Test

Bu prosedürün genel amacı, Drosophila melanogaster'da koku alma duyusunu test etmek için basit bir Y labirenti deneyi sağlamaktır. Bu, öncelikle sineklerin 16 ila 18 saat boyunca aç bırakılmasıyla gerçekleştirilir; böylece uçucu uyaranların bulunduğu yeni ortamları keşfetme konusunda motive olurlar. Prosedürün ikinci adımı, filtre kağıdı üzerindeki koku kaynaklarını (örneğin, çözücü içindeki asetik asit ile sadece çözücünün karşılaştırılması gibi) içeren Y labirenti düzeneğinin kurulmasıdır.

Üçüncü adım, sineklerin yükleme vialine hızlı ve nazik bir şekilde yerleştirilmesidir. Birkaç saat sonraki son adım, sineklerin labirentteki konumlarının belirlenmesidir. Nihayetinde, Y labirenti ile elde edilen veriler, koku maddesine karşı verilen yanıtı gösterebilir.

Bu yöntem fikri, ilk olarak filumların koku tepkisini test etmek için basit ve düşük maliyetli bir yöntem geliştirme kararı aldığımızda ortaya çıktı. Bu tekniğin diğer seçeneklere göre bir avantajı, sineklerin aşırı stres altında olup olmadıklarına dair karar vermelerine olanak tanımasıdır. Prosedürü Megan Simon, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi uygulamalı olarak gösterecektir. Bu protokol için stabil ve güçlü davranışsal fenotiplere sahip, izojenize edilmiş bir sinek hattı hazırlayın. Bu tür herhangi bir stok, koku testi için referans kontrol olarak hizmet edecektir; deneyde kullanılacak her genetik suş için, suşu beş nesil boyunca referans suş ile geri çaprazlayın.

Her geri çaprazlama için tekli deneysel suş dişilerini birkaç izojenik erkekle eşleştirin. Koku deneyleri için drosophila'ları, 1212 ışık döngüsü altında, antibiyotikli standart mısır unu besiyerinde ve 25 °C'de tutun.

Deneyler her zaman 25 °C'de ve drosophila tarafından görülemeyen uzak kırmızı spektrumlu ışık altında yürütülmelidir. Ayrıca, bir sonraki sabah analiz gerçekleştirilmeden önce deneyler arasında odanın tamamen havalandırılması sağlanmalıdır. Gün sonunda, 10 ila 20'lik deneysel hat kohortları, nemi ıslak bir havlu ile sağlanan cam şişelere aktarılmalıdır.

Sinekler 16 ila 18 saat içinde test edilmelidir, aksi takdirde ertesi gün susuzluk veya açlık nedeniyle ölebilirler. Y labirentini kurun. Y şeklindeki konnektörü, uçları kesilmiş pipet uçlu köpük konnektörler kullanarak iki cam viyale bağlayarak başlayın; bu konnektörler kanalları oluşturur ve konik şekilleri bu geçitlerin tek yönlü olmasını sağlar.

Y'nin üçüncü kolu, bir pipet ucunun geniş kısmından yapılmış bir yükleme tüpüne bağlanmıştır ve yükleme flakonundan labirentin seçim noktasına geçişe olanak tanır. Her bir daralan tünelin ötesinde, bir tanesi koku yükü ile doldurulması gereken bir cam flakon bulunur. Bunlar, 28 milimetrelik kare doku kağıtlarına emdirilmiş 40 mikrolitrelik boluslardır.

Hangi tüpün koku maddesini içerdiğinin, testi ilk olarak yürütmek için rastgele değiştirilmesi gerekir. Sineklerin yavaşlaması için onları kısa bir süre buz üzerinde soğutun. Bu işlem LED ampullerden gelen uzak kırmızı ışık altında ve 25 °C'de gerçekleştirilmeli; sinek grubu nazikçe yükleme tüpüne bırakılmalı ve Y labirenti test sinekleri ile doldurulmalıdır.

Gaz anestezisi kullanmayın. Sineklerin yükleme tüpüne hem hızlı hem de nazik bir şekilde aktarılması gerçekten kritiktir. Sineklerin, Y kütlesindekilerin yayılımı gerçekleşmeden önce hızla uyanması gerektiği için bu, deneyin aslında en zor adımıdır.

Sineklerin labirenti 24 saat boyunca keşfetmelerine izin verilmelidir; böylece maksimum sayıda sinek cam tüplerden birine veya diğerine geçer. Farklı tüplerde bulunan sinek sayısı, koku indeksini hesaplamak için kullanılır. En fazla 10 sineğin davranışından elde edilen bu değere standart istatistiksel yöntemler uygulanmalıdır.

Eğer 10 sinek kohortu tutarlı sonuçlar vermiyorsa, deneyler 20 sinek kohortu ile gerçekleştirilebilir. Labirent bileşenlerini temizlemek için, parçalarına ayrılmış halde bir gece boyunca RBS 35 MD içinde bekletin. Ardından musluk suyu ile durulama yapın ve havada kurumaya bırakmadan önce son bir kez DI su ile durulayın.

Bir koku maddesine verilen standart tepkiler; Y labirenti kullanıldığında çekim, kayıtsızlık veya kaçınma şeklinde gerçekleşir. Örneğin, kanton sinekleri %10 asetik asitten güçlü bir şekilde kaçınırken, %10 fenol asetik asitten kaçınmazlar.

Bu prosedürü uygularken, bu koku deneyinin sinekler için yapay bir ortam oluşturduğunu unutmamak önemlidir. Kokuya karşı verilen tepkilerin ve farklı koşulların doğrulanması amacıyla, bu prosedürün ardından takım arkadaşları tarafından tamamlanan arena veya dahili deneyler gibi yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, SW deneyi kullanılarak filano gaste'nin kokuya verdiği tepkilerin nasıl basitçe test edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.