Üç boyutlu Mürekkep Püskürtmeli Baskı Teknolojisi Kullanımı İnsan Kıkırdak Doku Fabrikasyon

Bu prosedürün genel amacı, eşzamanlı foto polimerizasyona sahip modifiye edilmiş bir termal mürekkep püskürtmeli yazıcı kullanarak 3D doku baskısının fizibilitesini test etmek için üç boyutlu bir insan kıkırdak dokusu oluşturmaktır. Bu, ilk olarak piyasada bulunan bir Hewlett Packard desk jet 500 termal mürekkep püskürtmeli yazıcı ve 5 1 16 2 6 olan tek renkli mürekkep kartuşunu bir biyo yazıcıya değiştirerek gerçekleştirilir. İkinci adım, üretim sürecinde enjekte edilen biyo mürekkebin anında polimerizasyonunu sağlamak için basit bir 3D baskı aşamasını ve uzun dalga boylu bir UV lambasını birleştirmektir.

Daha sonra, biyo mürekkep, genleşmiş insan eklem kondrositlerinin mililitre başına 5 milyon hücrede% 10 polietilen glikol çözeltisi içinde süspanse edilmesiyle hazırlanır. Son adım, kıkırdak dokusunun eşzamanlı foto polimerizasyon ile katman katman şeklinde basılmasıdır. Sonuçta, konfokal mikroskopi ve histoloji.

Boyama, baskılı kondrositlerin bir 3D hidrojel içinde eşit dağılımını ve kültür sırasında homojen neo kıkırdakta mükemmel kıkırdak hücre dışı matris üretimini göstermek için kullanılır. Bu teknolojinin, manuel fabrikasyondan sonra polimerizasyon veya fabrikasyon için taramadan sonra oturma hücreleri gibi mevcut önlemlere göre ana avantajı, basılı hücrelerin hassas bir şekilde dokunsal konuma iletilmesi ve matristeki konumunda kalmasıdır. Yerçekimi nedeniyle iskelenin dibine düşünmek yerine, homojen bir kartuş oluşturur.

Bu videoda gösterilen yazıcı modifikasyonu, Hewlett Packard desk jet 500 termal mürekkep püskürtmeli yazıcıya ve 5 1 6 2 6 siyah mürekkep kartuşuna dayanmaktadır. Yazıcının üst plastik kapağını çıkararak ve kontrol panelini kapaktan dikkatlice ayırarak başlayın. Yazıcının üst kısmı ile tabanı arasındaki üç kablo bağlantısını çıkarın.

Ardından yazıcının üst kısmını tabandan çıkarın. Daha sonra, yazıcı kafası temizleme sistemini oluşturan küçük plastik ve kauçuk aksesuarlar yazıcının üst kısmından çıkarılır. Yaylı kağıt tepsisinin tabanını çıkarın.

Plastik kağıt besleme çubuğunu kaplayan metal plaka da çıkarılmalıdır. Ek olarak, plastik kağıt besleme çubuğu orta besleme tekerleği konumunda kesilmeli ve iki kağıt besleme tekerleği çıkarılmalıdır. Bu videonun amacı doğrultusunda, bu bileşenler zaten kaldırılmıştır.

Konserve hava ve etanol mendil kullanarak tozu ve kalıntıları temizledikten sonra, uv kullanmadan önce yazıcının üst kısmını tabana takın. Modifiye edilmiş yazıcıyı laminer akış başlığında en az iki saat sterilize etti. Mürekkep kartuşunu değiştirmek için önce kapağını kesin.

Bir el testeresi kullanarak mürekkebi boşaltın ve kartuşun alt kuyu haznesini kaplayan filtreyi çıkarın. Kalan mürekkep ultraslarını çıkarmak için kartuşu akan musluk suyuyla iyice durulayın. Kartuşu deiyonize suda 10 dakika boyunca sonikleştirin.

Tüm mürekkebin çıkarıldığından emin olmak için kartuşu inceleyin. Kartuşa sterilizasyon için %70 etanol ve ardından sterilize deiyonize su ile iyice püskürtün. Son olarak, eşzamanlı foto polimerizasyon kapasitesi sağlamak için baskı platformunun üzerine uzun dalga boylu bir UV lambası kurun.

Bir UV ışık ölçer kullanarak baskı platformundaki UV yoğunluğunu ölçün. UV lambası ile yazıcı platformu arasındaki mesafeyi, baskı nesnesindeki yoğunluk santimetre kare başına dört ila sekiz miliwatt arasında olacak şekilde ayarlayın. Lamba ile yazıcı platformu arasındaki bu mesafe yaklaşık 25 santimetre olmalıdır.

