Name: Sürekli Akış Microspotter kullanma Modifiye yüzeye hücrelerin Batık Baskı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Öğrenin, sürekli akış mikrospotter kullanarak batık baskı yöntemiyle serum kaplı yüzeylere fibroblast hücre dizileri basmayı. Bu teknik, ilaç tarama ve sitotoksisite değerlendirmesi için hassas hücre yerleşimi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, teknik yardım için Chris Morrow kabul etmek istiyorum. Finansman NIH SBIR (R43) tarafından sağlanan 1R43GM101859-01 (MPİ) GRANT10940803 vermek.

1.. Kültür HAZIRLIĞI Hücre <ol><li> Kullanıma hazır olana kadar sıvı azot içinde NIH/3T3 hücre stokları saklayın. </li><li> 50 ug / ml streptomisin,% 10 fetal sığır serumu, 10 mM HEPES tampon maddesi, 50 birim / ml penisilin, ve ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kullanılarak NIH/3T3 hücreleri için tam ortam hazırlayın. </li><li> 37 ° C &#39;de çalkalayıcı bir su banyosu içinde 2-3 dakika için hücreler Çözülme </li><li> 3 dakika boyunca 1,500 x g de tam ortam ve santrifüj içinde 5 ml içinde süspanse hücreler. </li><li> Hücre topaklarını bozmadan hücre süpernatantı. </li><li> Medya 5 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. <ol><li> Bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu ve yerine 10 ul çıkarın. </li><li> Hücre süspansiyonuna Trypan Blue 10 ul ilave edin ve pipet ucu ile karıştırın. </li><li> Pipet bir hemositometre odasına boyanmış hücrelerin 10 ul. </li><li> 10x hemositometrede hücreleri saymakbüyütme. <ol><li> 9 büyük kareler 4 için canlı hücreleri (küçük, beyaz top) saymak. Sadece Tripan Mavi leke koyu mavi görünmüyor canlı hücreleri saymak. </li><li> Hücreler orijinal hücre süspansiyon içinde 4 x 10 hücre / ml sayısının sonuçlanan büyük kare başına hücrelerin ortalama sayısını hesaplayın. </li><li> 1 x10 her bir T25 şişesi içinde, 5 ml toplam 5 hücre / ml bir yoğunlukta tohum hücreleri. </li></ol></li><li> Başlamadan deneylerden önce,% 70 ve% 80 confluency arasına Kültür hücreleri. Gerektiğinde her 2-3 gün medya Yenile ya. </li></ol></li></ol> 2.. Baskı Yüzey Hazırlama <ol><li> Mark, bir doku kültürü ile muamele edilmiş polistiren (TCTPS) 12 çukurlu levha altındaki işaretleyici ile bir dikdörtgen baskı kafası (19 mm x 7 mm) boyutudur. </li><li> Pipet 50 dikdörtgen alanı içine fetal sığır serumu ul ve ucu ile tüm bölge üzerine yayıldı. </li><li> Petri kabı bırakınSteril bir biyogüvenlik kaput O / N serum nokta tamamen kuruması için. Bu plakalar kullanmak için en fazla 2 gün önce hazırlanmalıdır. </li></ol> 3.. Batık Baskı <ol><li> Distile su ile baskı kafasını durulayın. <ol><li> Damıtılmış su ile bir 60 mm Petri kabı doldurmak ve yüzey üzerine baskı kafası rıhtım. </li><li> Pnömatik bir pompa kullanılarak 150 ul / dakika ile 2 dakika boyunca çizgilerin her birinden damıtılmış su akış. </li><li> Petri kabı suyu atmak ve temiz su ile doldurun. </li><li> Su yukarı ve aşağı 3 kez baskı kafasını hareket ettirin. </li></ol></li><li> Önceden hazırlanmış 12 oyuklu bir plaka içerisinde serum kaplı nokta üzerinde baskı kafası merkezi olarak yerleştirir. </li><li> Başbakan önceden ısıtılmış eksiksiz bir medya, kanal başına 300 ul ile baskı kafası. </li><li> Baskı, bir yüzey üzerine 50,000 hücre / ml &#39;lik konsantrasyon ile 60 ul / dk, kanal başına 100 ul süspansiyon hücreleri. </li><li> Karşı demirledi sol baskı kafasını, yerleştirinyüzey ve bir hücre kültürü inkübatöründe manifold 2 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C olarak ayarlanır. </li><li> 2 saat inkübasyondan sonra, baskı kafası çıkarın ve kültür çanağı üzerindeki kapağı yerleştirin. Yazıcı kafası kaldırıldı hangi süre 0 saat zaman noktası olarak kabul edilir. </li></ol> 4. Standard Hücre Kültürü <ol><li> Aşama 2&#39;de hazırlanan serum benekli TCTPS 12 oyuklu plaka birine önceden ısıtılmış ortam 1 ml ilave edilir. </li><li> Bir 12-yuvalı plaka TCTPS tek bir kuyuya pipetle adım 2 ve geri kalan hücre süspansiyonu 1 ml al. Bu tabak içinde 50,000 hücre ihtiva eden bir kültür üretecektir. </li><li> 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde, hücre kültürü plakası yerleştirin. </li><li> 2 saat kuluçka zamanlaması başladıktan sonra; baskılı ve tohum örnekleri arasındaki tutarlılık için, bu 0 hr zaman noktası olarak kabul edilir. </li></ol> 5. Kültür Görselleştirme <ol><li> 0, 2, 24, ve iki yöntemlerin her biri 48 saat sonra, germe hücre dStandart bir ters mikroskop kullanılarak, yukarıda ve görüntü TANIMLANMIŞ. <ol><li> Propidyum iyodür, sadece ölü hücre çekirdeği içine dahil edilen kırmızı bir floresan boya kullanarak hücreleri Leke. <ol><li> Yavaşça kalsiyum ve pislikleri kaldırmak magnezyum (PBS + +) ile fosfat tamponlu tuzlu su, 1 ml ile hücreler 3 kez yıkayın. </li><li> Her bir kültür teknesine, önceden ısıtılmış PBS + + 1 ml ilave edilir. </li><li> Her bir kültür teknesine propidyum iyodür stok çözeltisi (1 mg / ml) 1 ul ekle. </li><li> 10 dakika boyunca 37 ° C &#39;de propidyum iyodürle boyanan hücreleri inkübe edin. </li></ol></li><li> Görüntü ters bir 10x ve 40x büyütme mikroskop kullanarak hücreleri. </li></ol></li><li> Uygun bir biohazard konteyner hücreleri atın. </li></ol>

