İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Bu mikroakışkan teknoloji, insan nötrofillerinin işlevselliğini, çoğullanabilen bir platform üzerinde doğrudan bir damla kandan ölçmeyi amaçlamaktadır. Merkezi yükleme odası bir tam kan kaynağı görevi görür ve aynı zamanda 16 fokal kemotaktik odacıktan oluşan kemoterapi cezbedici gradyanlar için bir lavabo görevi görür. Kırmızı kan hücrelerinin benzersiz mekanik filtrasyonu, nötrofillerin işlevinin kan, hücresel ve biyokimyasal bileşenlerin doğal bağlamında araştırılmasını sağlar.

Fokal kemotaktik odaya giden bir kanal ile cihazdan çıkan bir kanal arasındaki çatallanma, göç eden nötrofillerin yönlülüğünün ölçülmesine ve modülasyonuna izin verir. Bu nedenle, sonuçlar, aktif olarak göç eden nötrofillerin sıkışmış kırmızı kan hücrelerini nasıl kolayca geçtiğini ve zaman içinde sayıca biriktiğini gösterebilir. Mikroakışkan cihazlarımızın benzersiz bir özelliği, üretimlerinin ve kurulumlarının çok kolay olmasıdır.

Cam tabanlı, tek veya çok kuyulu bir plaka üzerine yapıştırdığımız mikro fabrikasyon bir gofret üzerine dökülmüş bir PDMS katmanından oluşurlar. Bu tekniğin temel avantajı, sadece bir damla tam kan gerektirmesidir. Cihazlar standart pipetlerle kullanılabilir, hareketli parçaları yoktur, boru veya harici şırınga pompası gerektirmez.

Bu tekniğin etkileri, geleneksel tekniklerde gerekli olan klinik uygulamalara kıyasla klinik uygulamalara kadar uzanır. Yaklaşımımız, kan alma zamanından nötrofil migrasyon testlerine kadar dakikalar alır. Yeni kırmızı kan hücresi filtreleme tarakları, eritrositlerin nötrofillerin aktif göçünü bloke etmesini önler ve bu yöntemleri diğer mikroakışkan yöntemlerden ayırır.

Bu, kemoterapi tahlilleri yapılmadan önce kanın alınmasını gerektirir. Kırmızı kan hücrelerinin ve kanallarının mekanik olarak sıkışması, teknolojimizi ayırt eder ve serum ve trombositler de dahil olmak üzere tam kanın fizyolojik ortamındaki nötrofillerin test edilmesini sağlar. Bu nedenle teknoloji kesin ve kullanımı kolaydır ve nötrofillerin ve C'nin doğuştan gelen bağışıklık sisteminin sağlık ve hastalıktaki rolü hakkındaki anlayışımızı önemli ölçüde ilerletebilir.

Göç kanallarını üreticinin İlk modelinden gelen talimatlara göre tanımlamak için ana kalıp gofretini üretin. İlk üç mikron epoksi bazlı negatif fotorezist katman, daha sonra hücre yükleme ve kemokin odalarını tanımlamak için ikinci 50 mikronluk katmanı desenlendirir. Şimdi döküm Polimetil soane cihazları, 20 gram PDMS'yi iki gram başlatıcı ile beş dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.

PDMS'yi desenli gofret üzerine dikkatlice dökün ve bir saat boyunca vakumda kurutun. Daha sonra PDMS mikroakışkan cihazlarını 65 derecelik bir fırında en az üç saat pişirin ve kürleyin. PDMS'nin doğru sıcaklıkta piştiğinden emin olmak için fırının iç sıcaklığını bir termometre ile izlediğinizden emin olun.

1,5 milimetre çapındaki merkezi tam kan yükleme odalarını delin. Ayrıca 5.0 milimetre çapındaki bütün çörek şeklindeki cihazları da delin. Yapışkan bant kullanarak halka cihazlarındaki parçacıkları çıkarın.

Daha sonra, çok kuyulu bir plakayı deiyonize su ile durulayın ve plakayı beş dakika boyunca 60 derecelik bir fırına yerleştirdikten sonra nitrojen ile kurulayın. 35 saniye boyunca oksijen plazma tedavisi. Ardından halka cihazlarını ve oksijen plazmasını ekleyin.

35 saniye daha tekrar tedavi edin. Cihazları dikkatlice plakanın kuyucuklarına aktarın ve 80 derece sıcak plaka üzerinde 10 dakika boyunca bağlı cihazlarla pişirin. Oksijen plazma işleminden sonra, cihaz hidrofiliktir ve kılcal etkiler, cihazdaki küçük kanalların astarlanmasını teşvik edebilir.

Kemoterapi cezbedici solüsyon için, beş mikrolitre 10 mikromolar FMLP'yi, mililitre fibronektin başına beş mikrolitre bir miligram ve 490 mikrolitre HBSS ile karıştırın. Kemoterapi cezbedici solüsyonu tam kan yükleme haznesi pipetine ve cihazın dışına ek olarak 20 mikrolitre kemoterapi cezbedici solüsyona yavaşça pipetleyin. Plakayı 15 dakika kurutun.

