Name: Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-14T17:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Öğrenin maya hücrelerinde mitokondriyle ilişkili mRNA izolasyonu için diferansiyel santrifüjasyon yöntemini. Bu teknik, yerelleşmiş çeviri mekanizmalarını ve hücre içi hedeflemeyi araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Dr teşekkür ederim. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines ve bu protokolün kurulması sırasında yardım ve yorumlar için Doron Rapaport. Bu çalışma ISF (hibe sayısı 1193-1109) tarafından finanse edilmektedir.

1.. Mitokondri Arıtma Hücre pelet tartılır. Yaklaşık 0.6 g 100 mi hücrelerden elde edilir. <ol><li> 30 ° C&#39;de 600 = 1-1,5 OD maya hücrelerinin 100-150 ml büyümek Mitokondri için zenginleştirmek için, bu tür galaktoz bazlı bir büyüme ortamı olarak bir nonfermentable büyüme ortamı, üzerinde C °. </li><li> Santrifüj hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3000 x g ve supernatant atın. </li><li> Yine iki kere damıtılmış su ve santrifüj ile pelet yıkayın. Süpernatant atın. </li><li> Hücrelerin 0.5 gramı başına 1 ml DTT tampon içinde pelletini. Böylece, hidroliz geliştirilmesi, hücre duvarı içinde disülfid bağları kırmak amacıyla bir indirgeme maddesi ile hücreleri tedavi etmek için önemlidir. </li><li> 30 ° C&#39;de 10 dakika boyunca inkübe hücreleri Nazik sallayarak C °. Öte yandan, hücreler 1 gramı başına 6 mg ağırlığında ve askiyle sonuçlanır ki askiyle sonuçlanır ki Tamponu içinde askıya. </li><li> 5 dk a boyunca 3.000 xg&#39;de Santrifüj hücrelerit oda sıcaklığı ve süpernatant atın. </li><li> Hücrelerin 0.15 g başına 1 mi askiyle sonuçlanır ki Tampon pelet tekrar. Vorteks. </li><li> 990 ul su içindeki hücrelerin 10 ul alikotunun OD 600 ölçün. </li><li> Β-1 ,3-glukan bağları glikoz polimerler, hidrolize ve sferoplastlar oluşturmak için, hücrelere askiyle sonuçlanır ki (adım 1.5) ilave edin. Bu aşama, sferoplastlar lizis önlemek amacıyla bir izotonik çözelti içinde tutulmalıdır. </li><li> Hafif sallama ile 30 ° C (askiyle sonuçlanır ki optimal aktivitesi için) 15 dakika boyunca inkübe hücreleri. Hücre duvarı ve sferoplastlar nesil hidroliz doğrulamak için, 990 ul su ile hücrelerin 10 ul karıştırın. Spheroplastlar nedeniyle osmotik farkı lize beklenmektedir ve OD 600 aşamasında, en azından 1.9 belirlenen değerden daha düşük 10 misli olmalıdır. Aksi takdirde, başka bir 15 dakika boyunca inkübasyon askiyle sonuçlanır ki bu devam eder. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Dikkatle diskart süpernatan, pelet olarak kararsız olabilir. </li><li> Askiyle sonuçlanır ki Tampon ile spheroplastlar yıkayın ve süpernatant atın. </li><li> 100 ml Kurtarma ortamı ile spheroplastlar süspanse edin. Bir Erlenmeyer şişeye spheroplastlar aktarın ve 30 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe Çalkalanarak C °. Askiyle sonuçlanır ki tedavi çeviri sırasında tutuklandı ve mRNA lokalizasyon (Şekil 1B) bozulur çünkü bu kurtarma adım gereklidir. </li><li> Bir soğutulmuş 50 ml konik tüp, 0.1 mg / ml cHx ve transfer spheroplastlar ekleyin. CHX ilave mRNA&#39;larla ribozomlarla &#39;dernek dondurmak için önemlidir. Böylece, mitokondri ile ribozomlar-bağımlı mRNA ilişki korunur. </li><li> Santrifüj sferoplastlar &#39;ı içerir, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 3000 x g ve supernatant atın. </li><li> Soğuk Mannitol Tampon ile iki kez yıkayın. </li><li> 4 ml soğuk tampon ile Mannitol spheroplastlar yeniden süspanse edin ve sıkı geçme ile donatılmış 15 ml kapasiteli bir Dounce homojenizatör aktarınpestle. Yavaşça 15 darbelerle spheroplastlar kırmak ve bir 13 ml tüp lizat aktarın. </li><li> Çekirdek ve kesintisiz hücrelerini pellet haline getirmek üzere, 4 ° C&#39;de 6 dakika