Name: İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Öğrenin, işlenmemiş kandan nötrofil kemotaksisini mikroakışkan platform kullanarak hızlı ve kantitatif ölçme yöntemini. Bu teknik, hücre izolasyonuna gerek kalmadan tek damla kanla çalışır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ulusal Sağlık Enstitüleri Destek ve Shriners Burns Hastanesi (GM092804, DE019938 verir).

1.. Mikroakışkan Cihaz İmalatı <ol><li> Standart fotolitografik teknikleri kullanarak, bir sınıf 1.000 temiz oda ana kalıp gofret imal. Desen üreticisinin talimatlarına göre göç kanalları tanımlamak için ilk 3-mikron ince epoksi esaslı negatif Fotorezist tabaka. Desen hücre yükleme ve kemokin odaları tanımlamak için ikinci bir 50 mikron kalınlığında bir tabaka. </li><li> Polidimetilsiloksan (PDMS) cihazlar döküm desenli gofret kullanın. Şiddetle büyük plastik tartım tepsisine plastik çatal ile 5 dakika boyunca başlatıcı (2 g) ile PDMS (20 g) karıştırılır. </li><li> Dikkatle kalıp üzerine PDMS dökün. </li><li> 1 saat boyunca bir vakumlu desikatör içinde döküldü PDMS ile kalıp yerleştirerek PDMS gazdan arındırın. </li><li> Ve fırında 65 ° C&#39;ye ayarlanmış bir fırın içinde en az 3 saat boyunca PDMS mikroakışkan cihazları tedavi </li><li> 1.5 mm uç çaplı bir zımba kullanılarak merkezi WBLCs dışarı Punch. </li><li> Bir Punc kullanılarak bütün çörek şeklindeki cihazlar dışarı Punch5.0 mm uç çapı ile onu. </li><li> Yapışkan bant kullanılarak çörek aygıtlardan parçacıkları kaldırmak. </li><li> Iyonu giderilmiş su ve daha sonra kuru azot ile birlikte bir 12 oyuklu plaka durulayın. 5 dakika boyunca 60 ° C fırın içinde plaka koyun. </li><li> Oksijen plazma iki 12-yuvalı plaka tedavi; kez yalnız 35 saniye ve daha sonra tekrar başka bir 35 saniye için çörek cihazlar ile. </li><li> Dikkatlice cımbız kullanarak plakasının yuvaları içinde koyunuz. </li><li> 10 dakika boyunca 80 ° C&#39;ye set edilen bir sıcak plaka üzerinde bağlanmış aygıtlar ile Bake plakası. </li></ol> 2.. Mikroakışkan Assay hazırlanması <ol><li> Hemen oksijen plazma muamelesi, sonra, Prime mikroakışkan cihazlar, cihaz hidrofiliktir ve kılcal etkileri cihazda küçük kanalların hazırlanmasını teşvik zaman. </li><li> 5 ul fibronektin [stok çözeltisi, 1 mg / ml] ve 490 ul HBSS ile 5 ul fMLP [stok çözeltisi, 10 uM] karıştırılarak kemo-çekici bir çözüm oluşturur. </li><li> Yavaşça pipet &amp; #160; WBLC içine kemoatraktan çözeltisi, jel yükleme ucu (Şekil 1 A) kullanılmıştır. Cihazın dış çevresinde kemoatraktan Pipet ilave bir 20 ul. </li><li> 15 dakika boyunca bir desikatör içinde plaka koyun. Cihaza bir vakum uygulayarak, çözelti cihaz ve PDMS dışarı yayılan değiştiren hava yan kanal içine damlatılır. </li><li> Desikatörde plakasını çıkarın ve mikroskop altında cihaz kanal ıslanmasını onaylayın. Kemoatraktan çözüm odasına girer gibi kabarcık küçülür olarak izleyin. Resim kabarcık vakum tedavi sonrası aygıt içinde mevcut olması gerekmektedir. </li><li> WBLC yıkayın ve cihazın dışına iyice fazla kemo-çekici çözeltisi kaldırın. Bu adım, cihazın merkezi odak kemotaktik odalarına (FCCs) her birinden kemoatraktan gradyanı oluşturur. <ol><li> Şırınga, bir kör 30 G iğne ucu eklemek, PBS ile bir 1 ml şırınga doldurun. Yavaşça, şırınganın iğne ucu eklemekçörek delik merkezine. Yavaşça deliğe PBS içinde 100 ul itmek, böylece cihazın üstüne PBS formları bir damlacık. </li><li> Cihaz etrafında PBS eğimli plaka ve pipet 1 ml sıvı, kuyunun altındaki toplar, böylece. Aspire (ayrılmış