<ol><li>Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cellular+microarray+platforms%3A+applications+in+drug+discovery%2C+toxicology+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research.</a> Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).</li>
<li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+assays%3A+fuelling+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-based assays: fuelling drug discovery.</a> Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+microfluidic+devices+for+in+vitro+cell+culture+for+cell-biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).</li>
<li>Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+compound+libraries+for+drug+discovery%3A+an+ongoing+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).</li>
<li>Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+approach+to+stem-cell+biology+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine.</a> Nature. 453, 338-344 (2008).</li>
<li>Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+technologies+for+tissue+engineering+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microscale technologies for tissue engineering and biology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).</li>
<li>Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cellular+microenvironments+to+improve+cell-based+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing.</a> Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).</li>
<li>Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microarrays+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell microarrays in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).</li>
<li>Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-assisted+in+vitro+drug+screening+and+carrier+production%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).</li>
<li>Gottwald, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Liu, R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+R+%22Integrated+Biochips+for+DNA+Analysis%22">Integrated Biochips for DNA Analysis</a>. , Springer. (2008).</li>
<li>Natarajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow+microfluidic+printing+of+proteins+for+array-based+applications+including+surface+plasmon+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).</li>
<li>Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Conditions+for+Protein+Array+Deposition+Using+Continuous+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow.</a> Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).</li>
<li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+high+throughput+kinetics+early+in+the+drug+discovery+process%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> , Summer 2011. Drug Discovery World Online at:
 
