Aktivasyon ve İnsan monosit türevli dendritik hücreler, IL-1β kullanarak NLRP3 Inflammasome Aktivitenin Ölçümü

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, basit IL-1β okuma analizleri kullanarak in vitro insan dendritik hücrelerinde inflamozom aktivitesini gözlemlemektir. İlk olarak, hücre içi pro-IL-1β ekspresiyonunu indüklemek için hücrelere R 8 48 ekleyin. Ardından, NLRP3 inflamozom oluşumunu aktive etmek için nigerisin ekleyin.

Bu durum ise, salgılanmadan önce pro IL-1β'nin olgun IL-1β'ye parçalanmasını tetikler. Ardından, örnekleri toplayın ve immunofloresan, western blot ve ELISA kullanılarak primerize ve aktive edilmiş hücrelerden IL-1β salınımı ölçülerek elde edilen hücre içi pro IL-1β ve hücre dışı olgun IL-1β sonuçlarını ölçün. Bir tespit, insan DC'lerinin primerizasyonunun R 8 48 primerize hücrelerde hücre içi pro IL-1β üretimiyle ve hem primerize edilmiş hem de Nigerisin ile aktive edilmiş hücrelerden IL-1β salınımıyla sonuçlandığını göstermektedir.

Bu yöntem, sentetik ligandlara karşı insan dendritik hücre yanıtında NLRP3 inflamozomunun rolüne dair içgörü sağlayabilir. Ayrıca bakteriler, virüsler ve otoinflamatuar hastalıklar gibi fizyolojik tetikleyicileri test etmek için tasarlanmış diğer sistemlere de uygulanabilir. Dinlenme durumundaki taze izole edilmiş monosit kaynaklı dendritik hücrelerden 200 µL'lik alikotları 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya aktarın.

Uyarılmamış negatif kontrol, yalnızca primleme, yalnızca aktivasyon ve primlemeyi takip eden aktivasyon olmak üzere dört standart koşulla başlayın. Ardından, deneysel tasarıma uygun olarak, sonraki hücre içi sitokin boyama analizleri için R 8 48 ve nissin için dilüent kontrollerini ekleyin; inflamozomu primlemek için izotip kontrolleri için çift örnekler ekleyin. Uygun kuyucuklara 10 µM final konsantrasyonda R 8 48 ekleyin.

Hücreleri 37 °C ve %5 CO2 sıcaklığındaki bir inkübatörde 18 saat boyunca bekletin. Ardından NLRP3 inflamozomunu aktive etmek için 20 µM nihai konsantrasyonda nigerisin ekleyin. Kültürleri ek altı saat daha inkübatörde tutun; örnekleri toplamak için kültür plağını, hücre peletlerini bozmadan 974 ×g hızında üç dakika boyunca santrifüjleyin.

EISA ile sitokin salınımını ölçmek için her bir süpernatantı ayrı bir yuvarlak tabanlı plakaya aktarın. Daha sonra, hücre pelletlerini, çeşitli tekniklerle yapılacak ileri analizler için hücre örneklerindeki hücre dışı IL one beta'yı uzaklaştırmak amacıyla 200 µL 1X PBS ile üç kez yıkayın; pro IL one beta'nın western blot ile tespiti için hücreleri doğrudan 10 µL denatüre edici liziz tamponu ile lizleyn. Lizatları 1,5 mL Eppendorf tüplerine aktardıktan sonra, IL one beta'nın akış sitometrisi ile floresan tespitini gerçekleştirmek için örnekleri 100 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın.

Hücresel örneklere 100 µL %5 PHS medyumu ve fenotip belirteçlerine veya izotip kontrolüne yönelik 1 µL floresan işaretli antikor ekleyip oda sıcaklığında, karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin. Üç kez PBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri 100 µL %4 PFA ile oda sıcaklığında, karanlıkta 20 dakika boyunca fikse edin. Ardından, 100 µL permeabilizasyon tamponu ekleyip 30 dakika bekletin; bunu takiben 62 ng anti IL-1β FSE antikoru veya izotip kontrolü ekleyerek örnekleri 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.

