştir22. Ancak açık kalıp PVC sistemimizde atipik buz oluşumu sorunları ile karşılaşmadık.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çentik kesilmiş yüzey olan her kalıbın alt yüzey halkasına hafif bir vakum gresi filmi uygulayın. Bu yağlanmış, çentikli yüzeyi, çentikler tavanın merkezinden uzağa yönlendirilmiş metal bir tavaya kapatın. Çentikleri gresle doldurmamaya veya engellememeye dikkat edin.</li>
	<li>Tava ortasına, ancak kalıpların dışına 0,22 μm filtrelenmiş ve gazsız/deiyonize su ekleyin ve suyun çentiklerden kalıplara yavaşça girmesini sağlar. Herhangi bir kabarcık tanıtmamaya dikkat edin. Su tabakası yaklaşık 5 mm derinliğinde olmalıdır.</li>
	<li>Tavayı -0,5 °C'ye kadar soğutulmuş sıcaklık kontrollü etilen glikol banyosuna yerleştirin. Tava mükemmel seviyede olmalı. Gerekirse tava kenarlarına balast ağırlıkları ekleyin.</li>
	<li>Tava ve su -0,5 °C'ye ulaştıktan sonra, tava ortasına kalıpların dışına küçük bir buz parçası ekleyin.<ol>
<li>Bu, tava boyunca ve kalıplara aşırı solumuş suda buz büyümesini çekirdekleyecektir. Her kalıbın altındaki küçük çentik, sadece bir buz kristalinin yayılmasına izin verir ve bu da her kalıpta tek bir buz kristali ile sonuçlanır.</li>
		<li>Bir buz tabakası oluşturmak için bir gecede kuluçkaya yaslanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sonraki üç gün boyunca her kalıba günde bir kez 13 ml 4 °C gazsız/deiyonize su ekleyin ve etilen glikol banyosunun sıcaklığını ilk gün -0,8 °C'ye, ikinci günde -1,1 °C'ye ve üçüncü günde -1,5 °C'ye düşürün.<ol>
<li>Gece boyunca bu sıcaklıklarda kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>Dördüncü güne kadar, kalıplar tamamen buzla doldurulmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalıpları tavadan çekin, buz kristallerini kalıplardan dışarı itin ve tartım teknesi gibi temiz bir yüzeyde, elleçlemeden önce yaklaşık 1 saat boyunca -20 ° C dondurucuda saklayın.</li>
	<li>Birçok küçük tek buz kristali hazırlamak yerine, knight23tarafından açıklandığı gibi sabit bir sıcaklık inkübatöründe hacim olarak birkaç litrelik büyük bir tek buz kristali hazırlanabilir. Büyük buz kristali -15 ila -20 ° C dondurucuda tutulursa bir yıl veya daha fazla saklanabilir. Tek kristalin kısımları gerektiğinde bir testere ile buz bloğundan kesilebilir.</li>
</ol>2. Buz Kristalinin Tekilliğinin ve Yönünün Belirlenmesi
<ol><li>Kalıptan atılan buzun, iki çapraz polaroid arasında bir dondurucu odasında gözlemleyerek tek bir kristal olup olmadığını belirleyin (Şekil 1D).<ol>
<li>Buz kristali tek ise, çatlak veya süreksizlik görülmemeli ve ışık yönü buz kristali içinde değişmemelidir. Not: Dondurucu oda yoksa, bunun yerine soğuk bir oda gerekli tüm adımlarda kullanılabilir, hızlı çalışmak ve buzları idareli bir şekilde işlemek için dikkatli olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Buz birefringence nedeniyle, kişi aynı anda cekseninin yönünü belirleyebilir. Yönlendirmeyi belirlemek için aşağıdaki bilgileri kullanın:<ol>
<li>Cekseni olay ışığına tam olarak paralel olduğunda, teoride, çapraz polaroidlerden hiçbir ışık geçmeyecek. Olay ışığı ceksenine paralel olarak hafifçe başlıklandırılırsa, çapraz polaroidler arasında döndürüldüğünde kristalden tek tip çok renkli bir ışık spektrumu iletilir. Bu düzgün geçirgenlik, cekseni24boyunca buz Ih'nin optik hareketsizliğinden kaynaklanır. Buz kristalinin bazal düzlemi ceksenine göre normaldir.</li>
		<li>Cekseni olay ışığına paralel olarak daha uzak olduğunda ve buz kristali çapraz polaroidler arasında döndürüldüğünde, iletilen ışık kristalin her 90° dönüşüyle% 0-100 geçirgenlik arasında değişir.</li>
		<li>En yaygın olarak, cekseni silindirik buz kristalinin dairesel düzlemine normal olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Buzkristalini alüminyum folyoya sıkıca sararak, bazal düzlemdeki buza bir iğne ile küçük bir delik açarak (ceksenine normal) ve 20 dakika boyunca vakumun altına yerleştirerek yapılan25 numaralı buz çukurluğu ile a -baltaların yönünü belirleyin.<ol>
<li>Bu tedavi, a -eksenlerin altı taraflı yıldızın köşelerinden geçtiği bazal düzlemde altıgen simetri ile birkazık üretecektir (Şekil 2A).</li>
		<li>İstenirse, buz kristali sırasıyla soğuk parmağa dik birincil veya ikincil prizma düzlemi ile monte etmek için altıgen bir tarafa paralel veya dik bir testere ile kesilebilir (Şekil 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Floresan Etiketli Antifriz Proteinlerinin Tek Bir Buz Kristaline Adsorpsiyonu
<ol><li>Önce kristalin tepesine bir boşluk sıkarak soğuk parmağa (Şekil 1C) tek bir buz kristali monte edin. Bunu yapmak için, buzun biraz farklı çapta iki alüminyum çubukla eritmesini değiştirin, ancak soğuk parmağın çapına benzer, soğuk parmağın sığabileceği boşluğu oluşturmak için.</li>
	<li>Soğuk parmağı -0,5 °C'ye soğutun, buz boşluğuna yerleştirin ve buz kristalini metale donana kadar yerinde tutun (Şekil 2B). Kristali parmağa bağlarken hava kabarcıklarından kaçının, çünkü parmaktan çubuğa etkili ısı transferini engeller.</li>
	<li>Buz kristalinin çapının yaklaşık iki katı olan yarım küre bir kabı filtrelenmiş deiyonize su veya tamponla doldurun, yaklaşık 4 °C'ye soğutun. Soğuk parmakla bağlanmış buz kristalini bardağa batırın ve fazla suyu veya tamponu, buz kristalinin üst kısmının sıvı tabaka ile yaklaşık olarak düz olması ve buzun fincan duvarlarına dokunmaması için çıkarın.<ol>