nötrofiller medyada yüklenecek eğer yerine tampon kullanımı medya) taze tampon çözeltisi kullanılarak 3x toplam sıvı ve tekrar süreci 9. </li></ol></li><li> Cihazların başında sıvı altında batık kadar medya ile her iyi doldurun. Cihazlar degrade dengeye gelmesi için 15 dakika bekletin. Deney sonuçları ve sonlu eleman simülasyonlar teorik veri, bu cihazlarda gradyanlar küçük moleküller (örneğin, fMLP) ve daha büyük bir molekül ağırlığına (örneğin, IL-8) için bir kaç güne kadar 24 saat kadar kararlı olduğunu göstermektedir. </li><li> Jel yükleme ipuçlarını kullanarak, her biri yavaş yavaş bütün kan Boyu içine 2 ul kan (ya da izole edilmiş nötrofiller) pipetding odası (WBLC) (Şekil 1A). </li></ol> 3.. Numune Hazırlama Kılcal Kan itibaren İnsan Nötrofiller <ol><li> Hiçbir immünsüpresifler üzerinde sağlıklı gönüllü, parmak prick kapiller kan toplayın. Tüm hasta numuneleri yazılı bilgilendirilmiş rıza ile elde ve MGH&#39;de ve Shriners Kurumsal Değerlendirme Kurulları tarafından onaylanan prosedürleri aracılığıyla edildi. <ol><li> Parmak prick kan toplama, su ve sabunla ellerinizi yıkayın ve cilt kuru. Kan toplama tüpü (1.65 USP/50 ul kan) heparin 1 ml HBSS +% 0.2 HSA ve 10 ul Hoechst leke (32.4 uM) eklenmesi ile anti-coagulant/stain stok çözelti hazırlayın. Kan ilk damla silmekle yavaşça stok anti-koagülan ve Hoechst floresan boyası çözeltisi (10 ul) ihtiva eden Eppendorf tüpü içinde 50 ul kan toplanması, bir SurgiLance güvenlik neşter (2.2-mm derinlik, 22 G) kullanılarak parmak delin karıştırın. </li></ol></li&gt; <li> Çekirdek, floresan boyama için izin vermek için 10 dakika boyunca kan ve Hoechst leke inkübe edin. Kan toplama 1 saat içerisinde örnek çalıştırın. </li></ol> Venöz Kan itibaren İnsan Nötrofiller <ol start="3"><li> 33 USP heparin ihtiva eden tüplere periferal venöz kan 10 ml çizin. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi ortam ve Hoechst leke venöz kan 50 ul ekle. Çekirdek, floresan boyama için izin vermek için 10 dakika boyunca kan ve Hoechst leke inkübe edin. Kan toplama 1 saat içerisinde örnek çalıştırın. </li></ol> Kandan Nötrofil Ayrılık - Pozitif Kontrol <ol start="5"><li> , Nötrofil ayrı Heta nişasta kullanılarak 10 mi venöz bütün bir kan örneğinden ayırmak için nötrofil steril teknikler kullanmak için (6% w / v) ile, üreticinin protokolü takip edilerek, bir negatif seçim manyetik boncuk izolasyon kiti, ardından yoğunluk gradyanlı. </li><li> Bir concentr nötrofil nihai bir kısım Tekrar süspansiyon haline getirilen1X HBSS +% 0.2 insan serum albümin / ml 4000 hücre ation. Denemeyi çalıştırmak için hazır olana kadar 37 ° C hücreleri tutun. </li></ol> Nötrofil Kemotaksi Ölçümleri 4. Mikroskopi ve Görüntü Analizi <ol><li> % 5 37 ° C,% 80 nem ve CO 2 biochamber sıcaklığını ayarlayın. </li><li> Bir mikroskop (10X veya daha yüksek büyütme) zaman atlamalı görüntüleme kullanarak hemen görüntüleme başlayın. </li></ol> 5. İstatistiksel Analiz <ol><li> El ile her bir örnek olarak en az 50 nötrofil izler. </li><li> Zamanla giren FCC hücreleri (Şekil 2) sayısı. </li><li> ImageJ (NIH) (Şekil 2) kullanılarak WBLC ve FCC arasındaki kanalda nötrofil hızları hesaplayın. </li><li> Çatallanma geçmek hücrelerin sayısını sayma ve çıkış inci FCC ve hücrelere karşı çevirmek hücre sayısı arasındaki oranı hesaplayarak nötrofillerin yönünü ölçmeke cihaz. Yönlü olmayan hücreler, kemotaktik gradyanı takip eder ve bu nedenle, FCC ve çıkış kanalı (Şekil 2) doğru eşit sayıda geçiş yoktur. </li></ol>