boyunca 1500 x g&#39;de lizat santrifüj. </li><li> Dikkatle yeni bir tüp süpernatant aktarın. Bölünmemiş bir örnek (&quot;Toplam&quot; örneği) olarak bir yana numunenin 1 ml (% 25) olarak ayarlayın. Yeni bir tüpe aktarın Bu örneğin 50 ml ve western blot analizi için 4X LSB 15 ml ekleyin. &quot;Toplam&quot; numunenin geri kalanından Çökelti RNA (Protokol 3, RNA çökeltme bakınız). </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüje süpernatan Mitokondri pelet için C °. </li><li> Yeni bir tüp süpernatant (~ 3 ml) aktarın ve buz üzerinde tutmak. Bu &quot;Sitosolik&quot; bölümüdür. Yeni bir tüpe aktarın Bu örneğin 50 ml ve western blot analizi için LSB 4x 15 ml ekleyin. &quot;Sitosolik&quot; numunenin geri kalanından Çökelti RNA (Protocol 3, RNA yağış). </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de tekrar 3 ml Tampon Mannitol ve santrifüj ile pelet yıkayın </li><li> 3 ml mannitol Tampon ile pelletini. Bu örnek, mitokondri içerir ve &quot;Mitokondri&quot; fraksiyonu olarak adlandırılır. Yeni bir tüpe aktarın Bu örneğin 50 ml ve western blot analizi için LSB 4x 15 ml ekleyin. </li></ol> 2. RNA Ekstraksiyon <ol><li> Her bir örnek 8 M guanidinyum-HCl, bir hacim ve% 100 etanolden iki hacmin ekle. Vorteks ve -20 ° C&#39;de en az 2 saat boyunca inkübe ° C. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri ° C. Süpernatant atın. Pelet kararsız olabilir dikkatli olun. </li><li> % 70 EtOH ile pelet yıkayın. </li><li> RNase-içermeyen su içinde 400 ml pelet yeniden süspanse edin ve yeni bir Eppendorf tüpüne örnek aktarın. </li><li> 3 M sodyum Etilasetat 0.1 hacim ilave edilerek RNA Çökeltie pH 5.2 ve% 100 EtOH iki hacimleri. Vorteks ve -20 ° C&#39;de en az 2 saat boyunca inkübe ° C. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri Süpernatantı atın ve% 70 EtOH ile yıkayın. </li><li> Hava pelet kuru ve RNase-barındırmayan su ile yeniden süspanse edin. -80 ° C&#39;de saklayın RNA numuneleri ° C. Örnekler Northern analizinde 19 ya da mikro-dizi analizi 18 (Protokol 3 bak) için kullanılabilir. </li></ol> 3. Mikrodizi Analizi RNA hazırlanması <ol><li> RNase-içermeyen su içinde 650 ml aşama 2.2 &#39;den mRNA yeniden süspanse edin. </li><li> Kuvvetli bir şekilde kloroform (5:1, pH 4.7) ve vorteks: herhangi bir kalıntı DNA ya da proteinleri çıkarmak için, eşit asidik fenol hacmi (650 mi) ilave edin. 2 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj. </li><li> Yeni bir tüpe, üst faz (sulu faz) 500 ml aktarın. DNA&#39;yı içerdiği gibi, interfazda almaktan kaçının. Ayrıca, ters transkripsiyon reaksiyonu inhibe fenol, alma dikkat edin. &lt;/ Li&gt; <li> RNA örnek ters transkriptazın bir inhibitörü olan heparin önemli bir miktarda içerir. Böylece, RT-PCR veya mikroarray etiketleme için kaldırılması gerekmektedir. LiCI çökeltme yoluyla heparin çıkarmak: 2 M bir son konsantrasyona kadar LiCI ekleyin ve -20 ° C&#39;de gece boyunca inkübe örnekleri ° C. </li><li> 4 ° C&#39;de örnekleri Çözülme ° C ve 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 xg&#39;de santrifüj </li><li> Dikkatlice süpernatant atın ve% 80 etanol ile pelet yıkayın. Aşama 3.5 de tarif edildiği gibi tekrar santrifüj. </li><li> Süpernatantı, kuru hava atın ve RNase-içermeyen su içinde 150 ml pelet tekrar süspansiyon. </li><li> Herhangi bir artık LiCI kaldırmak için, 3 M sodyum asetat pH 5.3 ve 0.1 hacim% 100 etanol içinde 3 hacim ile tekrar çökeltilmesi. -20 ° C de inkübe En az 2 saat boyunca ° C. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüje ° C. % 80 etanol ve kuru hava ile dikkatlice şeffaf pelet yıkayın. </li><li> Süspanse25 ml RNase içermeyen su ile pelet ve -80 ° C&#39;de örnekleri tutmak ° C. </li><li> 18,20 açıklanan RNA etiketleme ve melezleme için adımları izleyin. </li></ol>