<li>Kabı yalıtımla örtün ve sıcaklığı -5 °C'ye düşürin.</li>
		<li>Buz kristalinin bir yarımküreye oluşması için yaklaşık 1 saat bekleyin ve durumunu yaklaşık her 20 dakikada bir kontrol edin (Şekil 2C).</li>
		<li>Buz, buz kristalini eriterek ve büyüterek yarım küre kabının şeklini alacaktır, ancak fincan duvarlarına dokunmak asla aşırı büyümemelidir. Duvar ve yarımküre arasında en az 1 cm boşluk olmalı ve soğuk parmak buzdan çıkıntı yapmamalı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kabı buz kristalinden çıkarın ve floresan protein çözeltisini 25-30 ml'lik son hacme ve istenen analiz konsantrasyonuna ekleyin, fincandaki toplam sıvı hacmini değiştirmemeye dikkat edin. Tipik bir AFP konsantrasyonu 0.1 mg/ml'dir.<ol>
<li>Buz kristalini bardağa yeniden yerleştirin, böylece buz kristalinin üstü sıvı ile aynı seviyededir ve buz kristali fincan duvarlarına dokunmaz (Şekil 2D).</li>
		<li>Soğuk parmak sıcaklığını -8 °C'ye bırakın ve protein çözeltisinin 2-3 saat boyunca buz kristaline donmasını ve çözeltiyi sık sık karıştırmasını bırakın. Protein çözeltisinden oluşan buz, buz büyümesini durdurmadan önce en az 5 mm olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Buz kristalini soğuk parmağa bağlıyken bardaktan çıkarın. Soğutucuyu soğuk parmaktan 0 °C'nin hemen üzerine ısıtarak buzu ikincisinden ayırın ve buz kristali eriyene kadar bekleyin.</li>
	<li>Kristal düz tarafı, yeni oluşan buza dokunmamaya dikkat ederek tartım kabı gibi temiz bir yüzeye yerleştirin ve teslim etmeden önce en az 20 dakika boyunca -20 ° C'de saklayın.</li>
</ol>4. Antifriz proteinine bağlı Buz Düzlemlerinin Görselleştirilmesi
<ol><li>Floresan görselleştirme, karanlık bir dondurucuda veya soğuk bir odada, buz kristali düz tarafını, floresan etiketi ve kamera emisyon filtrelerini diğer spesifik olmayan ışıkları engellemek için heyecanlandırmak için dalga boyuna özgü uyarılma filtrelerine sahip lambaların altına yerleştirerek yapılır. Desene göre, AFP'lere bağlı buz düzlemleri tahmin edilebilir (Şekil 4).</li>
	<li>Dalga boyuna özgü ışıklar mevcut değilse, bunun yerine bir UV ışık kutusu kullanılabilir.</li>
	<li>Geleneksel buz etches, buz yarımküresinin en az 3 saat boyunca -20 °C'de yüce olmasına izin vererek de gerçekleştirilebilir, bundan sonra artık protein tozu buz yüzeyinde görülebilir hale gelebilir (Şekil 5).</li>
	<li>2.3. adım, tamamlanmış buz yarımkürenin a-eksenlerinin yönünü belirlemek için tekrarlanabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+peptides+and+glycopeptides+in+cold-water+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes.</a> Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).</li>
<li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochemistry+-+heat-stable+antifreeze+protein+from+grass%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).</li>
<li>Tomczak, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+stabilization+of+membranes+at+low+temperatures+by+an+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein.</a> Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).</li>
<li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+Ca-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Hyperactive Ca-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).</li>
<li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchored+clathrate+waters+bind+antifreeze+proteins+to+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).</li>
<li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+a+bacterial+antifreeze+protein+as+an+adhesin+with+ice-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity.</a> Plos One. 7 (11), (2012).</li>
<li>Raymond, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+ice-binding+proteins+change+the+structure+of+sea+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).</li>
<li>Raymond, J. A., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li>
<li>Baardsnes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ice-binding+face+for+type+i+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">New ice-binding face for type i antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).</li>
<li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li>
<li>Garnham, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+ice-binding+site+of+an+antifreeze+protein+revealed+by+mutagenesis+and+fluorescent+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging.</a> Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).</li>
<li>Nutt, D. R., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+the+hydration+layer+around+an+antifreeze+protein+revealed+by+atomistic+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).</li>
<li>Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal-surface+planes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li>
<li>Antson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+mechanism+of+ice+binding+by+type+iii+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins.</a> J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).</li>