Biyo mürekkep, tek katmanlı bir plakada kondrositleri genişletmek için insan kondrositlerinden hazırlanır. Hücre genişlemesi için her T 1 75 doku kültürü şişesine 5 milyon insan kondrositi DMEM'de% 10 buzağı serumu ve% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş hava ile 37 santigrat derecede bir x penisilin, streptomisin glutamin kültür hücresi ile desteklenmiştir. Hücreler% 85 birleşene kadar kültür ortamını her üç günde bir değiştirin.

Aynı pasajdaki hücreleri kullanın. Polietilen glikol DL veya peda çözeltisini hazırlayın. Peda'yı PBS içinde hacim başına ağırlık% 10'luk bir nihai konsantrasyona çözün.

Foto başlatıcı I 2 9 5 9'u hacim filtresi başına ağırlıkça %0,05'lik bir son konsantrasyona ekleyin. Kültürlenmiş insan kondrositleri% 85 birleştiğinde çözeltiyi sterilize edin. Hücre konsantrasyonunu hesapladıktan sonra hücreleri toplayın.

Mililitrede 5 milyon hücrede biyo hazırlamak için gereken hücre süspansiyonu hacmini, beş dakika boyunca 1200 RPM'de konik bir tüp santrifüjüne aktarın. Hücreleri peletlemek için, süpernatanı aspire edin ve biyo mürekkebi oluşturmak için hücreleri hazırlanan Pega çözeltisinde askıya alın. Bu işleme başlamak için, Microsoft Word'ü kullanarak yazıcıyı ve dizüstü bilgisayarı açın, dört milimetre çapında düz bir dairenin yazdırma desenini oluşturun.

Plastik kalıbı yazıcıya yerleştirin. Desenin konumunu ayarlayın ve plastik kalıba tam olarak yazdırılacağından emin olun. İstenilen iskele kalınlığına ulaşmak için gereken baskı sayısını hesaplayın.

Dört milimetre yükseklik için, istenen iskeleyi oluşturmak için 220 baskı gereklidir. Biyo mürekkebi mürekkep kartuşuna yerleştirin. Doğrudan uuv maruziyetinden korumak için kartuşu alüminyum folyo ile kapatın.

Yazdırma sırasında, yazdırma komutunu yazıcıya gönderin. Yazıcı yazdırmaya başladığında, yazdırmaya devam etmek için kağıt sensörünü çekin. Yazıcıdan geçen kağıdın yokluğunda, dört milimetre çapında ve dört milimetre yüksekliğinde bir iskele için tüm yazdırma işlemi dört dakikadan az sürmelidir.

Basılı neo kıkırdağı 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve her oyuğa 1,5 mililitre kültür ortamı ekleyin. Hücre canlılığını değerlendirmek için, basılı neo kıkırdağı canlı ölü canlılığında inkübe edin. Karanlıkta 15 dakika boyunca oda sıcaklığında sitotoksisite çalışma çözeltisi, hücre yüklü hidrojeli yarıya bölün Kesme alanının floresan görüntülerini aldıktan sonra, hücre canlılığını hesaplamak için kör bir gözlemcinin rastgele çekilmiş beş görüntüde canlı ve ölü hücreleri saymasını sağlayın.

Bu fotoğrafta, modifiye edilmiş termal mürekkep püskürtmeli yazıcının özelliklerine bağlı olarak, dört milimetre çapında ve dört milimetre yüksekliğinde temsili bir baskılı neo kıkırdak dokusu gösterilmektedir. Bu boyuttaki bir yapı için, katman katman inşaat sırasında her bir basılı katmanın hacmi ve kalınlığı sırasıyla 0.23 mikrolitre ve 18 mikron idi. Neo kıkırdak dokusunu oluşturmak için tüm baskı süreci dört dakikadan az sürdü.

Bu görüntüler, yeşil ve turuncu floresan boyalarla etiketlenmiş kondrositlere aittir. Panel A, 3B yapı iskelesinde basılı kondrositlerin eşit hücre dağılımını göstermektedir. Hücre birikimi sırasında çevredeki iskelenin eşzamanlı foto polimerizasyonu nedeniyle, baskı ve foto polimerizasyon işlemi, %90'lık bir hücre canlılığı ile dört dakika içinde tamamlandı.

% 63 Safran hücre canlılığına sahip bir A ile aynı boyutta bir yapı olan jele 10 dakika UV maruz bırakıldı ve PEG hidrojelindeki baskılı kondrositlerin o boyanması, 3D'de basılı kondrositlerin konjenik fenotipini ve homojen bir neo kıkırdak oluşumunu gösteren kültür sırasında kademeli olarak artan prot glikan üretimini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, bir 3B iskelede eşit hücre dağılımına sahip üç boyutlu hesaplanmış doku oluşturmak için modifiye edilmiş bir termal mürekkep püskürtmeli yazıcının nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.