<ol><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+localization+in+animal+cells+and+why+it+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+communication+through+RNA+transport+and+localized+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis.</a> Traffic. 11, 1498-1505 (2010).</li>
<li>Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+II.+Evidence+for+the+association+of+cytoplasmic+ribosomes+with+the+outer+mitochondrial+membrane+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ.</a> J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).</li>
<li>Kellems, R. E., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+3.+Changes+in+the+amount+of+bound+ribosomes+in+response+to+changes+in+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state.</a> J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).</li>
<li>Suissa, M., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Translatable+mRNAs+for+imported+mitochondrial+proteins+are+present+in+free+as+well+as+mitochondria-bound+cytoplasmic+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes.</a> J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).</li>
<li>Fujiki, M., Verner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cytosolic+protein+synthesis+and+mitochondrial+protein+import+in+yeast.+Evidence+for+cotranslational+import+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo.</a> J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).</li>
<li>Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation-coupled+translocation+of+yeast+fumarase+into+mitochondria+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo.</a> J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).</li>
<li>Eliyahu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tom20+mediates+localization+of+mRNAs+to+mitochondria+in+a+translation-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner.</a> Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).</li>
<li>Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+yeast+mRNAs+and+the+biogenesis+of+molecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes.</a> Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).</li>
<li>Marc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNAs+targeted+to+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria.</a> EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).</li>
<li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li>
<li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Saccharomyces+cerevisiae%2C+ATP2+mRNA+sorting+to+the+vicinity+of+mitochondria+is+essential+for+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+EMBO%22%5BJournal%5D)">In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function.</a> J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).</li>
<li>Saint-Georges, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+biogenesis%3A+a+role+for+the+PUF+RNA-binding+protein+Puf3p+in+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
<li>Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PUF+proteins%3A+repression%2C+activation+and+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PUF proteins: repression, activation and mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).</li>
<li>Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+presequence+and+open+reading+frame+mediate+asymmetric+localization+of+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA.</a> EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).</li>
<li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li>
<li>Ahmed, A. U., Fisher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+nuclear-encoded+mitochondrial+proteins%3A+a+cotranslational+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective.</a> Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).</li>
<li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).</li>
<li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3%27-UTRs+and+their+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+RES%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).</li>
<li>Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+polysomal+profiles+with+spotted+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays.</a> Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).</li>
<li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+many+mRNAs+translated+to+the+vicinity+of+mitochondria%3A+a+role+in+protein+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly.</a> Gene. 354, 64-71 (2005).</li>
<li>Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+screen+in+yeast+identifies+a+novel+assembly+factor+for+the+mitochondrial+complex+III%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III.</a> Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).</li>
<li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).</li>
<li>Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mRNA+tracking+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single mRNA tracking in live cells.</a> Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).</li>
<li>Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+single+mRNA+particles+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+double-helix+point+spread+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).</li>
<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).</li>
<li>Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial transcriptomics.</a> Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).</li>
<li>Reinders, J., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of yeast mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).</li>
<li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).</li>
<li>Glick, B. S., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+purified+mitochondria+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).</li>
<li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).</li>
<li>Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRieder%2C+SE+%22Isolation+of+subcellular+fractions+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.+Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%22">Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board</a>. Bonifacino, J. S. 8, (2001).</li>
<li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Görüntülemede Teknolojik gelişmeler mRNA yerelleştirme incelemek için yüksek çözünürlüklü araçları vermiştir. Bugün, bir msn zaman ölçeği 23-26 hatta tek bir mRNA molekülünün hareketini ölçebilirsiniz. Bununla birlikte, geleneksel biyokimyasal yaklaşımlar, yukarıda tarif edilen gibi, aynı zamanda bilgi ve bazı durumlarda tercih edilir. Biyokimyasal izolasyon mRNA ve proteinlerin büyük bir repertuar saflaştırılmasını sağlar ve genom çalışmaları için bu nedenle tercih edilir. Tek bir izolasyon, bir DNA ya da RN...