<li>Graether, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-helix+structure+and+ice-binding+properties+of+a+hyperactive+antifreeze+protein+from+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect.</a> Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).</li>
<li>Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+spruce+budworm+antifreeze+protein+interacting+with+ice+crystals%3A+Basal+plane+affinity+confers+hyperactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity.</a> Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).</li>
<li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).</li>
<li>Scotter, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+for+hyperactivity+of+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">The basis for hyperactivity of antifreeze proteins.</a> Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).</li>
<li>Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+biomolecules+to+ice+and+their+effects+upon+ice+growth.+1.+Measuring+adsorption+orientations+and+initial+results%5BTitle%5D)+AND+%22Crys.+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results.</a> Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).</li>
<li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+insect+antifreeze+protein+and+its+implications+for+ice+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding.</a> J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).</li>
<li>Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+naturally+inactive+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein+into+one+that+can+stop+the+growth+of+ice%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice.</a> FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).</li>
<li>Holt, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+antifreeze+proteins+and+poly%28vinyl+alcohol%29+on+the+nucleation+of+ice%3A+A+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study.</a> Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).</li>
<li>Knight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+growing+large%2C+optically+%27%27perfect%27%27+ice+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Glac%22%5BJournal%5D)">A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals.</a> J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).</li>
<li>Hobbs, P. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHobbs%2C+PV+%22Ice+physics%22">Ice physics</a>. , Clarendon Press. Oxford. 200-248 (1974).</li>
<li>Knight, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+crystallographic+etch+pits+on+ice%2C+and+its+application+to+the+study+of+hailstones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Meteorol%22%5BJournal%5D)">Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones.</a> J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).</li>
<li>Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+antifreeze+polypeptide+and+its+mechanistic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications.</a> Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).</li>
<li>Sicheri, F., Yang, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-binding+structure+and+mechanism+of+an+antifreeze+protein+from+winter+flounder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder.</a> Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).</li>
<li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+glycopeptides+and+peptides+in+inhibition+of+crystallization+of+water+in+polar+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+T+Roy.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes.</a> Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).</li>
<li>Pertaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+evidence+for+quasi-permanent+attachment+of+antifreeze+proteins+to+ice+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces.</a> Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).</li>
<li>Kondo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-binding+site+of+snow+mold+fungus+antifreeze+protein+deviates+from+structural+regularity+and+high+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).</li>
<li>Mok, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+superior+activity+of+the+large+isoform+of+snow+flea+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein.</a> Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).</li>
<li>Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+active+qae+isoform+confers+thermal+hysteresis+activity+on+a+defective+sp+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein.</a> FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).</li>
<li>Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+ice+growth+and+melting+modifications+by+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins.</a> J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).</li>
<li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li>
<li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dimeric+beta-helical+model+of+an+ice+nucleation+protein+with+bridged+active+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites.</a> BMC Struct. Biol. 11, (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması bildirilmedi.