 <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/p-149288">http://www.ddw-online.com/p-149288</a> (2011).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+ovarian+cancer+coculture+model+using+a+high-throughput+cell+patterning+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform.</a> Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).</li>
<li>Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+a+review+of+their+structure+and+mechanisms+of+ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Symposia+of+the+Society+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107(1993).</li>
<li>Roberts, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mixed+self-assembled+monolayers+presenting+RGD+and+%28EG%29+3OH+groups+to+characterize+long-term+attachment+of+bovine+capillary+endothelial+cells+to+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces.</a> Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).</li>
<li>Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+cell+adhesion+encoded+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization.</a> Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).</li>
<li>Hsiao, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+surface+modification+with+DNA+for+the+capture+of+primary+cells+and+the+investigation+of+myotube+formation+on+defined+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns.</a> Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).</li>
<li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).</li>
<li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting%3A+inkjet+printing+proteins+and+hybrid+cell-containing+materials+and+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures.</a> J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).</li>
<li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Microfabrication%3A+Observing+Intercellular+Interactions+Using+Lithographically-Defined+DNA+Capture+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences.</a> Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).</li>
<li>Hsiao, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Coated+AFM+Cantilevers+for+the+Investigation+of+Cell+Adhesion+and+the+Patterning+of+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar reaktifler ve / veya bu metinde kullanılan aletleri üreten Wasatch Microfluidics çalışanı ve hissedarları vardır.

Burada anlatılan 3D mikroakışkan baskı teknolojisi, iyi doldurulmuş bir sıvının içine hücre microfluidically baskı dizilerin benzersiz yeteneğine sahip bir batık yüzeyini yani. Batık yüzeyleri üzerine baskı ile, hücre mikroarray&#39;ler hücrelerin fizyolojik olarak ilgili hücre fenotipi hem de tek bir iyi Şekil 4&#39;ün alt hücreleri multiplex yeteneğini korumak üretilebilir. Microfluidically hücreleri sonuçlar baskı Bu çalışmanın sonuçları, karşılaştırılabilir hücre morfolojisi ve canlılığı il...