Ökaryotik hücreler, belirli işlevleri olan farklı bölümlerinde düzenlenmektedir. Bu fonksiyonu yerine getirmek için, her bir bölme bu etkinlik için temel olan protein benzersiz bir dizi içerir. Bu proteinler bölmesini hangi yaklaşımı sayesinde mümkün olan bir mekanizma lokalize çeviri 1,2 gereğidir. Bu işlemde, protein ribozomlar ve orada bulunan mRNA tarafından hedefe sentezlenir. Lokalize çeviri muhtemel avantajları protein hedeflemesi verimliliği artmış arasında protein chaperones ihtiyacının azalması ve site-spesifik düzenleme mekanizmalarını sağlayarak. Ayrıca, lokalize mRNAlarının ve ribozomlar genel çeviri inhibe hücresel stres, durumlarında çeviri makine tenha bir rezervuar olabilir. Mitokondri son yıllarda lokalize çeviri incelemek için merkezi bir model oldu. En mitokondri proteinleri, sitosol tercüme çekirdeğinde, kodlanmıştırve organel içine ithal. Kanıtlar çeşitli çizgiler, bu proteinler çoğu yerel için bir süreç yoluyla üretilmiş olduğunu göstermektedir. Başlangıçta, elektron mikroskobu ve biyokimyasal bölme çalışmaları mitokondri 3-5 ile ilişkili ribozomlan algılandı. Sonra sadece bir cotranslational şekilde 6,7 ithal edilecek bulundu belirli mRNA&#39;lardan çalışmalardan in vivo doğrulanmıştır Bu çalışmalar. Mitokondri ile ilişkili mRNA genom çalışmalar mRNA önemli bir kısmı mitokondri civarı 8-10 lokalize olduğunu ortaya çıkardı. Bu mRNA bazıları ayrıca, balık veya MTAG 9,11 olarak in vivo floresan yöntemler ile karakterize edilmiştir. Bu derneğin bir düz ileri yorumlama bu mRNAlarının lokalize çeviri için şablon olarak hizmet olmasıdır. Bu mRNAları mitokondri yaklaşım hangi mekanizmalar bilinmemektedir. Noncoding etki (en significantly 3 &#39;UTRs) mitokondri 12 mRNA birlikte dahil olmak gösterilmiştir. Bu etki kendi taşıma aracılık eden RNA bağlayıcı proteinlere bir bağlama alanı olarak hizmet etmek olasıdır. Mayada çalışmalar proteinlerin PUM ailesinin (Puf3) üyesi mitokondri 8,13 ile mRNA ilişki desteklediğini göstermiştir. Diğer aile üyelerinin fonksiyonları dayanmaktadır Puf3 için mantıklı bir rolü, mRNA rota 14 tr ise çeviri inhibe etmektir. Bu durumda, mRNA kodlayıcı olmayan bölgeler ile etkileşime RNA bağlayıcı protein tarafından, bir çevrilmemiş durumu nakledilebilir. Seçenek olarak ise, işin büyük bir gövde, protein sentez edilirken taşıma cereyan ettiğini ortaya çıkarmaktadır. Özellikle de, çeviri inhibitörleri mRNA&#39;lar ilişki 8,13 etkilediği gösterilmiştir. Ayrıca, bu tür Ağustos olarak tercüme özellikleri, mitokondriyal hedefleme sekansı (MTS) ya da ORF bölgeler lokalizasyon 8,11,15 yardımcı gösterilmiştir. Hsp70-family protein chmitokondri dış zar üzerinde aperone ve protein reseptör daha da kodlanmış protein özellikleri mRNA lokalizasyonu 16 için önemli olduğunu ima, mRNA ilişki destek gösterilmiştir. Bu, ribozom ortaya çıkan protein mitokondri 17 mRNA ribozom-protein kompleksi hedefleme için tanıma elemanı olarak hizmet ettiği bir modelle tutarlıdır. Mitokondri yakın olarak lokalize için elektron mikroskopisi (ribozomlar görselleştirmek için) 3, FISH 9, (spesifik mRNA tespit etmek için), yeşil RNA 11 ve biyokimyasal fraksiyonasyon (RNA ve hem ribozomlar tespit etmek için) 10,18 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler ile araştırılmıştır. Eski yöntemler, canlı ortam içinde lokalizasyonu tespit etmek ve taşıma dinamikleri görselleştirme izin verirken, ikinci tek bir deneyde bir çok farklı mRNA tespiti sağlar. Ayrıca, biyokimyasal ayırma kodlayıcı veya kodlayıcı olmayan bir etki için al olması gerekmezolarak girilir, bu nedenle belirli bir rolleri değerlendirilebilir. Biyokimyasal ayırma başarılı bir şekilde bir çok farklı hücre bölmelerinin izole edilmesi için, uzun yıllardır kullanılmaktadır. Onun ilke ve sınırlamaları iyi kurulmuş, ve kolayca farklı bir amaç için mevcut protokolleri değiştirebilirsiniz. Gerekli enstrümantasyon, bu nedenle genellikle hücre içi lokalizasyonu eğitim için tercih edilen ilk yöntemdir, birçok laboratuvar standarttır. Biz, ribozomlar mitokondri ile ilişkili ise mRNA izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol açıklar. Bu protokol, bu nedenle mitokondri yakın lokalize çeviri katılan faktörleri incelemek için en uygunudur.