<ol><li>Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and atherosclerosis.</a> Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).</li>
<li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+in+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).</li>
<li>Butler, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS one. 5, (2010).</li>
<li>Lavrentieva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+markers+in+patients+with+severe+burn+injury.+What+is+the+best+indicator+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Burns+%3A+journal+of+the+International+Society+for+Burn+Injuries%22%5BJournal%5D)">Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis.</a> Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).</li>
<li>De Filippo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+and+macrophage+chemokines+CXCL1%2FCXCL2+control+the+early+stage+of+neutrophil+recruitment+during+tissue+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation.</a> Blood. 121, 4930-4937 (2013).</li>
<li>Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+serum+heat+treatment+on+chemotaxis+and+phagocytosis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Palabrica, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+accumulation+promoting+fibrin+deposition+is+mediated+in+vivo+by+P-selectin+on+adherent+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets.</a> Nature. 359, 848-851 (1992).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+kit-on-a-lid%3A+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120, (2012).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chambers+for+monitoring+leukocyte+trafficking+and+humanized+nano-proresolving+medicines+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).</li>
<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).</li>
<li>Lyons, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+human+leucocyte+subsets%3A+the+advantages+of+positive+selection+and+rapid+purification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification.</a> BMC genomics. 8, (2007).</li>
<li>Hasenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PloS one. 6, (2011).</li>
<li>Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+assay+from+a+drop+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration assay from a drop of blood.</a> Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).</li>
<li>Hoang, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+neutrophil+speed+and+directionality+during+chemotaxis%2C+directly+from+a+droplet+of+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood.</a> Technology. 0, 1-9 (2013).</li>
<li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D2+restores+neutrophil+directionality+and+improves+survival+after+burns%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).</li>
<li>Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function+in+surgical+patients.+Relationship+to+adequate+bacterial+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses.</a> Arch Surg. 119, 39-43 (1984).</li>
<li>Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+inhibition+of+chemotaxis+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).</li>
</ol>

Ifşa hiçbir çıkar çatışması vardır.

Bu çalışmada, kan bir damlacık (2 ul) nötrofil kemotaksisini ölçmek için microfluidic platform geliştirdi. Aktif nötrofiller göç gelen RBCs on-chip mekanik filtrasyon nötrofiller aktive ederek eserleri tanıtmak eğilimli olan bu tür yoğunluk 10 eğimleri gibi hantal hücre ayırma yöntemleri, olumlu seçimi 11 veya negatif seçimi 12, ihtiyacını circumvents. RBCs mekanik filtrasyon nötrofil göçü sondalama diğer mikroakışkan cips teknoloji ayırır. Örneğin, laboratuarımızda 13 ve ikin...

