In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün Drosophila Anten

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tüm montaj anten boyamayı kullanarak koku alma reseptörü nöronlarını görselleştirmektir. İlk olarak, kafasını dikey olarak kesmek için sineği uyuşturun. Daha sonra, disseke edilmiş sinek kafasını bir elma tabağına yerleştirin.

Daha sonra antenin üçüncü segmentini kesin ve immünohisto kimyası yapmak için cam tabanlı kültür kabına yerleştirin. Anteni bir sürgülü cama monte ettikten sonra, konfokal Mikroskobik hi yoluyla çeşitli koku alma reseptör nöronlarını görselleştirebiliriz. Koku alma sistemi üzerinde çalışıyoruz.

Koku alma sistemi, diğer moleküllerin daldırma çeşitliliğini ayırt etmek için kullanılır. Bu sistem içinde bulunan çok çeşitli farklı koku alma nöronları, hedef reseptörlerden beyindeki nöronlara kesin ve koordineli bilgi aktarımına izin verir. Bugün, bu koku alma reseptör nöronlarının çeşitlenmesini tespit etmek için tüm anten boyamayı tanımlayacağız.

Başarılı bir tam montaj ve anten boyama sağlamak için, protokole başlamadan hemen önce yeni bir fiksatif partisi hazırlamak çok önemlidir. Sineği uyuşturun Ve sonra vücudunu forseps ile tutarak sinek kafasını dikey olarak kesin. Şimdi, disseke edilmiş anteni dikkatlice bir elma tabağına yerleştirin.

İnce diseksiyon makası kullanarak antenin üçüncü segmentini kesin. 90 Mikrolitre sabitleyici solüsyonu yemeğin ortasına yerleştirin. Keskin bir iğne kullanarak, disseke edilmiş anteni nazikçe doğrudan Fiksatif solüsyona aktarın.

Şimdi, sabitlemeyi sonlandırmak için sabitlemenin oda sıcaklığında 40 dakika boyunca rahatsız edilmeden ilerlemesine izin verin. Yıkama solüsyonunun çıkarılması sırasında anteni yıkama başına 10 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın. İlk olarak, tüm antenleri bir iğne kullanarak çanağın ortasına getirin.

Sonra çözeltiyi yemeğin yanından çıkarın. Kuluçka sırasında ajitasyon gereksizdir. Boyamaya hazırlanmak için, PBST'nin son yıkamasını çıkarın ve hazneyi %0.1 PBST'de 90 mikrolitre %5 at serumu ile doldurarak sabit anteni bloke edin, bloke edici solüsyonu %5 at serumu karışımı içinde seyreltilmiş primer antikorlarla değiştirin.

PBST'de kullanılan birincil antikorlar, anten örneklerinin kurumasını önlemek için 200'de bir konsantrasyona seyreltilmiş fare anti GFP 400'de bir ve sıçan anti eof'tur. Kültür kabının kapağına nemli bir doku yerleştirin ve paraform ile sarın. Daha sonra kültür kabını nemli dokular içeren plastik bir kaba koyun.

Antenleri birincil antikorlarda 48 saat boyunca 48 saat sonra dört santigrat derecede inkübe edin. Bağlanmamış primer antikorları, yıkama başına 10 dakika boyunca PBST'de altı yıkama ile temizleyin. Daha önce açıklanan fiksatif çıkarma prosedürüne benzer.

Bir saatlik PBST yıkamasından sonra,% 5 at serumu karışımı içinde seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisi ekleyin Bu örnekte PBST'de, antikorlar SI iki anti tavşan IgG ve SI üç anti sıçan IgG'dir. Floro dördünü önlemek için kabı bu noktadan itibaren alüminyum folyo ile örtün. Foto ağartma daha sonra anteni ikincil antikorda dört santigrat derecede 48 saat inkübe eder.

Bu noktada, anten artık anteni monte etmek için montaja hazırdır. PBST'nin mümkün olduğunca çoğunu kültür kabından çıkarın ve yavaş yavaş antenlere gliserol vermeye başlayın. Daha sonra, tabağa bir ila iki dakika boyunca% 40 gliserol ekleyin, ardından% 80 gliserol ekleyin ve% 80 gliserol ekleyin ve beş dakika bekletin.

Floresan boyama, Elof pozitif nöronları ve hedeflenen koku alma nöronlarını ortaya çıkardı. Bu prosedürü birleştirerek Nesil koku alma nöron genetik mozaikleri de dahil olmak üzere diğer benzer yöntemlerle, mekanik kontrol koku alma nöronunun çeşitlendirilmesini başlatmayı ve diğer önemli bilimsel soruları yanıtlamayı umuyoruz.