<table><tbody><tr><td>Maya Özü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Galaktoz</td><td></td><td></td><td>Otoklav yapmayın Galaktoz</td></tr><tr><td>Büyüme ortamı</td><td></td><td></td><td>Mitokondriyal zenginleştirme için, sterilize edilmiş Galaktoz bazlı büyüme ortamı gibi fermente edilemeyen herhangi bir karbon kaynağı kullanmalısınız %1 Maya Özü, %2 BactoPeptone, %2 Galaktoz</td></tr><tr><td>0.1 M Tris-HCl, pH 9.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mM Tris-HCl, pH 7.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ditiyotreitol (DTT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM DTT tamponu</td><td></td><td></td><td>0.1 m TrisHCl pH 9.4, 10 mM ditiotreitol (DTT). Her seferinde taze yapın</td></tr><tr><td>1.2 M Sorbitol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 mM KH2PO 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 mM K 2 HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 & # 956; m filtre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase Tamponu</td><td></td><td></td><td>1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4, 16 mM K 2 HPO4. Bu arabelleği filtreleyin (0.2 &#956; m) ve ileride kullanmak üzere oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td></td><td></td><td>20.000 U/g</td></tr><tr><td>Geri kazanım ortamı</td><td></td><td></td> 1 M Sorbitol 0.1 mg / ml Sikloheksimid (CHX) <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.6 M Mannitol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM MgAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM KCl</td><td></td><td></td> <td>ile desteklenmiş galaktoz bazlı büyüme ortamı</td></tr><tr><td>0.5 mg / ml Heparin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM Fenilmetansülfonilflorür (PMSF)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mannitol Tamponu</td><td></td><td></td><td>0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Taze ekleyin: 0.5 mg / ml Heparin, 0.1 mg / ml CHX ve 1mM (PMSF). Bu tamponu süzün ve buz gibi</td></tr><tr><td>kullanın 8 M Guanidinyum-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%100 ve %70 Etanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodyum Asetat, pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 M LiCl stok çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mM Tris HCl pH 6.8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Merkaptoetanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x LSB</td><td></td><td></td><td>250 mM Tris HCl pH 6.8, %8 SDS, %40 Gliserol, %20 &#946;-merkaptoetanol ve %0.02 Bromofenol mavisi</td></tr><tr><td>Sıkı oturan havaneli</td><td></td><td></td><td></td> ile donatılmış 15 ml kapasiteli Dounce homojenizatör</tr></tbody></table>

