Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, translasyon aşamasındaki mRNA'lar ile ilişkili mitokondrileri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle mitokondri zenginleştirme koşulları altında büyütülen maya hücrelerinin hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise hücrelerin sikloheksimid varlığında nazikçe parçalanmasıdır.

Ardından mitokondriler, diferansiyel santrifüjasyon ile çözünür bileşenlerden ayrıştırılır. Son adım, mitokondrilerden ve kontrol örneklerinden RNA ekstraksiyonudur. Nihayetinde, mitokondri ile ilişkili RNA'nın saflığını ve kalitesini göstermek için northern analizi kullanılır.

Bu tekniğin temel avantajı, birçok RNA türünün tek bir hazırlıkta izole edilebilmesidir. Bu sayede karşılaştırmalı bir analiz yapılabilir. Bu yöntem, hücre içi hedefleme ve organel fonksiyonu gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu prosedürde, fermente edilemeyen bir büyüme ortamında 30 °C'de OD 600 değeri 1 ile 1,5 arasına ulaşana kadar büyütülmüş 100 ila 150 mL maya hücresinden mitokondri saflaştırılacaktır. Hücreleri oda sıcaklığında 3000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı atın ve peleti çift distile su ile yıkayıp tekrar santrifüj edin.

Süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra hücre peletini tartın. Tipik olarak 100 mililitre hücreden yaklaşık 0,6 gram elde edilir. Peleti, her 0,5 gram hücre için bir mililitre DTT tamponu ile yeniden süspande edin.

Hücre duvarı içindeki disülfür bağlarını koparmak ve böylece hidrolizi iyileştirmek için hücrelerin bir indirgeyici ajanla işlem görmesi önemlidir; hücreleri 30 °C'de, hafifçe çalkalayarak 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından hücreleri oda sıcaklığında, 3000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve peleti yeniden süspanse edin.

Hücrelerin her 0,15 gramı için bir mililitre xmal liase tamponu içerisinde vortekslemeyiniz. Hücrelerin 10 mikrolitrelik bir alikotunun 990 mikrolitre su içindeki OD 600 değerini ölçün ve bu değeri kaydedin. Beta bir üç glukan bağlarındaki glikoz polimerlerini hidrolize etmek ve Sferoplast oluşturmak için hücrelere taze hazırlanmış xmal liase ekleyin.

Bundan sonra, lizisi önlemek amacıyla Sferoplastlar izotonik bir çözelti içinde tutulmalı ve hücreler 30 °C'de hafifçe çalkalanarak 15 dakika inkübe edilmelidir. Hücre duvarı hidrolizini ve sferoplast oluşumunu doğrulamak için, 10 µL hücreyi 990 µL su ile karıştırın ve OD 600 değerini ölçün. Sferoplastların ozmotik fark nedeniyle lizise uğraması beklenir ve OD 600 değeri, xmal liase eklenmeden önce belirlenen değerden en az on kat daha düşük olmalıdır. Eğer değilse, xmal liase ile inkübasyona 15 dakika daha devam edin.

Plast PHE'sini 100 mililitre geri kazanım ortamı ile yeniden süspande edin ve plast küresini bir Helen Meyer Flask'ına aktarın. 30 °C'de, çalkalamalı olarak bir saat boyunca inkübe edin. XYs işlemi sırasında translasyon durduğu ve mRNA lokalizasyonu bozulduğu için bu geri kazanım adımı gereklidir.

Bir saat sonra 0,1 mg/mL cycloheximide ekleyin ve sferoplastları önceden soğutulmuş 50 mL'lik konik tüplere aktarın. Cycloheximide eklenmesi, ribozomların mRNA'lara bağlanmasını dondurmak için önemlidir. Böylece, ribozom bağımlı mRNA'ların mitokondri ile etkileşimi korunur.

Plazma küresini 4 °C'de beş dakika boyunca 3000 ×g hızında santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve soğuk mannitol ile iki kez yıkayın. Tampon reus.

Plass küresini dört mililitre soğuk mannitol tamponu ile süspande edin ve süspansiyonu, sıkı oturan bir havan eli ile donatılmış 15 mililitre kapasiteli bir homogenizatöre aktarın. Plass küresini 15 darbe ile nazikçe parçalayın ve lizatı 13 mililitrelik bir tüpe aktarın. Lizatı dört santigrat derecede altı dakika boyunca 1.500 ×g'de santrifüjleyin.