<html> Nötrofil kaçakçılığı ateroskleroz 1, bakteriyel enfeksiyon veya sepsis 2 de dahil olmak üzere birçok enflamatuar koşulları, ilerleme ve çözünürlüğü belirlenmesinde önemli bir rol oynar, ve yaralanma 3 yakmak. Sağlık ve hastalık onların büyük katkılarından dolayı, nötrofil sayısı sıklıkla klinik ve araştırma laboratuvarlarında kabul standart kan analizinin bir parçasıdır. Ancak, en her yerde testlerden biri, enfeksiyon ve sepsis tanısında nötrofil sayısının değerini olmasına rağmen sık sık 4 sorgulanmıştır. Örneğin, yanık hastalarda nötrofil bir çalışma nötrofil sayısı ve nötrofil göç fonksiyon ilişkili olmadığı ortaya; nötrofil yalnız saymak anlamına bağışıklık durumu 3 doğru bir göstergesi değildir. Ölçülmesi daha zor olsa da, nötrofil fonksiyonel yetenek koşullarının geniş bir aralıkta daha değerli olarak önerilmiştir. t &quot;&gt; En önemlisi, nötrofil kusurları birçok geçici ve kalıcı genetik bozukluklar, büyük ölçüde yakın zamana kadar klinikte göz ardı edilmiş bir ayrım tarafından tetiklenen değildir. yanık yaralanmaları bağlamında, nötrofil göç sırasında takip edilebilir enflamatuar durum ya da enfeksiyona 3 bir göstergesi olarak bir hastanın tedavi bunlar kan geniş hacimli gerektirdiğinden. şu laboratuarda (Boyden haznesi Dunn odası, mikropipet deney) kullanılan geleneksel göç deneyler, klinik bir ortamda çevrilemeyen ve hantal zaman alıcıdır nötrofil izolasyon için gerekli kan hacmi sadece bir örnek için izin veren ve çoğu zaman da havuzu gerektirir, çünkü nötrofil izolasyon teknikleri (Tablo 1). Bu deneyler, aynı zamanda, örneğin, fare gibi küçük laboratuar hayvanları, nötrofil kemotaksis, geçici değişiklikleri izlemek için kullanılamaz Tek bir deney için, çok sayıdaki hayvandan alınan kan. Örneğin, ilgili bir çalışma mBirden çok zaman puan üzerinden ultiple koşulları ve tedaviler potansiyel mevcut kemotaksı deneyleri kullanılarak farelerin binlerce gerektirebilir. Bu hasar, enfeksiyon bağlamında bağışıklık fonksiyonunun karmaşık dinamiklerini anlamak ya da çoğu sıçangil modellerinde 5 incelenmiştir yakmak için yapılabilir temel biyolojik araştırmaları kısıtlar. Az kan hacmi gerektiren süre, hızlı sağlam bir nötrofil fonksiyonel tahlil için ihtiyacı karşılamak için, biz tam kan küçük bir damlacık doğrudan nötrofil kemotaksisini ölçen bir mikroakışkan cihaz geliştirdik. Bu serum 6 ve 7 de dahil olmak üzere platelet tüm kan içinde bir çok faktör, nötrofil fonksiyonunu etkileyen bilinmektedir. Bu, bütün kan mikroakışkan deney, bir in vitro deneyi ile 8 kemotaksis değişimlerin ölçülmesi sırasında nötrofil in vivo mikro korumak için örnek işleme en aza indirir bu nedenle faydalıdır. Bu yaklaşım, kan toplama geleneksel teknikleri kullanarak saatler nötrofil geçiş deneyleri için süreyi azaltır sadece birkaç dakika (Tablo 1). Tam kan mikroakışkan platformu, deney uzunluğu için sabit bir doğrusal gradyan kemoatraktan üreten hareketli parça ve bir dış basınç kaynağı (örn. şırınga pompası) gerektirmez. Tam kan mikroakışkan cihazın tasarımında önemli özelliği mekanik cihazın göç kanalı girmesini RBCs filtreleyen bir kırmızı kan hücresi (RBC) filtrasyon tarak birleşme olduğunu. Bu filtrasyon tarağın doğru dönüşleri muhtemel eritrosit ile tıkanmış olacağını boyut dışlama filtrasyon, ihtiyacını engeller ve bu nedenle de aktif WB göç nötrofil kemoatraktan ulaşmasını gradyanı bloke eder. 12 ya da 24 oyuklu bir plaka içerisinde, bütün kan mikroakışkan cihazın birleşme insan veya murin nötrofil kemotaksis si birden aracılarının tarama kolaylaştırırmultaneously.