Ilaç endüstrisinde son gelişmeler, ilaç tarama ve cytotoxicological analiz 1,2,3 için ilaç keşfi sürecinde hücresel mikrodiziler kullanarak artan ilgi yol açmıştır. Hücre mikrodizileri kullanılarak in vitro yüksek verimli tarama deneyleri ve yöntemlerinin geliştirilmesi, hızlı ve düşük maliyetli bir ilaç adaylarının gelişimi hem de önceden hücrenin 1,4 temel anlayışı kolaylaştıracaktır. Hücreleri ile tarama için geleneksel yaklaşım, geleneksel iyi-plaka platformları kullanır; Ancak bu yaklaşım nedeniyle yüksek maliyet, sınırlı verim ve hücre fonksiyonu 1,5 nicel bilgi için sınırlı yeteneği sınırlıdır. Bu sınırlamalar nedeniyle, hücresel mikroarray teknolojileri araştırma moleküler biyolojik karakterizasyonu, doku mühendisliği ve ilaç tarama 1,6 için gelişen edilir. Hücresel microarrays avantajları küçük bir örnek kullanımı, minimal etkilerini içerirhücresel fenotip heterojenite bilgi maskeleme ve daha yüksek hacimli uygulamalar 1,7,8 için tahliller otomatikleştirmek için en önemlisi yetenek. Farmasötik sanayi şu anda mikrotiter yuvalı plakalar 9 ilaç taraması için 2B hücre tek-tabakalı kültürler ile yüksek yayılmalı hücre bazlı bir tarama tahlilleri kullanır. Mikrotitre plakalara çoğullama hücreleri özgün deney seçenekleri ile daha yüksek verim için potansiyel sunmaktadır. Bundan başka, hücre mikrodizilerinde mevcut teknolojiler, hücreler, in vivo önemli ölçüde 10,11 gelen hücrelerin fenotipinin değiştirebilir ki kurumaya bırakın. Bu sorunların üstesinden gelmek için, MFCA tasarlanmış ve Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. MFCA 3D akışkansal tasarımı bir banyoya daldırılır ve bir yalıtım oluşturmak için bir yüzeye karşı sıkıştırılmak üzere, Şekil 1&#39; deki baskı kafası ucu sağlar. Kafasının yumuşak silikon ucu gibi davranırConta ve geri dönüşümlü bir mühür oluşturur. MFCA teknolojisi, özellikle, hücre kültürleri, doku dilim sistemler için gerekli olan batık yüzeyleri ile arabirim oluşturmak için uygun, ve diğer yaklaşımlar ile zor veya imkansız olur. Pimleri veya mürekkep püskürtmeli baskı çalışmaz, ve 2D mikroakışkan cihazlar birikimi veya ayrık noktalar büyük diziler ile arabirim için uygun değildir. Bundan başka, deney minyatürleştirme ve lokalize ile - hücresel mikro-dizi - MFCA, yüksek yayılmalı hücre bazlı tarama deneyleri ile ilgili önemli problemlerin üstesinden gelmektedir. CFM bir yüzey 12,13 mikroskobik nokta yerlerine bisikletle küçük hacimli sıvı örneklerinin 3D kanal ağlarını kullanır. Akış ile baskı ile, biyomoleküller, hücreler ve diğer reaktifler, mevcut hücre baskı teknikleri engellemektedir hava, maruz kalmadan hassas biyomoleküllerin ve hücrelerin baskı sağlayan, baskı işlemi boyunca sıvı bir ortamda muhafaza edilir. Bu dizi yüzeyde bir yakalama mekanizması vardır örneğin, hibridoma süpernatanları ya da sağlanan gibi ham malzeme doğrudan baskı için de mümkündür. Bu yazının amacı, bir yüzey üzerine ayrıntılı olarak, iki hücre tiplerinin batık baskı açıklamaktır.

<table><tbody><tr><td>Sürekli akışlı mikrospotter</td><td>Wasatch Mikroakışkanlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Dubbleco'nun Modifiye Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Hücreler için temel ortam</td></tr><tr><td>HEPES tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>Hücre ortamı katkı maddesi (kontrol pH)</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td>Hücre ortamı katkı maddesi</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Hücre ortamı katkı maddesi</td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>Leke hücresi sayımı için</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td>Hücreleri saymak için hücre odası</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS100</td><td>Nikon</td><td></td><td>Hücreleri kontrol etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td>Görüntü toplamak</td></tr> <tr><td>için kullanılırFosfat tamponlu salin (kalsiyum ve magnezyum ile)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td>Hücrelerin pasajdan önce ve PI TrypLE Express ile boyamadan önce durulanması</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A12177-01</td><td>Hücreleri yüzeyden çıkarmak için kullanılır</td></tr></tbody></table>

sürekli akış microspotter kullanma modifiye yüzeye hücrelerin batık baskı

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

Mikrodizi uygulamaları için hücrelerin basılması, baskıdan sonra fizyolojik olarak ilgili hücre fenotipini koruma sorunu, istenen hücrelerin zayıf organizasyonu ve dağılımı ve dizi içinde hedeflenen alanlara ilaç ve/veya besin sağlayamama gibi önemli zorluklara sahiptir. 3D mikroakışkan baskı teknolojimiz, hücre dizilerini otomatik ve çoğullanmış bir şekilde batık yüzeylere benzersiz bir şekilde sızdırmaz hale getirme ve yazdırma yeteneğine sahiptir. Mikroakışkan hücre dizisi (MFCA) 3D akışkanların tasarımı, yazıcı kafası ucunun sıvı dolu bir kuyuya veya tabağa indirilmesini ve bir sızdırmazlık oluşturmak için bir yüzeye sıkıştırılmasını sağlar. Baskı kafasının yumuşak silikon ucu bir conta gibi davranır ve basınç uygulayarak veya geri çekilerek ters çevrilebilir bir conta oluşturabilir. Pin veya mürekkep püskürtmeli yazıcılar gibi diğer hücre yazdırma teknolojileri, batık uygulamalarda yazdırma yapamaz. Batık yüzey baskısı, hücrelerin fenotiplerini korumak ve bu hücreleri, malzeme yüzey özelliklerini bozmadan bir yüzey üzerinde izlemek için gereklidir. Batık yüzeylere baskı yaparak, kanser, diyabet, iltihaplanma, enfeksiyonlar ve kardiyovasküler hastalık dahil olmak üzere çok sayıda alanda ilaç taraması ve sitotoksisite değerlendirmesine izin veren hücre mikrodizileri üretilir.