Çekirdekleri ve parçalanmamış hücreleri çöktürmek için. Süpernatantı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Örneği fraksiyona ayrılmamış veya toplam örnek olarak ayırmak için bir mililitre veya %25'ini kenara ayırın.

Bu numunenin 50 µL'sini yeni bir tüpe aktarın ve 15 µL four XLSB ekleyin. Western blot analizi için, toplam numunenin geri kalanından northern ve mikroarray analizleri için RNA çöktürülecektir. Süpernatantı 10,000 ×g'de santrifüjleyin.

Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca yerçekimine bırakın. Mitokondrileri çöktürmek için süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve buz üzerinde tutun. Bu, sitozolik fraksiyondur.

Bu örneğin 50 µL'sini yeni bir tüpe aktarın ve 15 µL four XLSB ekleyin. Western blot analizi için, sitozolik örneğin geri kalanından northern ve mikroarray analizleri amacıyla RNA çöktürülecektir. Peleti üç mL mannitol tamponu ile yıkayın ve tekrar 10.000 ×g'de santrifüjleyin.

Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Çökeltiyi üç mililitre mannitol tamponu ile yeniden süspande edin. Bu örnek mitokondrileri içerir ve mitokondri fraksiyonu olarak adlandırılır.

Bu numunenin 50 µL'sini yeni bir tüpe aktarın ve Western blot analizi için 15 µL dört XLSB ekleyin. Bu prosedüre başlamak için, her numuneye bir hacim sekiz molar guanidin, HCEL ve iki hacim %100 etanol ekleyip vorteksleyin ve -20 °C'de en az iki saat inkübe edin. Numuneleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 10,000 ×g'de santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın. Pelet stabil olmayabileceği için dikkatli olun. Peleti %70 etanol ile yıkadıktan sonra, peleti 400 µL RNase-free su ile süspanse edin ve örneği yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

0.1 hacim üç molar sodyum asetat pH 5.2 ve iki hacim %100 etanol ekleyerek RNA'yı tekrar çöktürün, vorteksleyin ve en az iki saat boyunca -20 °C'de inkübe edin. Örnekleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 20.000 ×g hızında santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve %70 etanol ile yıkayın. Pelleti havada kurutun ve RNA'sız su ile yeniden süspande ederek RNA örneklerini -80 °C'de saklayın.

Numuneler daha sonra northern veya mikroarray analizleri için kullanılabilir. RNA'yı mikroarray analizine hazırlamak için, önce guanidinyum HCl ve etanol çöktürmesi ile elde edilen her bir mRNA peletini 650 µL RNA'sız su ile yeniden süspandeyin ve vidalı kapaklı endotoksinsiz tüpe aktarın. Ardından 650 µL asidik fenol kloroform ekleyip kuvvetlice vorteksleyin ve maksimum hızda iki dakika boyunca santrifüjleyin.

Üst sulu fazdan 500 µL'yi yeni bir tüpe aktarın. DNA içerdiği için ara fazı almaktan kaçının. Ayrıca, ters transkripsiyon reaksiyonunu inhibe edebilecek olan fenolü almamaya dikkat edin.

Lityum klorür çöktürme yöntemiyle RNA örneğindeki heparin temizlenir. Lityum klorür, final konsantrasyonu 2 M olacak şekilde eklenir ve örnekler -20 °C'de gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün örnekler 4 °C'de çözdürülür ve 20,000 ×g'de santrifüj edilir.

Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca yerçekimi ile çöktürün. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve peleti %80 etanol ile yıkayıp santrifüjleyin. Süpernatantı tekrar uzaklaştırın, havada kurutun ve kalan lityum klorür çökeleklerini gidermek için peleti 150 mikrolitre RNA'sız suda yeniden süspande edin; ardından 0,1 hacim üç molar sodyum asetat pH 5,3 ve üç hacim %100 etanol ile eksi 20 santigrat derecede en az iki saat boyunca inkübe edin.