AFP'ye bağlı buz uçaklarının belirlenmesi için Charles Knight tarafından buz aşındırma yönteminin geliştirilmesi, AFP'ler tarafından buz bağlama mekanizması üzerinde büyük ölçüde ileri çalışmalar. AFP'lerin yapıları X-ışını kristalografisi26,27 ile çözülebilirken, AFP'nin bağlı olduğu buz üzerindeki tamamlayıcı yüzeyi çıkarmak için belirgin bir yöntem yoktu. Kış flounder tip I AFP başlangıçta karakterize edildiğinde, buz birincil prizma düzlemleri bağlamak için hipotezedildi 28. Bununla birlikte, Kn...

Antifriz proteinlerinin (AFP) üretimi, buz yüklü ortamlarda yaşayan bazı organizmaların önemli bir hayatta kalma mekanizmasıdır. Yakın zamana kadar, AFP'lerin tek işlevinin dolaşımı engelleyecek, doku hasarına ve ozmotik strese neden olacak iç buz kristallerinin büyümesini önlemek veya yavaşlatmak olduğu düşünülüyordu. Balık gibi herhangi bir donma derecesini tolere edemeyen organizmalar, buz kristali büyümesini tamamen engellemek için AFP'leri ifade eder1. Çim gibi diğerleri, donmaya karşı dayanıklıdır ve dokularında büyük buz kristallerinin oluşumunu azaltan buz rekristalizasyonunu inhibe etmek için AFP'leri ifade eder2. Düşük sıcaklıktaki membranların stabilizasyonu, AFP'ler için önerilen başka bir işlevdir3. Son zamanlarda, bir Antarktika bakterisinin AFP'si için yeni bir rol önerildi, Marinomonas primoryensis, buzla kaplı acı göllerden4. Bu AFP, oksijen ve besin maddelerine daha iyi erişim için bakteriyi buza tutturdığı düşünülen çok daha büyük bir adhesinproteini 5'inbir parçasıdır 6 . Diğer mikropların, içinde yaşadıkları buzun yapısını değiştirebilecek AP'leri salgıladığı bilinmektedir7.
AFP'ler bazı balıklarda, böceklerde, bitkilerde, alglerde, bakterilerde, diatomlarda ve mantarlarda bulunmuştur. Çeşitli durumlarda farklı soydaşlardan evrimleriyle tutarlı son derece farklı dizilere ve yapılara sahiptirler; ve yine de hepsi buza bağlanır ve adsorpsiyon-inhibisyon mekanizması ile büyümesini engeller8. AP'lerin her biri, buz bağlama bölgesi (IBS) görevi görür. Bunlar tipik olarak9-11yüzey kalıntılarının bölgeye yönlendirilmiş mutajenisi ile tanımlanmıştır. IBS, su moleküllerini belirli buz düzlemleriyle eşleşen buz benzeri bir desende düzenlemek için hipotezlenmiştir. Böylece AFP ligandını bağlamadan önce oluşturur5, 12. Buz uçakları Miller endeksleri tarafından tanımlanabilir ve farklı AFP'ler farklı düzlemlere bağlanabilir. Bu nedenle, kış flounder'ından tip I AFP, 20-21 piramit düzlemlerinebağlanır 13, tip III AFP, bileşik bir buz bağlayıcı yüzey11,14kullanarak hem birincil prizma hem de piramit düzlemlerini bağlar, hiperaktif bir AFP olan ladin budworm AFP ise hem birincil hem de bazal uçaklara aynı andabağlanır 15,16. MpAFP gibi diğer hiperaktif AFP'ler, tek buz kristali yarımkürelerinin tam kapsamı ile gösterildiği gibi birden fazla buz düzlemine bağlanır5,17. Hiperaktif AFP'lerin bazal düzlemi ve diğer uçakları bağlama yeteneğinin, orta derecede aktif AFP'ler18üzerinde 10 kat daha yüksek aktivitelerini hesaba katabileceği varsayılmaktadır. Hiperaktif AFP'lerin verimliliği iyi belgelenmiş olsa da, birden fazla buz düzlemine bağlanma yetenekleri hala anlaşılamamıştır.
AFP'ye bağlı buz uçaklarını belirlemek için orijinal yöntem Charles Knight13,19tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntemde, makroskopik tek bir buz kristali içi boş bir metal çubuğa (soğuk parmak) monte edilir ve gazsız suyla dolu yarım küreye batırılarak yarımküreye oluşturulur. Daha sonra, yarımküre seyreltilmiş bir AFP çözeltisine batırılır ve AFP çözeltisinden buz kristali yarımküresine soğuk parmaktan dolaşan etilen glikolün sıcaklığı tarafından kontrol edilen birkaç saat içinde bir buz tabakası yetiştirilir. Buz kristali çözeltiden çıkarılır, soğuk parmaktan ayrılır ve -10 ila -15 ° C dondurucu odasına yerleştirilir. Yüzey, antifriz protein çözeltisinin donmuş yüzey filmini çıkarmak için keskin bir bıçakla kazınmıştır ve buz kristalinin en az 3 saat boyunca yüce olmasına izin verilir. Süblimasyondan sonra, AFP'ler tarafından bağlanan buz düzlemleri, artık proteinden elde edilen beyaz kazınmış desenler olarak görülebilir. Buz yarımküre, buzun bazal ve prizma düzlemlerini bulmak ve kazınmış yamaların Miller endekslerini belirlemek için ceksenine ve bir-eksenlerine yönlendirilebilir.
Burada, FLORESAN bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA)11olarak adlandırdığımız bir yöntem olan AFP'ye bağlı buz düzlemlerini belirlemek için orijinal yöntemin bir değişikliğini açıklıyoruz. AFP'ler, yeşil floresan protein (GFP)11,16,17,20gibi bir kimerik etiketle veya AFP5,21'eyaygın olarak bağlı bir floresan boya ile floresan olarak etiketlenmiştir. Floresan etiketli AFP'ler tek bir buz kristaline adsorbe edilir ve orijinal buz aşındırma deneyleriyle aynı deneysel prosedür kullanılarak büyür. AFP'nin büyüyen buz yarımküreye bağlanmasının boyutu, deney boyunca ultraviyole (UV) lamba kullanılarak izlenebilir. Deney tamamlandıktan sonra, yarımküre doğrudan soğuk parmaktan çıkarılabilir ve süblimasyon olmadan görüntülenebilir. Bununla birlikte, istenirse, yarımküre geleneksel bir buz kazımasını görselleştirmek için yüce bırakılabilir. FIPA metodolojisine getirilen değişiklikler, geleneksel buz aşındırma protokolünü birkaç saat kısaltır. Ayrıca, AFP'ye bağlı buz düzlemlerinin çakışan desenlerini görselleştirmek için her biri farklı bir floresan etikete sahip birkaç AFP'yi aynı anda görüntüleme potansiyeli vardır.

