Ligatable Floresan Sondalar Deneysel İnme Hücre Ölümü Fagositik Gümrükleme Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, inme sırasında hücre cesetlerini temizleyen aktif fagositik hücreleri seçici olarak etiketlemektir. Bu, önce Tite tabanlı sinyal amplifikasyon reaksiyonu için bileşenlerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bölümleri hazırlamaktır.

Daha sonra, etiketleme reaksiyonu, vaccinia enzimi, topoizomeraz ve sorumlu floresan probları kullanılarak gerçekleştirilir. Son adım, IDE tabanlı floresan sinyal geliştirmedir. Sonuç olarak, fokal beyin iskemisinin doku bölümlerindeki ölü hücrelerin fagositik klerensini değerlendirmek için floresan mikroskobu kullanılır.

Ölü hücrelerin fagositler tarafından temizlenmesi, iskemi sonrası beyin iyileşmesinde önemli bir rol oynar. Sunulan yöntem, yalnızca ölü hücreleri aktif olarak uzaklaştıran pego boyutlarını etiketleyerek bu işlemin verimliliğini belirler. Bu yöntem iskemik beyin hakkında bilgi sağlasa da, diğer organ ve dokulardaki iskemik yaralanmaları incelemek için de kullanılabilir.

FA olduğunda, ölü hücrelerin asidik temizliği önemlidir. IDE sinyal amplifikasyonu veya TSA adımı, etiketlemenin son aşamasında gerçekleşse de, bu reaksiyona hazırlanmak bir saatten fazla sürebilir. Bu nedenle, Önce TSA reaktiflerini yapmak daha uygundur.

İlk adım, floro dört TYROM stok çözeltisini 300 mikrolitre DMSO'da TSA etiketleme kitinde bulunan tyrom reaktif dosyalarına yapmaktır. Daha sonra, bloke edici reaktifi tamamen çözmek için TNT yıkama tamponunu hazırlayın. TNB bloke edici tamponu yaparken, yavaşça küçük artışlarla ekleyin, karıştırırken çözeltiyi kademeli olarak 55 santigrat dereceye ısıtın.

Sürekli karıştırma ile çözelti sütlü görünecek ve alikot kullanılmadan önce oda sıcaklığına getirilmeli ve uzun süreli kullanım için eksi 20 santigrat derecede saklanmalıdır Bu prosedür için slaytlar önceden beş mikrometre kalınlığında bölümler monte edilerek hazırlanır. Formalin sabit dokudan kesin. İlk olarak, bölümleri 15 dakika boyunca ksilen ile muamele edin, bölümleri bir dizi etanol yıkaması ile yeniden sulandırın, ardından suda iki yıkama yapın.

Daha sonra, PBS'de bir stok çözeltisini mililitre başına 50 mikrograma seyrelterek proteinaz K çalışma çözeltisini yapın. Bu deneyin en zor kısmı, proteinaz K sindirim kontrolleri için ideal sürenin belirlenmesidir, dokunun boyutuna ve türüne bağlı olarak başarıyı sağlamak için hem daha kısa hem de daha uzun sindirim süreleri gerekebilir. Bölümlere uygun hacimde protein ACE K çalışma solüsyonu ekleyin ve 23 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, bölümleri damıtılmış suda her biri beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Bölümler ıslanırken, aktif probu içeren etiketleme karışımını hazırlayın. Aktif prob çözeltisini hazırlamak için, oligonükleotidleri su ile birleştirin, bir molar triss, HCL ve kitte verilen vaccinia topoizomeraz pipetleme ile nazikçe karıştırılarak karıştırın ve prob aktivasyonuna izin vermek için oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

İkinci yıkama süresinden sonra, bölümleri kavanozdan alın ve kalan suyu aspire edin. Hazır olduğunda, daha önce hazırlanan aktif prob solüsyonunu uygulayın. Bölümleri kaydırın ve 23 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, kapak fişlerini nazikçe çıkarmak için slaytları suya batırın. Slaytları her biri beş dakika boyunca üç kez suda yıkayın. Son yıkamadan sonra, doku bölümlerini TNB bloke edici tampon ile örtün ve slaytları nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Bu süre zarfında, soyulmuş ve at turpu peroksidaz konjugatlarının bir ila 100 seyreltmesini hazırlayın. TNB blokaj tamponundaki S-A-H-R-P, slaytları alın ve TNB blokaj tamponunu aspire edin. S-A-H-R-P solüsyonunu uygulamadan önce, tüm doku bölümünü kaplayacak kadar reaktif kullanın.

Örtüldükten sonra, slaytları oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin İnkübasyondan sonra, slaytları her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında TNT yıkama tamponunda, kullanımdan hemen önce bir x amplifikasyon seyrelticisinde bir ila 50 oranında seyreltilmiş floro dört TY IDE stoğu hazırlayın. Solüsyonu, doku bölümünü tamamen kaplayacak şekilde slaytların üzerine pipetleyin.

Çözelti yeniden kullanılamadığından, kalan kullanılmayan kısmı atın. Slaytları oda sıcaklığında üç ila 10 dakika inkübe edin. Floresanı izleyin.

Şu anda yapıların ilk ipuçları görünene kadar mikroskop altında artırın. Hızlı bir şekilde yıkama adımına geçin. Slaytları her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

TNT'de oda sıcaklığında çalkalama ile tamponu yıkayın. Yıkadıktan sonra, DPI ile solma önleyici solüsyonu ekleyin ve kapağı kapatın. Sonuçları floresan mikroskobu altında gözlemleyin.

Bu görüntüler, PHA asidik klerensinin iki örneğini göstermektedir. Nükleer leke lekesi mavi floresan ile gösterilir ve sorumlu vakum topo probu yeşil floresan ile gösterilir, bu görüntülerde sunulan olayların diyagramları, fagositlerin çekirdeklerini ve sindirimin çeşitli aşamalarında tik yutulmuş ekstra çekirdekleri gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık üç saat içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, doku kesitlerinde sorumlu floresan probların nasıl kullanılacağını öğreneceksiniz. Ayrıca, iskemik beyindeki ölü hücreleri temizleyerek aktif ideleri seçici olarak etiketleyebileceksiniz.