lokalize Çeviri mekanizmaları eğitim için maya mitokondri ile mrnalarının associated İzolasyonu

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Mitokondriyal proteinlerin çoğu çekirdeğine kodlanmış ve organel içine ithal edilecek ihtiyacı vardır. Protein, mitokondri yakın sentezlenir Alma oluşabilir. Bu olasılığı için destek mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA&#39;lar mitokondri civarı lokalize edilmesi gösterilmiştir edildiği son çalışmalar, türetilmiştir. Birlikte dış zar ile ribozomların &#39;derneği önceki gösterileri ile, bu sonuçlar yerelleştirilmiş bir çeviri sürecini öneririz. Bu tür lokalize çeviri, ithalat verimliliğini artırmak benzersiz düzenleme siteleri sağlamak ve ektopik ifade vakalarını minimize edebilir. Çeşitli yöntemler lokalize çeviri aracılık faktörler ve unsurları karakterize etmek için kullanılmıştır. Bunlar arasında standart diferansiyel santrifüjle hücre içi fraksiyonlarının. Bu protokol, tek bir prosedür olarak mRNA, ribozomlar ve proteinlerinin izolasyonu gibi bir avantajı vardır. Bunlar daha sonra çeşitli moleküler ve bi karakterize edilebilirochemical yöntemleri. Ayrıca, transkriptomik ve proteomik yöntemleri böylece genom çapında derin bir bakış açısı sağlar, elde edilen malzemeye uygulanabilir. Bu çalışmalar için bir model organizma olarak maya kullanımı hızı, maliyetler ve basitlik avantajları vardır. Ayrıca, gelişmiş bir genetik araçları ve mevcut silme suşları aday faktörlerin incelenmesini kolaylaştırmak.

Bu protokol, sitosolik bileşenlerden bir mitokondri içeren fraksiyonu ayrılmasını sağlar. Başarısını test etmek için en iyi yolu, farklı izolasyon adımlardan örnekler kuzey analizi ve batı analizi (Şekil 1) yapmaktır. Izolasyon kalitesi için üç parametre, bu analizlerden elde edilir. İlk olarak, örneklerde, RNA ya da protein bozulmamış olsun - bu analizlerde ayrı bantlar olarak tespit edilecektir. Parçalanma olaylar ilave, kısa bantlar veya smear görünümünü neden olacaktır. İkinci olarak, giriş (yan...

Mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA&#39;lar mitokondri dış membran ile ilişkilidir. Biz ilişkili mRNA&#39;lardan ve ribozomlarla maya mitokondri izolasyonu amaçlayan bir hücre altı bölme prosedürü tarif. Bu protokol, mRNA lokalizasyonu mekanizmaları ve mitokondri yakın olarak lokalize çeviri ortaya çıkarmak için çeşitli koşullar altında yetiştirilen hücreler uygulanabilir.

Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Bu prosedürün genel amacı, translasyon aşamasındaki mRNA'lar ile ilişkili mitokondrileri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle mitokondri zenginleştirme koşulları altında büyütülen maya hücrelerinin hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise hücrelerin sikloheksimid varlığında nazikçe parçalanmasıdır.Ardından mitokondriler, diferansiyel santrifüjasyon ile çözünür bileşenlerden ayrıştırılır. Son adım, mitokondrilerden ve kontrol örneklerinden RNA ekstraksiyonudur. Nihayetinde, mitokondri ile ilişkili RNA'nın saflığını ve kalitesini göstermek için northern analizi kullanılır.Bu tekniğin temel avantajı, birçok RNA türünün tek bir hazırlıkta izole edilebilmesidir. Bu sayede karşılaştırmalı bir analiz yapılabilir. Bu yöntem, hücre içi hedefleme ve organel fonksiyonu gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu prosedürde, fermente edilemeyen bir büyüme ortamında 30 °C'de OD 600 değeri 1 ile 1,5 arasına ulaşana kadar büyütülmüş 100 ila 150 mL maya hücresinden mitokondri saflaştırılacaktır. Hücreleri oda sıcaklığında 3000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı atın ve peleti çift distile su ile yıkayıp tekrar santrifüj edin.Süpernata

isolation-mrnas-associated-with-yeast-mitochondria-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Doğmakta olan peptidil-tRNAs içeren ribozomların biyokimyasal analizler için büyük bir engel, aynı örneklerde diğer ribozom varlığı olmuştur analiz edilen spesifik mRNA dizisinin çevirisinde yer almayan ribozomlar. Biz sadece ilgi doğmakta olan peptidil-tRNA içeren ribozomlar arındırmak için basit bir yöntem geliştirdi.

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

MRNA üzerindeki translasyonel duraklama siteleri tanımlamak için bir teknik tarif edilmiştir. Bu prosedür bir denatüre jel elektroforez ile olgunlaşmamış zincirlerinin boyutu analizi ve ardından bir hedef mRNA in vitro için, içerisinde sırasında ribozom üzerinde biriken olgunlaşmamış polipeptidlerin izolasyonu dayanmaktadır.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Translasyonel yönetmelik protein bereket kontrolünde önemli bir rol oynar. Burada, kantitatif analiz tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeçeviri için bir yüksek-den geçerek yöntemi açıklanmaktadır.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Mitokondri bakteriyel ve sitoplazmik karşılıkları ayrılmaktadır ribozomlara uzmanlaşmış. İşte nasıl mitoribosomes HEK hücreleri yerli onların kompartımanda elde edilebilir göstermektedir. Mitokondri süspansiyon hücrelerden yalıtım ve bunun sonucunda mitoribosomes arınma için yöntem içerir.

Hızlı izole edilmesi HEK hücrelerden Mitoribosome

Baker mayası mitokondriyal genom sekiz polipeptid kodlar. Mevcut protokolün amacı, hepsini etiketlemek ve daha sonra bunları ayrı bantlar olarak görselleştirmektir.

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Mitokondriyal temas bölgeleri, mitokondriyal iç ve dış zar proteinleri ile etkileşime giren protein kompleksleridir. Bu bölgeler, mitokondriyal membranlar arasındaki ve dolayısıyla sitozol ile mitokondriyal matris arasındaki iletişim için gereklidir. Burada, bu spesifik protein sınıfına uygun adayları belirlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Bu çalışma, maya mitokondrisinin biyolistik bir yöntem kullanılarak nasıl dönüştürüleceğini açıklamaktadır. Ayrıca, transformantların nasıl seçileceğini ve saflaştırılacağını ve mitokondriyal genom içinde hedef pozisyonda istenen mutasyonun nasıl tanıtılacağını da gösteriyoruz.

Baker'da Mitokondriyal Dönüşüm

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin maya hücrelerinde mitokondriyle ilişkili mRNA izolasyonu için diferansiyel santrifüjasyon yöntemini. Bu teknik, yerelleşmiş çeviri mekanizmalarını ve hücre içi hedeflemeyi araştırmak için kullanılır.

Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

Daha fazla video keşfet