Fibroblast hücre hattı NIH/3T3 hücreler, bir dalgıç yüzey üzerine basılı veya ekilmiştir. Hücreler, ml başına 5 x 10 4 hücre yoğunluğuna kadar büyütülmüştür. Hücreler, geleneksel hücre kültürü teknikleri kullanılarak ekilmiştir. Hücreler, geniş ebatlı, kanal proteinleri ve diğer biyomoleküllerin için kullanılan daha CFM (~ 500 um) daha büyük olan on iki akış hücresi baskı kafası kullanılarak basıldı. Hücreler serum kaplı yüzey üzerine basılı veya ekilmiştir. Baskı işlemi Şekil 1 de gösterilmi...

Bu 3D mikroakışkan baskı teknolojisi, hücre dizilerini batık yüzeylere yazdırır. Hücre dizilerinin 3D akış hücrelerinde mikroakışkan olarak batık yüzeylere nasıl iletildiğini açıklıyoruz. Batık yüzeylere baskı yapılarak, çok sayıda alanda ilaç taraması ve sitotoksisite değerlendirmesine izin veren hücre mikrodizileri üretildi.

Sürekli Akış Microspotter kullanma Modifiye yüzeye hücrelerin Batık Baskı

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Bu prosedürün genel amacı, üç T üç fibroblastını serum kaplı bir yüzeye yazdırmaktır. Bu işlem, öncelikle bir doku kültürü yüzeyine serumun ön adsorpsiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, sürekli akışlı bir mikro spotter kullanarak fibroblast süspansiyonunun yüzeye yazdırılması ve ardından hücrelerin 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edilmesidir.Ardından, karşılaştırma yapmak amacıyla, hem basılan hücreler hem de standart hücre kültürü yoluyla ekilen hücreler propidyum iyodür ile boyanır ve ters mikroskop altında gözlemlenir. Son olarak, ilgili zaman noktalarında hücre canlılığı, yoğunluğu ve morfolojisini değerlendirmek için floresan mikroskopi kullanılır. Bu tekniğin pin baskılama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, baskı kafasının yüzey üzerinde bir sızdırmazlık oluşturarak hücrelerin hücre besiyerine daldırılmış haldeyken basılmasına olanak sağlamasıdır.Hücrelerin daldırma yöntemiyle basılması, yeni ilaç adaylarının güvenliği ve etkinliğinin taranması için faydalı olsa da, genel olarak daldırma yöntemiyle baskı diğer uygulamalar için de kullanışlıdır. Örneğin, yeni ilaç adaylarını doku kesitleri üzerinde analiz edebilir veya bu yöntemi organ sistemleri için bir model olarak kullanabiliriz. Örneğin, bir karaciğer perfüzyon modeli.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayabilirler çünkü yazıcı hazırlama ve hücre basımı sırasında hatlara hava girmemesi gerekir; aksi takdirde bu durum hücre ölümüne yol açabilir. Başlamak için, NIH three T three hücrelerini 37 °C sıcaklıktaki çalkalamalı bir su banyosunda iki ila üç dakika boyunca çözdürün. Hücreleri beş mL tam besiyerinde yeniden süspande edin ve 1500 G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.Hücre peletini bozmadan hücre süpernatantını uzaklaştırın. Ardından hücreleri beş mililitre besiyerinde yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonundan 10 µL'yi 0,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Sonrasında, hücre