Dört santigrat derecede, maksimum hızda 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Şeffaf peleti %80 etanol ile dikkatlice yıkayın ve havada kurutun. Son olarak, peleti 25 µL RNaz içermeyen su ile yeniden süspanse edin ve örnekleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Bu protokolün, mitokondri içeren bir fraksiyonule sitozolik bileşenlerden ayırmadaki başarısı, farklı izolasyon aşamalarından alınan örnekler üzerinde northern analizi ve Western analizi yapılarak en iyi şekilde test edilir. Bu örnekte örnekler; fraksiyonlamadan önceki örnek veya toplam fraksiyon, sitozolik fraksiyon ve mitokondriyal fraksiyondan alınmıştır. Northern analizi, COB mRNA'sı için gerçekleştirilmiştir.

Bunlar mitokondri içinde transkribe edilir; CO1, mitokondriye aktarılan bir proteini kodlayan bir mRNA'dır. ACT1, sitozolik aktin proteinini kodlayan bir mRNA ve SEC61, ER yerleşik bir proteini kodlayan bir mRNA'dır. Alt panel, 25 s ve 18 s şeklinde iki belirgin RNA bandının tespit edildiği northern membranının metilen mavisi boyamasıdır.

COB mitokondri içinde transkribe edildiğinden, sinyali yalnızca mitokondride olmalıdır; nitekim bu çalışmada da gözlemlendiği gibi. COB'ninle sitozolik fraksiyonda görülmesi, hazırlık sırasında mitokondri lizisi gerçekleştiğini gösterecektir.

ACO one, mitokondriye aktarılan ve çoğunlukla mitokondriyal fraksiyonda görülen bir proteini kodlar. A CT one ise sitozolik bir proteini kodlar ve bu nedenle çoğunlukla sitozolik fraksiyonda görülür. Mitokondriyal fraksiyonda SEC 61'in bulunması, bu fraksiyonda ER bileşenlerinin mevcut olduğunu göstermektedir.

RNA sinyalleri her iki fraksiyonda da görülmektedir, bu da ribozomların varlığına işaret eder. POR1 (bir mitokondri dış membran proteini), K1A (bir sitozolik protein), CUE1 (bir ER proteini) ve RPL39 (bir ribozomal protein) için Western analizi gerçekleştirilmiştir. Beklendiği üzere POR1 sinyali yalnızca mitokondriyal fraksiyonda tespit edilmiştir.

Sitozolik fraksiyonda POR 1 sinyali saptanması, hazırlama sırasında mitokondriyal bileşenlerin ayrıştığını gösterirdi. Ayrıca, beklendiği üzere hx K 1 yalnızca sitozolik fraksiyonda saptandı. Mitokondriyal fraksiyondaki güçlü CUE 1 sinyali, mitokondriyal fraksiyonla birlikte önemli miktarda ER ile ilişkili materyalin de izole edildiğini göstermektedir.

Bu durum, ER ile mitokondriler arasındaki bilinen fiziksel temasların bir sonucu olabilir. RPL 39 sinyali her iki fraksiyonda da görülmekte ve bu durum, her iki fraksiyonda da ribozomların varlığını yeniden doğrulamaktadır; prosedürden geri kazanım adımının çıkarılması, M fraksiyonundaki ribozomların kaybolmasına neden olur ve bu da mRNA'nın mitokondrilerle ilişkilenmesini etkiler. Mitokondriyal ve sitozolik bileşenler arasındaki ayrımın kalitesini doğrulamanın yanı sıra, örneklerdeki RNA veya proteinlerin sağlam olduğunu ve örnek hazırlama sırasında ciddi RNA veya protein kayıpları yaşanmadığını teyit etmek önemlidir.

Burada gösterildiği gibi, analizlerde sağlam RNA ve proteinlerin belirgin bantlar şeklinde tespit edilmesi gerekir. Mitokondriye aktarılan bir proteini kodlayan c CCP mRNA'sı için, ek olarak daha kısa bantların veya yayılmaların (smear) görülmesi degradasyonu gösterecektir. Ciddi kayıplar, toplam sinyal miktarı ile bağıl sinyal miktarı arasında anlamlı bir farka yol açacaktır; ancak her iki durum birlikte değerlendirildiğinde böyle bir fark gözlemlenmemiştir.

Bu sonuçlar, bu protokolün mRNA'ların, ribozomların ve proteinlerin tek bir işlemle izolasyonu için etkili bir yöntem olduğunu doğrulamaktadır. Bu prosedürün ardından, organel fonksiyonlarının temel ve benzersiz özelliklerini belirlemek amacıyla RNA-Seq veya proteomik analiz gibi genom çapındaki yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, mitokondri ile ilişkili RNA'nın nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.