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Device Fabrication</td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Microchem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS)</td><td>Ellsworth Yapıştırıcılar</td><td>Sylgard 184 1.1 lb. Kit</td><td></td></tr><tr><td>Standart cam slaytlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>125495</td><td>1 X 3 inç</td></tr><tr><td>Cam alt plaka</td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td></td></tr><tr><td>Harris Tek Çekirdekli, Uç Çapı 5.0 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15081</td><td></td></tr><tr><td>Harris Tek Damarlı, Uç Çapı 1,5 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mikroakışkan Test Hazırlama ve Analizi</td></tr><tr><td>Jel yüklemeli pipet ucu</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-139</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Fisher Scientfic</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Künt uçlu iğne, 30 G &frac12; içinde.</td><td>Brico Medical Supply</td><td>BN3005</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer, Heparin</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5843-5G</td> HBSS Fibronektin Sigma-Aldrich F0895-1MG <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG'de</td><td>% 0.2 nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>SurgiLance güvenlik lanseti, 2,2 mm derinlik, 22 G</td><td></td><td>SLN240</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht boyası</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Positive Control</strong</td></tr><tr><td>>HetaSep</td><td>STEMCELL Technologies Inc.</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EasySep İnsan Nötrofil Zenginleştirme Kiti</td><td>STEMCELL Teknolojileri A.Ş.</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>Plazma Asher</td><td>March Instruments</td><td>P-250</td><td></td></tr><tr><td>Lindberg/Mavi M Fırın</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-258-30C</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Hassas Cımbız</td><td>Techni Tool</td><td>758TW458</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Scienceware Kimyasallara Dayanıklı Vakumlu Desikatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Dataplate Dijital Sıcak Plaka</td><td>Alpha Multiservices</td><td>PMC 720</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TiE ters mikroskop</td><td>Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td><td></td><td></td>MEA53100</tr><tr><td>CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objektif</td><td>Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td><td></td><td></td>Nikon</tr> Nikon <tr><td>için 2 Metre Işıklı MRH20101 Lümen 200</td><td>Kılavuzu - Micro Video Instruments Inc.</td><td>500-L200NI2</td><td></td></tr><tr><td>DAPI/Hoechst/AMCA Dar Bant 32 mm Uyarıcılar - 25 mm Yayıcılar</td><td>Chroma - Micro Video Instruments Inc.</td><td>31013v2</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R 2000 soğutmalı CCD Kamera 1,600 x 1,200 piksel</td><td>Qimaging - Micro Video Instruments Inc.</td><td>RET-2000R-F-M-12-C</td><td></td></tr></tbody></table>