süspansiyonuna 10 µL tripan mavisi ekleyin ve pipet ucuyla karıştırın; boyanmış hücrelerden 10 µL'yi bir hemositometre haznesine pipetleyin.Hücreleri 10 x büyütmede saymadan önce, dokuz büyük karenin dördünde küçük beyaz kürelere benzeyen canlı hücreleri sayın. Trypan blue boyası nedeniyle koyu mavi görünmeyen canlı hücreleri sayın. Büyük kare başına düşen ortalama hücre sayısını hesaplayın; bu değer, orijinal hücre süspansiyonundaki mililitre başına hücre sayısının 10.000 ile çarpılmış halini verecektir.Ardından, her bir T 25 flask içerisinde toplam beş mililitre olacak şekilde, mililitre başına 100, 000 hücre yoğunluğunda hücre ekimi yapın. Deneylere başlamadan önce hücreleri %70 ile %80 konfluens arasına gelene kadar kültüre edin. Baskı yüzeyini hazırlamak için, doku kültürü işleminden geçmiş polistiren 12'nin altına bir marker kullanarak baskı kafası boyutunda bir dikdörtgen çizin.Kuyu plakasına 50 µL fetal bovine serumu dikdörtgen alana pipetleyin ve tüm bölgeye yayın. Pipet ucuyla işlemi tamamladıktan sonra, serum lekesinin tamamen kuruması için kuyu plakasını steril bir biyogüvenlik kabininde gece boyunca bekletin. Daldırma baskı işlemine başlamak için baskı kafasını distile su ile durulayın.Ardından, 60 milimetrelik bir Petri kabını distile su ile doldurun ve baskı kafasını yüzeye yerleştirin; pnömatik bir pompa kullanarak her bir hattan dakika başına 150 mikrolitre hızla iki dakika boyunca distile su akıtın. Daha sonra Petri kabındaki suyu dökün ve kabı temiz su ile doldurun. Sonrasında, baskı kafasını suyun içinde üç kez yukarı ve aşağı hareket ettirin.Yazıcı kafayı, önceden hazırlanmış 12 kuyucuklu plaktaki serum kaplı noktanın üzerine ortalayarak yerleştirin. Ardından yazıcı kafayı Prewarm ile hazırlayın. Kanal başına 300 microliters tam besiyeri kullanın.Birden fazla baskı yapılacaksa, baskılar arasında suyla durulamaya ek olarak bir çamaşır suyuyla durulama adımı ekleyin. Süspansiyon halindeki hücreleri mililitre başına 50,000 hücre konsantrasyonunda, dakikada 60 microliters hızla ve kanal başına 100 microliters olacak şekilde yüzeye basmaya geçin.Hücre basımından sonra, baskı kafasını sol taraftaki yüzeye dayalı konuma getirin ve manifoldu bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İki saat boyunca %5 karbon dioksit ve 37 °C değerlerine ayarlayın. İki saatlik inkübasyonun ardından baskı kafasını çıkarın ve kültür kabının kapağını kapatın.Baskı kafasının çıkarıldığı an, sıfırıncı saat zaman noktası olarak kabul edilir. Karşılaştırma amacıyla standart hücre kültürü de gerçekleştirilir. Serum damlatılmış 12 kuyucuklu plakalardan birine bir mililitre önceden ısıtılmış besiyeri ekleyin, ardından kalan hücre süspansiyonundan bir mililitre alarak 12 kuyucuklu plakanın tek bir kuyucuğuna pipetleyin.Bu işlem, kapta 50,000 hücre içeren bir kültür oluşturacaktır. Hücre kültürü plağını 37 °C'deki bir inkübatöre iki saat süreyle yerleştirin. İki saatlik inkübasyonun ardından, basılmış ve ekilmiş örnekler arasında tutarlılık sağlamak için zamanlamayı başlatın.Burası sıfırıncı saat zaman noktası olarak kabul edilir. 