Sürekli Akış Microspotter kullanma Modifiye yüzeye hücrelerin Batık Baskı

Bu prosedürün genel amacı, serum kaplı bir yüzeye üç T üç fibroblast basmaktır. Bu, ilk önce serumun bir doku doku kültürü yüzeyine önceden adsorbe edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, sürekli akışlı bir mikro gözcü kullanarak yüzeye bir fibroblast süspansiyonu basmak ve ardından hücrelerin iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilmesidir.

Daha sonra, basılı hücreler ve standart hücre kültürü yoluyla ekilen hücreler, propidyum iyodür ile boyanır ve karşılaştırma için ters çevrilmiş bir mikroskop altında görselleştirilir. Sonuç olarak, floresan mikroskobu, ilgili zaman noktalarında hücre canlılığını, yoğunluğunu ve morfolojisini değerlendirmek için kullanılır. Bu tekniğin pim baskısı gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, baskı kafasının yüzey üzerinde bir sızdırmazlık oluşturması ve hücrelerin hücre ortamına daldırılmışken basılmasına izin vermesidir.

Hücrelerin batık baskısı, yeni ilaç adaylarının güvenlik ve etkinlik açısından taranması için yararlı olsa da, genel olarak batık baskı, diğer uygulamalar için de yararlıdır. Örneğin, yeni ilaç adaylarını doku dilimlerine karşı analiz edebilir veya organ sistemleri için bir model olarak kullanabiliriz. Örneğin, bir karaciğer bolluğu modeli.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü yazıcı hazırlama ve hücre yazdırma sırasında hatlara hava giremez veya hücre ölümüne neden olabilir. Başlamak için, NIH üç T, üç hücreyi 37 santigrat derecede çalkalanan bir su banyosunda iki ila üç dakika boyunca çözdürün. Hücreleri beş mililitre tam ortamda yeniden askıya alın ve üç dakika boyunca 1500 Gs'de santrifüjleyin.

Hücre peletini bozmadan hücre süpernatantını çıkarın. Daha sonra hücreleri beş mililitre ortamda yeniden süspanse edin ve 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 0.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna 10 mikrolitre triam mavisi ekleyin ve pipetin ucuyla lekeli hücrelerin 10 mikrolitresini bir hemo sitometre odasına karıştırın.

Hücreleri 10 x büyütmede saymadan önce, dokuz büyük kareden dördü için küçük beyaz toplara benzeyen canlı hücreleri sayın. Trippen mavisi lekesinden yalnızca koyu mavi görünmeyen canlı hücreleri sayın. Büyük kare başına ortalama hücre sayısını hesaplayın, bu da orijinal hücre süspansiyonunda hücre sayısı çarpı mililitre başına 10.000 hücre ile sonuçlanır.

Daha sonra, her bir T 25 şişesinde toplam beş mililitre olacak şekilde mililitre başına 100.000 hücre yoğunluğunda tohum hücreleri. Deneylere başlamadan önce hücreleri %70 ila %80 arasında bir akıcılığa kadar kültürleyin. Baskı yüzeyini hazırlamak için, doku kültürü ile muamele edilmiş polistiren 12'nin altındaki baskı kafasının boyutunda bir dikdörtgeni işaretlemek için bir işaretleyici kullanın.

Kuyu plakası 50 mikrolitre fetal sığır serumunu dikdörtgen alana pipetleyin ve tüm bölgeye yayın. Uç ile, serum lekesinin tamamen kurumasını sağlamak için kuyu plakasını gece boyunca steril bir biyogüvenlik başlığında bırakın. Daldırılmış yazdırmaya başlamak için, yazıcı kafasını damıtılmış suyla durulayın.

Daha sonra 60 milimetrelik bir Petri kabını damıtılmış suyla doldurun ve baskı kafasını yüzeye yerleştirin, damıtılmış suyu iki dakika boyunca dakikada 150 mikrolitre hızla her bir hattan geçirin. Ardından Petri kabındaki suyu atın ve temiz suyla doldurun. Ardından, yazıcı kafasını suda üç kez yukarı ve aşağı hareket ettirin.

Yazıcı kafasının merkezini, önceden hazırlanmış 12 oyuklu plakadaki serum kaplı noktanın üzerine yerleştirin. Ardından yazıcı kafasını Ön Isıtma ile astarlayın. Kanal başına 300 mikrolitrede komple medya.

Birden fazla baskı yapıyorsanız, baskılar arasında suyla durulamaya ek olarak bir ağartıcı durulama ekleyin. Askıya alınmış hücreleri yüzeye mililitre başına 50.000 hücre konsantrasyonunda ve dakikada 60 mikrolitre yazdırmaya devam edin. Kanal başına 100 mikrolitre.