İşlenmemiş kandan nötrofil kemotaksis Ölçüm mikroakışkan platformu

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Nötrofiller kanda enfeksiyonları ve sayıları karşı korunmada önemli bir rol oynamaktadır sıklıkla klinikte ölçülür. Düşük nötrofil enfeksiyonlar için yüksek riskler için bir uyarı işareti ise kandaki yüksek nötrofil, genellikle devam eden enfeksiyonların bir göstergesidir. Görevlerini başarmak için, nötrofiller de enfeksiyonları oluşabilir dokulara, hayatlarının çoğunu kandan etkili hareket edebilmek için var. Sonuç olarak, göç nötrofillerin yeteneğinde herhangi bir kusur nötrofiller kanda uygun bir sayıda mevcut olsa bile, enfeksiyon risklerini artırabilir. Ancak, klinikte nötrofil göç yeteneğini ölçmek, zaman alıcı, zor bir görev, bir büyük kan hacmi, ve uzman bilgi gerektirir. Bu sınırlamaları çözmek için, çevresi, işlenmemiş kan tek bir damlacık gerektirir, nötrofil göçü için sağlam bir mikroakışkan tahlilleri tasarlanmıştırnötrofil ayrılması için ihtiyaç delikleri, ve bir basit mikroskop ölçmek kolaydır. Bu deneyde, nötrofil kemoatraktan kaynağına doğru, küçük kanallar aracılığıyla, kan damlacık tarafından doğrudan geçiş. Aynı kanallardan kırmızı kan hücrelerinin granül akışını önlemek için, seçici olarak, kırmızı kan hücrelerinin ilerlemesini bloke eden döner dik açı ile mekanik filtreler uygulanmıştır. Biz parmak prick ve venöz kandan toplanan kan damlacıklarının nötrofil göçü karşılaştırarak tahlil valide. Biz de saflaştırılmış Nötrofillerin örneklerinden nötrofil göçü ile bu tam kan (WB) kaynaklar karşılaştırılmış ve üç kaynaklar arasında tutarlı hız ve yönlendirme bulundu. Bu mikroakışkan platformu sağlık ve hastalık nötrofil fonksiyonlarının anlayışımızı ilerletmek yardımcı olmak için klinik ve araştırma ortamında insan nötrofil göç çalışmayı sağlayacaktır.

Tam kan (WB) nötrofil kemotaksi deneyi, fMLP gradyanı (Film S1) karşı nötrofil birikimini ölçülmesiyle doğrulandı. Sonuçlar nötrofiller (mavi) aktif olarak tam kan (Şekil 3A ve Film S1) dışına göç mümkün iken eritrositler filtrasyon tarak tarafından tuzak olduğunu onaylayın. Bütün kan mikroakışkan cihaz tarafından oluşturulan duyarlı doğrusal bir kemo-çekici gradyanı (yeşil) FITC-işaretli dekstran (Şekil 3A ek) kullanılarak doğrulandı ve zaman içinde fl...

Bu protokol, sağlam tekrarlanabilirlik ile, bütün haldeki kan, bir damla, insan nötrofil kemotaksisi ölçmek için tasarlanmış bir tahlil göstermektedir. Bu yaklaşım, nötrofil ayrılması için ihtiyaç dışı eden ve deney hazırlama zaman sadece birkaç dakika gerektirir. Mikroakışkan çip bebeklerde veya örnek hacmi sınırlıdır küçük memeliler, zamanla nötrofil kemotaksisinin tekrarlanan ölçü sağlar.

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Bu mikroakışkan teknoloji, tek bir kan damlasından insan nötrofillerinin fonksiyonelliğini, çoklamaya uygun bir platform üzerinden doğrudan ölçmeyi amaçlamaktadır. Merkezi yükleme odası, hem tam kan kaynağı görevi görür hem de 16 odaklı kemotaktik odadan oluşan kemo-çekici gradyanlar için bir lavabo görevi üstlenir. Eritrositlerin benzersiz mekanik filtrasyonu, nötrofil fonksiyonlarının kanın hücresel ve biyokimyasal bileşenlerinin oluşturduğu doğal bağlamda incelenmesine olanak tanır.Fokal kemotaktik hazneye giden kanal ile cihazdan çıkan kanal arasındaki çatallanma, göç eden nötrofillerin yöneliminin nicelendirilmesine ve modüle edilmesine olanak tanır. Böylece sonuçlar, aktif olarak göç eden nötrofillerin, hapsolmuş eritrositlerin yanından kolayca nasıl geçtiğini ve zamanla sayıca nasıl biriktiğini gösterebilir. Mikroakışkan cihazlarımızın benzersiz özelliklerinden biri, üretilmelerinin ve kurulmalarının çok kolay olmasıdır.Bunlar, cam tabanlı, tekli veya çoklu kuyucuklu bir plakaya bağladığımız, mikro fabrikasyonla üretilmiş bir gofret üzerine dökülmüş bir PDMS tabakasından oluşur. Bu tekniğin temel avantajı, yalnızca bir damla tam kan gerektirmesidir. Cihazlar standart pipetle