<table><tbody><tr><td>NESLAB RTE Soğutma Banyosu/Sirkülatörler</td><td>Thermo Scientific</td><td>RTE7</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol, Önceden Karıştırılmış Antifriz/Soğutucu</td><td>Sertifikalı</td><td>29-3037-0</td><td>Ortak otomotiv antifrizi</td></tr><tr><td>Soğuk parmak</td><td>mevcut</td><td>değil mevcut değil</td><td>Özel yapım pirinç (9 cm uzunluğunda, 1,5 cm dış çap)Yarım</td></tr> küre <tr><td>kap</td><td>mevcut değil</td> mevcut <td>değil</td><td>Reçine ile özel yapım (8 cm dış çap, 6 cm iç çap)</td></tr> <tr><td>Yüksek Çift Çıkışlı Aydınlatma Sistemi</td><td>Lightools Research</td><td>LT-99D2, Illumatools DLS 120 volt AC, LT-9470FX, LT-9549FX</td><td>Ek ve özel uyarma filtreleri Lightools Research Camera'dan satın alınabilir</td></tr><tr><td></td><td>Canon</td><td>EOS 50D</td><td></td></tr><tr><td>Emisyon Filtreleri</td><td>Lightools Research</td><td>LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG</td><td>Filtreyi kamera merceğine takmak için filtre halkası adaptörü gerekebilir</td></tr></tbody></table>

floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi ile antifriz proteinlerinin buz bağlayıcı düzlemlerinin belirlenmesi

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifriz proteinleri (AFP'ler), iç buz büyümesini önlemek veya yavaşlatmak için çeşitli soğuk sert organizmalarda ifade edilir. AP'ler buz bağlayıcı yüzeylerinden belirli buz düzlemlerine bağlanırlar. Floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA) analizi, AP'lerin bağlandığı buz düzlemlerini belirlemek için kullanılan değiştirilmiş bir tekniktir. FIPA, AFP'ye bağlı buz düzlemlerini belirlemek için orijinal buz aşındırma yöntemine dayanmaktadır. Kısaltılmış deneysel sürede daha net görüntüler üretir. FIPA analizinde, AFP'ler floresan olarak bir kimerik etiket veya kurvalent boya ile etiketlenir, daha sonra yavaşça bir yarımküreye önceden biçimlendirilmiş ve a ve ceksenlerini belirlemeye yönelik makroskopik tek bir buz kristaline dahil edilir. AFP'ye bağlı buz yarımküresi, spesifik olmayan ışığı engellemek için filtreler kullanarak AFP'ye bağlı düzlemleri görselleştirmek için UV ışığı altında görüntülenir. AFP'lerin floresan etiketlemesi, AFP adsorpsiyonunun buza gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Etiketlerin, AFP'lerin bağlandığı uçakları etkilemediği bulunmuştur. FIPA analizi ayrıca, bağlama düzlemlerini ayırt etmeye yardımcı olmak için aynı tek buz kristaline birden fazla farklı etiketli AFP bağlama seçeneği sunar. FIPA'nın bu uygulamaları, AFP'lerin büyümesini durdurmak için buza nasıl bağlanıp bağlanmasını ve birçok AFP üreten organizmanın neden birden fazla AFP izoformunu ifade ettiğini anlamamızı ilerletmeye yardımcı oluyor.