Cihazı kemoterapi cezbedici solüsyonla astarlamak için cihaza bir vakum uygulayın. Plakayı kurutucudan çıkarın ve hava kabarcığının boyutunu kademeli olarak azaltarak cihaz kanalının ıslandığını onaylayın. Ardından, fazla kemoterapi cezbedici solüsyonu çıkarmak için tüm kan yükleme haznesini ve cihazın dışını iyice yıkayın.

Ardından, fokal kemotaktik odaların her birinden cihaz merkezine bir kemoterapi çekici gradyanı oluşturmak için. Cihazın üstünde bir PBS damlası oluşacak şekilde deliğe yavaşça 100 mikrolitre PBS enjekte edin. Plakayı eğin ve kuyunun dibinde toplamak için cihazın etrafına bir mililitre PBS pipetleyin, sıvıyı aspire edin ve PBS yıkamasını üç kez tekrarlayın.

Ardından, cihazları daldırmak için her bir kuyuyu ortamla doldurun ve gradyanın dengelenmesi için 15 dakika bekleyin. Daha sonra her bir tam kan yükleme haznesine iki mikrolitre tam kanı yavaşça pipetleyin. Parmak delici kan alımı için ellerinizi sabun ve suyla yıkayın.

Cildi pıhtılaşmayı önleyici bir leke çözeltisi olarak kurulayın. Bir mililitre% 0.2 HSA ve 10 mikrolitre 32.4 mikromolar kanca ekleyin. Bir heparin kan alma tüpüne boyayın, sağlıklı donörün parmağını delin ve ilk kan damlasını silin.

Antikoagülan leke çözeltisine 50 mikrolitre kan toplayın ve yavaşça karıştırın. Biyo odayı 37 santigrat dereceye,% 80 neme ve% 5 CO2'ye ayarlayın. Anlamlı istatistiksel analiz için hızlandırılmış görüntülemeyi hemen 10 x veya daha yüksek büyütmede başlatın Her örnekte en az 50 nötrofili manuel olarak izleyin.

Zamanla fokal kemotaksis odalarına giren hücreleri sayın. Ardından J görüntüsünü kullanarak, WBLC ve FCC arasındaki kanaldaki nötrofil hızlarını hesaplayın. Daha sonra nötrofillerin yönlülüğünü ölçmek için, çatallanmayı geçen hücrelerin sayısını sayın ve fokal kemotaksis odalarına doğru dönen hücre sayısı ile cihazdan çıkan hücreler arasındaki oranı hesaplayın.

Yönlü olmayan hücreler kemotaktik gradyanı takip etmez ve bu nedenle FCC'ye ve çıkış kanalına eşit sayıda göç eder. Bu deneyde, tam kan nötrofil kemotaksis testi, nötrofillerin bir FMLP gradyanına doğru birikimi ölçülerek doğrulandı. Sonuçlar, kırmızı kan hücrelerinin filtrasyon tarağı tarafından yakalandığını, nötrofillerin ise aktif olarak tam kandan dışarı çıkabildiğini doğrulamaktadır.

Tam kan mikroakışkan cihazı tarafından oluşturulan stabil lineer kemoterapi cezbedici gradyan, FSE işaretli dekstran kullanılarak doğrulandı ve floresan seviyeleri zaman içinde ölçüldü. Yeni WB Kemotaksis platformu kullanılarak elde edilen sonuçlar, tüm kan kaynaklarından gelen nötrofillerin tutarlı bir hızla ve benzer toplam göç eden hücrelerle göç ettiğini ortaya koymaktadır. Daha da önemlisi, bu sistem nötrofillerin kantitasyonuna izin verir, bu nedenle kemotaksisi kemotaksiden ayırır Kinesis Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 10 dakikadan daha kısa sürede yapılabilir.

Cihazımızın standart temiz oda teknikleri, tesisler kullanılarak 12 veya 24 kuyulu bir plakaya dahil edilmesi, aynı anda birden fazla koşulun taranması. Bu tekniği kullanarak, tek hücre düzeyinde nötrofil hızını ve yönlülüğünü ölçebiliyoruz. Toplu uç nokta hücre göçünü ölçen geleneksel yöntemlerin aksine, mikroakışkan cihazı dikkatli bir şekilde hazırlamayı ve her iki numuneyi de yavaşça yüklemeyi unutmayın, böylece RBC'ler cihazın com'unu geçmez.

Açıklanan Protokol, geçici nötrofil kemotaktik eksikliklerini ölçmek için özellikle yararlıdır, birden fazla zaman noktasında tekrarlanan örneklemelere izin verir, ancak aynı zamanda farklı model organizmalardan diğer hücre tiplerinin göçünü ölçmek için de uyarlanabilir. Bu yöntem, travma hastaları, majör cerrahi sonrası hastalar ve kemoterapi alan kanser hastaları dahil olmak üzere daha yüksek enfeksiyon insidansı ile ilişkili çeşitli durumları olan hastalarda nötrofil işlevselliğindeki geçici değişiklikler hakkında fikir verebilir.