0, 2, 24 ve 48 saat sonra, yalnızca ölü hücrelerin çekirdeğine nüfuz eden propidyum iyodür ile boyayarak, her iki yöntemden elde edilen hücreleri görüntüleme için hazırlayın. İlk olarak, kalıntıları temizlemek için hücreleri kalsiyum ve magnezyum içeren bir mililitre fosfat tamponlu salin ile üç kez nazikçe durulayın.Ardından, her bir kültür kabına bir mililitre önceden ısıtılmış kültür medyumu ve ardından bir mikrolitre propidyum iyodür stok çözeltisi ekleyin. Hücreleri, 10x ve 40x büyütmede ters mikroskop kullanarak görüntülemeden önce propidyum iyodür ile boyanmış halde 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. Son olarak hücreleri uygun bir biyotehlike konteynerine atın.Fibroblast hücre hattı olan NIH three T three hücreleri, daldırılmış bir yüzey üzerine basılmış veya ekilmiştir. Basım ve ekim işlemlerinin ardından, hücrelerin yoğunluğu ve morfolojisini değerlendirmek amacıyla ilgili zaman noktalarında görüntüleme yapılmıştır. Görüntüler, hücrelerin her zaman noktasında ve her büyütme oranında neredeyse aynı fenotiplere sahip olduğunu göstermiştir.Bu verilere dayanarak, etkili basımın minimum düzeyde olduğu belirlenmiştir. Hücre canlılığı propidyum iyodür boyaması kullanılarak değerlendirilmiş ve basılan hücrelerin canlılığının, her bir zaman noktası için ekilen hücrelerden anlamlı düzeyde farklı olmadığı ortaya çıkmıştır. Hücrelerin yüzeye tutturulması için kullanılan iki yöntem arasındaki temel fark, hücre yoğunluğudur.İki saatlik zaman noktasında, hem ekilen hem de basılan hücrelerde basılı hücre yoğunluğu %50'den fazla azalmaktadır. Bu azalmanın nedenini belirlemek için daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. Bununla birlikte, ekilen hücrelerle karşılaştırıldığında genel basılı yoğunluk oranları önemli ölçüde daha yüksek kalmaktadır.Hücrelerin ekim ile aynı yoğunlukta ancak daha küçük bir alana basıldığı göz önüne alındığında, akış hücresindeki basılı hücre yoğunluğu her zaman noktasında ekilen hücrelerden yaklaşık 10 kat daha yoğundu. Son zaman noktasında hücreler aynı yoğunluktadır; bu durum muhtemelen hücre hareketliliği ve kaynak tüketim sınırlamalarından kaynaklanmaktadır. Geliştirildiğinden beri bu teknik, ilaç keşfi alanındaki araştırmacıların ilaç toksisitesi ve etkinliğinin hücreler üzerindeki etkilerini; ayrıca kanser yardımları, kalp hastalıkları ve diğer yüksek talep gören alanları incelemelerinin önünü açmıştır.Sualtı hücre basımını; yapışma ve programlanabilir hücre adezyonu gibi diğer teknolojilerle birlikte kullanarak, tekniğin kapsamını genişletilmiş ilaç keşfi ve geliştirme taramaları için süspansiyon hücrelerine kadar genişletebiliriz. Bu videoyu izledikten sonra, sualtı basım tekniğimizi kullanarak hücrelerin nasıl basılacağı konusunda sağlam bir anlayışa sahip olmalısınız.

the-submerged-printing-cells-onto-modified-surface-using-continuous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Microcontact baskı malzemesi yüzeylerde desen proteinleri ve diğer molekülleri yaygın bir biçimde kullanılmaktadır. Biz fibronektin cam üzerine desen damgalama, bu sürecin temel adımları göstermektedir.

Proteinlerin Hücre Biyolojisi Microcontact Baskı

Uzun zincirli altın Alkan tiyoller oluşan Kendinden monte mono tabakaları (SAMs), protein desen ve hücre hapsi oluşumu için iyi tanımlanmış substratları sağlar. Microcontact baskı ile dolgu takip polidimetilsiloksan (PDMS) damga kullanarak hexadecanethiol glikol-sonlandırılır Alkan tiyol monomer damgalı hexadecanethiol bölgede sadece protein ve hücreler adsorbe bir desen üretir.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Bir bioprinter içine bir HP Deskjet 500 Yazıcı dönüştürmek için kullanılan yöntemlerin açıklaması. Yazıcı membran geçici gözenekler neden canlı hücreler, işleme kapasitesine sahiptir. Bu gözenekler baskılı hücrelerine flüoresan G-aktin dahil olmak üzere küçük moleküller, dahil etmek için kullanılabilir.

Standart Mürekkep Püskürtmeli Yazıcı Kullanımı Geçici Hücre Zarı Gözenekler oluşturma

Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Biyolojik ligandların mikro ölçekli modelleriyle işlevselleştirilmiş hücre kültürü substratları, doku mühendisliği alanında çok büyük bir faydaya sahiptir. Burada, biyolojik ligandların mekansal olarak hassas ve bölgeye özgü immobilizasyonunu sağlayan ortogonal kimyalar sunan çoklu, mikro desenli poli (etilen glikol) fırçalarla doku kültürü substratlarının çok yönlü ve otomatik üretimini gösteriyoruz.

Robotik Microcontact Baskı (R-μCP) kullanarak Karmaşık Kültürü Substratlar ve Sıralı nükleofilik Giren Fabricating

Bir yüzey üzerinde canlı hücre tek katmanlarının eksiltici desenlemesini gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu, bir mikroakışkan prob (MFP) kullanılarak yapışık hücrelerin lokal ve seçici parçalanması ile elde edilir. Yerel bölgelerden alınan hücre lizatı, aşağı akış analizi için kullanılabilir ve bu da moleküler profilleme çalışmalarına olanak tanır.

mikroakışkan Probe ile Canlı Hücre Katmanlar hızlı Subtractive Desenlendirme

Bu protokol, kazınmış topografik kılavuz ipuçlarını hidrojel biyomürekkebi taşıyan bir hücrenin hassas birikimiyle birleştiren otomatik bir robotik biriktirme sistemi kullanan bir biyo-baskı metodolojisini açıklar. Basılı hücreler doğrudan kazınmış özelliklere iletilir ve onlarla birlikte algılayabilir ve yönlendirebilir.

Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

Bu rapor, biyolojik araştırmalar için mikroakışkan kanalları hücreler ve substratlarla doldurmak için düşük basınçlı vakum kullanan basit, uygulaması kolay bir tekniği açıklamaktadır.

Desenlendirme Proteinlerin ve Hücreleri Çok Yönlü Yöntemi

Burada, yüksek çözünürlüklü iletken desenleri electrohydrodynamic (EHD) jet baskı kullanarak üretmek için bir protokol mevcut. Protokol EHD püskürtmeli baskı iki mod içerir: sürekli yakın alan electrospinning (NFES) ve istek üzerine damla (DOD) EHD nokta tabanlı yazdırma.

Yüksek çözünürlüklü Electrohydrodynamic Jet iki modu kullandıktan biçimlenme: damla talep ve yakın alan Electrospinning

Bu metodoloji, substrat sertliği, protein bileşimi ve hücre morfolojisi gibi hücre dışı matris ipuçlarının Schwann hücresi (SC) fenotipini düzenleyen mekanizmalarını göstermeyi amaçlamaktadır.

Schwann Hücre Fenotip Spesifikasyonunu Değerlendirmek Için Hücre Dışı Matriks Mikroortamlarının Hazırlanması

Öğrenin, sürekli akış mikrospotter kullanarak batık baskı yöntemiyle serum kaplı yüzeylere fibroblast hücre dizileri basmayı. Bu teknik, ilaç tarama ve sitotoksisite değerlendirmesi için hassas hücre yerleşimi sağlar.

Sürekli Akış Microspotter kullanma Modifiye yüzeye hücrelerin Batık Baskı

Daha fazla video keşfet