Tek buz kristalinin hazırlanması ve montajı, hataların en sık yapıldığı FIPA prosedürünün iki adımıdır. Hazırlanan buz kristalinin tek olup olmadığının belirlenmesi, protokol bölümünün 2.1. FIPA analizi için çok kanallı bir buz kristali kullanılırsa, sonuç, tutarlı bir bağlama deseni olmadan yarımküredeki AFP'lerin süreksiz bağlanması olacaktır (Şekil 6B). Buz kristali arayüzleri, AFP'nin bağlandığı buz düzlemlerinin etrafında bulunuyorsa, nihai sonuç yorumlanabilir olmayabilir. Bu neden...

Antifriz proteinleri (AFP'ler) buz büyümesini önlemek veya yavaşlatmak için belirli buz düzlemlerine bağlanır. Floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA) analizi, AFP'ye bağlı buz düzlemlerinin belirlenmesi için orijinal buz aşındırma yönteminin bir modifikasyonudur. AFP'ler floresan olarak etiketlenir, makroskopik tek buz kristallerine dahil edilir ve UV ışığı altında görselleştirilir.

Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, floresan işaretli antifriz proteinleri tarafından sınırlandırılan buz düzlemlerini görselleştirmektir. Bu, ikinci bir adımda antifriz proteinlerinin bağlanabileceği tekil buz kristallerinin büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Her bir kristalin tekilliği ve yönelimi, çapraz polarizörler aracılığıyla incelenir.Ardından, sıcaklığı kontrol edilen bir soğutma çubuğuna bir buz kristali yerleştirilir ve yarım küre şeklinde oluşturulur. Daha sonra, antifriz proteinini büyüyen yarım kürenin spesifik bağlanma düzlemlerine absorbe etmek amacıyla, floresan işaretli antifriz proteinleri içeren bir çözeltiye daldırılır. Buz sonuçları, karanlık bir soğuk odada, dalga boyuna özgü ışık ve filtreler kullanılarak floresan işaretli antifriz proteininin bağlandığı buzun görselleştirilmesi ve görüntülenmesiyle elde edilir.Bu tekniğin buz aşındırma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, protein bağlı buz düzlemlerinin anında görselleştirilmesine olanak tanımak için antifriz proteinlerinin floresanla işaretlenmiş olmasıdır. Eksi 0.5 °C'de sıcaklık kontrollü bir etilen glikol banyosu hazırlayarak ve bu banyonun içine sığabilen ve üzerinde yüzebilen temiz bir metal kap bular

determining-ice-binding-planes-antifreeze-proteins-fluorescence-based

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

SiO Kantitatif, yüksek verimli, gerçek zamanlı ve etiket ücretsiz biyomoleküler algılama (DNA, protein,...