Hücre yazdırmadan sonra, yazıcı kafasını yüzeye ve manifolda sola sabitlenmiş olarak bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İki saat boyunca% 5 karbondioksit ve 37 santigrat dereceye ayarlayın. İki saatlik inkübasyondan sonra, baskı kafasını çıkarın ve kapağı kültür kabının üzerine yerleştirin.

Yazıcı kafasının çıkarıldığı zaman, sıfır saatlik zaman noktası olarak kabul edilir. Karşılaştırma için standart hücre kültürü de yapılır. Serum lekeli 12 oyuklu plakalardan birine bir mililitre ön ısıtma ortamı ekleyin, ardından kalan hücre süspansiyonundan bir mililitre alın ve 12 oyuklu plakanın tek bir oyuğuna pipetleyin.

Bu, çanakta 50.000 hücre içeren bir kültür üretecektir. Hücre kültürü plakasını iki saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. İki saatlik inkübasyondan sonra, basılı ve tohumlama numuneleri arasındaki tutarlılık için zamanlamaya başlayın.

Bu, sıfır saatlik zaman noktası olarak kabul edilir. 0 2, 24 ve 48 saat sonra, sadece ölü hücrelerin çekirdeğine dahil edilen propidyum iyodür ile boyayarak görüntüleme için iki yöntemin her birinden hücreleri hazırlayın. İlk olarak, kalıntıları gidermek için hücreleri bir mililitre fosfat şişirilmiş serum fizyolojik ile kalsiyum ve magnezyum ile üç kez nazikçe durulayın.

Daha sonra, her bir kültür kabına bir mililitre ön ısıtma kültür ortamı ve ardından bir mikrolitre propidyum iyodür ekleyin. Stok çözeltisi: propidyum iyodür ile boyanmış hücreleri, hücreleri 10 x ve 40 x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak görüntülemeden önce 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Son olarak, hücreleri uygun bir biyolojik tehlike kabına atın.

Fibroblast hücre hattı, NIH üç T üç hücre, batık bir yüzeye basıldı veya tohumlandı. Baskı ve tohumlamadan sonra, hücreler ilgili zaman noktalarında yoğunluğu ve morfolojiyi değerlendirmek için görselleştirildi. Görüntüler, hücrelerin her zaman noktasında ve her büyütmede neredeyse aynı fenotiplere sahip olduğunu gösterdi.

Bu rakamlardan yola çıkarak efektif baskının minimal olduğu tespit edilmiştir. Hücre canlılığı, bir propidyum iyodür boyası kullanılarak değerlendirildi ve basılı hücrelerin canlılığının, her bir zaman noktası için oturan hücrelerden önemli ölçüde farklı olmadığını ortaya koydu. Hücreleri yüzeye tutturmak için kullanılan iki yöntem arasındaki en büyük fark, hücrelerin yoğunluğudur.

Yazdırılan hücre yoğunluğu, hem oturan hem de yazdırılan hücrelerde iki saatlik zaman noktasında %50'nin üzerinde azalır. Bu düşüşün nedenini belirlemek için daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. Bununla birlikte, tohumlanmış ile karşılaştırıldığında genel basılı yoğunluk oranları önemli ölçüde daha yüksek kalmaktadır.

Akış hücresindeki basılı hücre yoğunluğu, hücrelerin tohumlama ile aynı yoğunlukta, ancak daha küçük bir alanda basıldığı düşünüldüğünde, tohumlanan hücrelerin her zaman noktasında yaklaşık 10 kat daha yoğundu. Son zaman noktasında, hücreler aynı yoğunluktadır, bu da muhtemelen hücre hareketliliği ve kaynak tüketimi sınırlamalarından kaynaklanmaktadır. Geliştirilmesinden bu yana, bu teknik, ilaç toksisitesinin ve etkinliğinin hücreler ve kanser yardımcıları, kalp hastalığı ve diğer yüksek talep alanları üzerindeki etkilerini incelemek için ilaç keşfi alanlarındaki araştırmacıların yolunu açmıştır.

Yapışma, programlanabilir hücre yapışması gibi diğer teknolojilerle birlikte batık hücre baskısını kullanarak, genişletilmiş ilaç keşfi ve geliştirme taraması için tekniğin erişimini süspansiyon hücrelerine genişletebiliriz. Bu videoyu izledikten sonra, batık yazdırma tekniğimizi kullanarak hücrelerin nasıl yazdırılacağı konusunda sağlam bir anlayışa sahip olmalısınız.