microfluidic-platform-for-measuring-neutrophil-chemotaxis-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokol, chemoeffectors istikrarlı konsantrasyon gradyanlar bakteriyel kemotaksis soruşturma için bir mikroakışkan aygıt geliştirme açıklar.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Bu video, hepsi çip üzerinde bir yöntem kullanılarak nötrofil kemotaksisi testini göstermektedir. Yöntem, immünomanyetik negatif seçim ve ardından bir mikroakışkan çip üzerinde kemotaksis testi ile nötrofillerin tam kandan doğrudan izolasyonuna izin verir.

Tam Kan Kullanılarak Hızlı Nötrofil Kemotaksisi Analizi için Mikroakışkan Çip Tabanlı Bir Yöntem

Enfeksiyon bölgelerinde aktif endotele nötrofil bağlılık konağın inflamatuvar yanıt ayrılmaz bir bileşenidir. Için izin veren bir nötrofil bağlayıcı bir testtir Bu raporda...

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Görsel kemotaksis deneyleri kemoatraktan aracılı yönlü hücre göçü nasıl kontrol ökaryotik hücreler daha iyi anlaşılması için gereklidir. 1) Gerçek zamanlı, çoklu kemotaksis deneyleri yüksek çözünürlüklü izleme ve 2) aynı anda kemoatraktan degrade görselleştirmek ve nötrofil gibi HL60 hücrelerinde sinyal olaylarının zamanmekansal dinamiği: Burada ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Bu araştırmada, sarmal atalet Havacilik kapalı çevrim işlemi kullanılarak klinik hava yolu salgıları bir etiket içermeyen nötrofil ayırma yöntemi göstermektedir. Önerilen yöntem çeşitli solunum yolu hastalıkları klinik vitro deneyleri artıracağı.

Kapalı çevrim atalet Havacilik kullanarak hasta kaynaklı hava yolu salgı dan etiket içermeyen nötrofil zenginleştirme

Gelişimkolektif hücre göçü, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı genellikle büyüme faktörleri veya sinyal moleküllerinin gradyanları tarafından yönlendirilir. Burada açıklanan bir mikroakışkan sistem ve biyokimyasal gradyan altında kolektif göç mekaniği ölçmek için nasıl bir gösteri ile çekiş mikroskobu birleştiren deneysel bir sistemdir.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Bu protokol, mekansal olarak kontrol edilen nötrofil sürüsü sağlayan biyopartikül mikrodizileri üretir. Nötrofillerin göç sırasında serbest bırakıldığı arabuluculara kolay erişim sağlar ve nicel görüntüleme analizine olanak sağlar.

İnsan Nötrofil Swarming in vitro Kemotaktik ve Moleküler Analizi için Biyopartikül Mikrodizileri

Bu protokolde, fizyolojik olarak ilgili bir mikrovasküler ortamı yeniden üretebilen ve tüm lökosit adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen bir biyomimetik mikroakışkan testi, inflamatuar hastalıkta lökosit-endotel hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılmaktadır.

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Öğrenin, işlenmemiş kandan nötrofil kemotaksisini mikroakışkan platform kullanarak hızlı ve kantitatif ölçme yöntemini. Bu teknik, hücre izolasyonuna gerek kalmadan tek damla kanla çalışır.

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Daha fazla video keşfet