Biyomoleküler Algılama istihdam İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensörü (IRIS)

Ayrıca antifriz proteinleri olarak bilinen buz bağlayıcı protein (IBPs), buz büyümesini engelleyen ve doku dondurma kullanım için umut verici bir katkı maddesi vardır. IBPs araştırmak için kullanılan başlıca araç nanolitre Osmometer olduğunu. Biz bir optik mikroskop üzerine monte edilmiş bir ev tasarlanmış soğutma aşamasında geliştirilen ve özel olarak geliştirilmiş bir LabVIEW rutin kullanılarak kontrol. Nanolitre Osmometer ultra-hassas bir şekilde numune sıcaklık manipüle burada açıklanan.

Buz Bağlayıcı Protein İncelemelerde LabVIEW çalıştırılan Roman nanolitre Ozmometre

Bu videoda, florofor etiketli Shwachman-elmas sendromu (SBDS) proteini ile uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimleri incelemek için floresan anizotropi tekniğini açıklıyoruz. SBDS proteinlerinin kademeli olarak artan EFL1 konsantrasyonları ile inkübe edilmesinde, iki protein arasında başarılı bir etkileşime işaret eden anizotropide sabit bir artış gözlenir.

Protein-Protein Etkileşimlerinin Floresan Anizotropi Tabanlı Tespiti

Bu videoda, transkripsiyon faktörleri ve DNA arasındaki etkileşimi izlemeye yardımcı olan yüksek performanslı floresan anizotropisi açıklanmaktadır. Test, florofor etiketli DNA'nın moleküler rotasyonu veya anizotropisine bağlı polarizasyon derecesini ölçerek, florofor etiketli bir DNA molekülünün spesifik transkripsiyon faktörü ile etkileşimlerini izler.

Transkripsiyon Faktörü-DNA Bağlanma Afinitesini Belirlemek için Floresan Anizotropisi

Diferansiyel taramalı florimetri, proteinlerle etkileşimler için küçük molekül kütüphanelerini taramak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Burada, küçük bir molekül ile protein ortağı arasındaki ayrışma sabitinin bir tahminini sağlamak için bu analizleri genişletmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD'ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

MicroScale Thermophoresis (MST), aptamer-hedef etkileşimlerini karakterize etmek için hassas bir teknolojidir. Bu el yazması, aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmek için bir MST protokolünü açıklamaktadır.

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Bu çalışma, buz yeniden kristalleşme engelleme etkinliği ve buzlu afinite saflaştırmasını kullanarak yerel öğren daha sonra tecrit değerlendirme yoluyla dondurularak dayanıklı bitkiler buz bağlayıcı proteinin tanımlanmasını açıklar.

Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları peptid benzeşme reaktifler, antikorlar için güçlü bir alternatif keşfi için kanıtlanmış bir tekniktir. Yarı Otomatik sıralama yöntemini burada yanlış pozitif oluşumunu azaltmak için biopanning aerodinamik. Burada düşünce süreci ve adayların değerlendirilmesi ve aşağı akım analizi en aza indirerek uygulanan teknikler gösterilmektedir.

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Mevcut protokol, mikroakışkan cihazlarda mikroskobik buz kristallerinin ve klatrat hidratların kristalleşmesini tanımlamakta ve oluşan kristallerin etrafında sıvı değişimini sağlamaktadır. Bu, inhibitörlerin kristalleşme sürecini ve bağlanma mekanizmalarını incelemek için eşsiz olanaklar sağlar.

Buz ve Klatrat Hidrat Kristalizasyonunun İncelenmesi için Mikroakışkan Bir Yaklaşım

Öğrenin, floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi yöntemiyle antifriz proteinlerinin buz kristallerine bağlanma düzlemlerini görselleştirmeyi. Bu teknik, kriyobiyolojide protein etkileşimlerini anlamak için kullanılır.

Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet