Aktivasyon ve İnsan monosit türevli dendritik hücreler, IL-1β kullanarak NLRP3 Inflammasome Aktivitenin Ölçümü

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, basit IL bir beta okuma tahlilleri kullanarak in vitro insan dendritik hücrelerinde inflamatuar aktiviteyi gözlemlemektir. İlk olarak, hücre içi pro IL bir beta ekspresyonunu indüklemek için hücrelere R 8 48 ekleyin. Daha sonra NLRP üç inflamatuar oluşumunu aktive etmek için nige ekleyin.

Bu da, pro IL bir beta'nın sekresyondan önce olgun IL bir beta'ya bölünmesini tetikler. Daha sonra, numuneleri toplayın ve immünofloresan, western blot ve eli ile astarlanmış ve aktive edilmiş hücrelerden IL bir beta salgılanmasının ölçülmesiyle elde edilen hücre içi pro IL bir beta ve hücre dışı olgun IL bir beta sonuçlarını ölçün. Bir tespit, insan DCS'sinin hazırlanmasının, R 8 48 astarlanmış hücrelerde hücre içi pro IL bir beta üretimi ve Nijerya jurisi ile hem astarlanmış hem de aktive edilmiş hücrelerden IL bir beta salgılanması ile sonuçlandığını göstermektedir.

Bu yöntem, sentetik ligandlara insan dendritik hücre tepkisinde NLRP üç inflamatuarının rolü hakkında bilgi sağlayabilir. Bakteri, virüs ve otoinflamatuar hastalık gibi fizyolojik tetikleyicileri test etmek için tasarlanmış diğer sistemlere de uygulanabilir. 200 mikrolitre taze izole edilmiş monosit türevli dendritik hücreleri, 96 oyuklu yuvarlak bir alt plakada dinlenme durumunda aliquot.

Uyarılmamış negatif kontrolün dört standart koşulu ile başlayın, yalnızca astarlama, yalnızca aktivasyon ve ardından astarlama ile başlayın. Daha sonra deneysel tasarıma göre, R 8 48 için seyreltici kontrolleri ve aşağı akış hücre içi sitokin boyama testleri için nissin'i dahil edin, iltihabı hazırlamak için izotip kontrolleri için kopyaları içerir. R 8 48 EKLEYIN, uygun kuyucuklara 10 mikromolar final konsantrasyonu ekleyin.

Hücreleri 18 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra NLRP üç enflamatuarı aktive etmek için, 20 mikromolar final konsantrasyonunda nige ekleyin. Numuneleri hasat etmek için kültürleri altı saat daha inkübatöre geri koyun, hücre peletlerini rahatsız etmeden kültür plakasını üç dakika boyunca 974 kez G'de santrifüjleyin.

EISA ile sitokin sekresyonunu ölçmek için her süpernatanı ayrı bir yuvarlak alt plakaya aktarın. Şimdi, hücreleri doğrudan 10 mikrolitre denatüre edici lizis tamponunda batı blot tespiti için çeşitli tekniklerle daha fazla analiz için hücresel örneklerden herhangi bir hücre dışı IL, bir beta, bir beta'yı çıkarmak için hücresel peletleri 200 mikrolitre bir XPBS ile üç kez yıkayın. Lizatları 1.5 mililitrelik einor tüplerine aktardıktan sonra, IL bir beta'nın akış sitometrisi ile floresan tespiti için numuneleri 100 santigrat derecede 10 dakika ısıtın.

Hücresel örneklere 100 mikrolitre% 5 PHS ortamı ekleyin ve fenotip belirteçlerine bir mikrolitre floresan etiketli antikor ekleyin veya izotip kontrol karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Üç PBS yıkamadan sonra, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 100 mikrolitre% 4 PFA ile sabitleyin. Daha sonra, 30 dakika boyunca 100 mikrolitre geçirgen tampon ekleyin, ardından 62 nanogram anti IL bir beta FSE antikoru veya izotip kontrol numunelerini 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin.