Hücreleri üç kez 200 µL geçirgen tamponla yıkayın ve bir XPBS içinde yeniden süspande edin. Örnekleri folyoya sarın ve 4 °C'de saklayın. IL-1β'nın mikroskopi ile tespit edilmesi durumunda, hücreleri DAPI ile boyayın, mountant ekleyin ve bir lam üzerine kapatma camını nazikçe yerleştirin.

Akış sitometrisi ile floresan deteksiyon için mikroskopi görüntüleri yakalamadan önce numunenin gece boyunca kürlenmesine izin verin. Verileri her seferinde bir örnek olacak şekilde edinin. İleri ve yan saçılım kapılarını canlı hücreler üzerine ayarlayın. Sonraki kapıyı CD 11 C pozitif CD 14 negatif hücreler üzerine ayarlayın.

Son olarak, mikroskopi verileşimindeki pro IL-1β boyamasını temel alarak MODC popülasyonunu analiz edin. Pozlama süresini, pozitif boyama gösteren R 8 48 ile işlem görmüş örnekle ayarlayın. Ardından, western blot tespiti için pro IL-1β eksprese eden MO-DC'lerin yüzdesini belirleyin.

Toplam örnek hacmini poliakrilamid jele yükleyin. Boya cephesi jelden çıkana kadar 140 volt değerinde çalıştırın. Proteini poliakrilamid jelden A-P-V-D-F immo on FL membranına aktarın.

Membranı TBST içindeki %5 BSA ile bir saat boyunca bloke edin. Birincil antikor ile dört santigrat derece sıcaklıkta, çalkalayarak gece boyunca inkübe edin. Üç kez beşer dakikalık TBST yıkamasının ardından, ikincil antikor ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; üç TBST yıkaması daha yaptıktan sonra membranı görüntüleyin. ELISA ile salgılanan sitokinleri ölçerken numuneleri oda sıcaklığında dengeleyin.

Süpernatant yoğunlaşmasını sağlamak için örnekleri santrifüjleyin ve IL-1β hücre içi sitokin boyamasının ölçümü için üretici talimatlarını takip edin; pro-IL-1β boyaması, CD11c pozitif CD14 negatif monosit türevli dendritik hücrelerden mikroskopi ve FACS okumalarına olanak tanır. Her iki teknik de, uyarılmamış veya dinlenme halindeki hücre kontrolünün yanı sıra bir izotip kontrolüne görelebilir şekilde nicelleştirilebilir. pro-IL-1β boyalı hücrelerin yüzdesi, medyan floresan yoğunluğunu sağlamak için bu popülasyonun geometrik medyanı ile çarpılır.

MFI, pozitif boyanmış hücrelerde bulunan pro IL-1β miktarı ile kıyaslanabilir düzeydedir. Burada, hücre lizatlarından pro IL-1β'yı ölçmek için immünoblotlama teknikleri kullanılmıştır. Kantitatif veriler, beklendiği üzere beta-tubulin gibi dahili bir hücresel kontrole göre göreceli olarak ifade edilmiştir.

NI Nigerian ile işlem görmüş hücrelerde pro IL-1β için yapılan immün blotting, pro IL-1β'da bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır. Bu durum, öncelikle R 8 48 ve ardından NI Nigerian koşullarıyla ölçülen, süpernatantlardaki IL-1β'daki eş zamanlı artışla desteklenmektedir. TNF-α, IL-10 ve IL-6 gibi diğer enflamatuar sitokinlerin eş zamanlı ölçümü, Niger'in IL-1β sekresyonuna neden olmada spesifik olduğunu doğrulamaktadır.

Priming düzeyi zamana ve doza bağımlıdır. Hücre dışı protein konsantrasyonunun ölçülmesi, olgun IL-1β üretiminin kemilüminesans ile tespiti veya inflamozomun bloklanması gibi ileri deneyler, hücre dışı IL-1β'nin olgun cleavage formu olup olmadığını ve IL-1β sekresyonunun NLRP3 inflamozom aktivitesine bağımlı olup olmadığını belirlemeye yardımcı olacaktır.