Hücreleri 200 mikrolitre geçirgen tamponla üç kez yıkayın ve bir XPBS'de yeniden süspanse edin. Numuneleri folyoya sarın ve dört santigrat derecede saklayın. Mikroskopi ile IL bir beta tespit edilirse, hücreleri dappy ile lekeleyin, dağ ekleyin ve bir cam slaytın üzerine nazikçe bir kapak astarı yerleştirin.

Akış sitometrisi ile floresan tespiti için mikroskopi görüntüleri yakalamadan önce dağın gece boyunca kürlenmesine izin verin. Verileri her seferinde bir örnek alın. Canlı hücrelerde ileri ve yan dağınık kapıları ayarlayın CD'deki bir sonraki kapı 11 C pozitif CD 14 negatif hücreler.

Son olarak, mikroskopi veri toplamada pro IL bir beta boyamaya dayalı olarak MODC popülasyonunu analiz edin. Pozitif boyama R 8 48 ile muamele edilmiş numune ile maruz kalma süresini ayarlayın. Ardından, batı lekesi tespiti için MO dcs kolaylığını ifade eden pro IL bir beta yüzdesini belirleyin.

Toplam numune hacmini poli akrilamid jel üzerine yükleyin. Kalıp önü jelden çıkana kadar 140 voltta çalıştırın. Proteini poli akrilamid jelden FL membranı üzerindeki A-P-V-D-F immo üzerine aktarın.

Membranı bir saat boyunca TBST'de% 5 BSA ile bloke edin. Gece boyunca dört santigrat derecede çalkalarken birincil antikor ile inkübe edin. Üç, beş dakikalık TBST yıkamasından sonra, ikincil antikor ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, üç TBST yıkamasından sonra, ELI SA tarafından salgılanan sitokinleri ölçerken zarı görüntüler, numuneleri oda sıcaklığında dengeler.

Süpernatan yoğunlaşmasını pekiştirmek için numuneleri döndürün ve üreticinin IL bir beta ölçümü için talimatlarını izleyin, pro için hücre içi sitokin boyama, bir beta, CD 11 C pozitif, CD 14 negatif monosit türevli dendritik hücrelerden mikroskopi ve gerçek okumalarına izin verir. Her iki teknik de asal olmayan veya dinlenme hücresi kontrolünün yanı sıra bir izotip kontrolüne göre ölçülebilir. Pro IL bir beta boyama hücresinin yüzdesi, medyan floresan yoğunluğunu sağlamak için bu popülasyonun geometrik medyanı ile çarpılır.

MFI, pozitif leke hücrelerinde bulunan pro IL bir beta miktarı ile karşılaştırılabilir. Burada. İmmüno-bloklama teknikleri, hücre lizatlarından pro IL bir betayı ölçmek için kullanılır. Kantitatif veriler, beklendiği gibi beta tübülin gibi dahili bir hücresel kontrole göre ifade edilir.

NI Nijeryalı tedavi edilen hücrelerde pro IL bir beta için immüno bloklama, pro IL bir beta'da bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır. Bu, süpernatanlarda IL bir beta'da eşzamanlı bir artışla tamamlanır, E ELI ile ölçülür ve sadece bir R 8 48 ve ardından NI Nijerya koşulları gelir. T, NF, alfa, IL 10 ve IL altı gibi diğer enflamatuar sitokinlerin eşzamanlı ölçümü, Nijer'in IL bir beta salgılanmasına neden olmada spesifik olmasını sağlar.

Hazırlama seviyesi zamana ve doza bağlıdır. Ex hücre dışı protein konsantrasyonunun ölçülmesi, olgun I bir beta jenerasyonundan kemilüminesans tespiti veya inflamozomun bloke edilmesi gibi daha ileri deneyler, ex hücre dışı IO bir beta'nın olgun bölünmüş form olup olmadığını ve IO bir beta sekresyonunun nlrp olup olmadığını belirlemeye yardımcı olacaktır. Üç inflamatuar aktiviteye bağlıdır.