G-protein bağlı reseptörler ile Potasyum kanallarının modülasyonunu Algılama Label içermeyen optik Biyosensör kullanımı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, etiketsiz rezonans dalga boyu derecelendirmeli optik biyosensörler kullanarak potasyum kanalları tarafından G-protein kenetli reseptörlerin modülasyonunu tespit etmektir; bunu başarmak için, rezeke edilmemiş HEK 2 93 hücreleri ve rat sodyumla aktive olan potasyum kanalı slack B'yi stabil olarak eksprese eden HEK 2 93 hücreleri 384 kuyucuklu bir optik biyosensör plakasına yerleştirilir ve gece boyunca inkübe edilmeye bırakılır. Ardından, plazma membranı yakınındaki kütlenin bazal ölçümü gerçekleştirilir ve endojen G-protein kenetli reseptörlerin veya GPCR'ların agonistleri eklenir. Son adım olarak, GPCR aktivasyonu sonucu ortaya çıkan sinyal değişimi ölçülür ve bu yanıtın potasyum kanalı modülasyonu hesaplanır.

Nihayetinde bu yöntem, G-proteini kenetli reseptörler ile potasyum kanalları arasındaki sinyal mekanizmalarını kantitatif olarak ölçerek, nörobilim ve hücresel sinyal iletimi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kanallar ve proteinler arasındaki etkileşimleri incelemek için halihazırda mevcut olan yöntemlere (örneğin, CO ve çöktürme analizleri) kıyasla bu tekniği kullanmanın temel avantajları, analizin canlı hücreler kullanılarak gerçekleştirilebilmesidir. Bu yöntem, etkileşime giren proteinin yapısını değiştirebilecek ekzojen etiketlerin kullanımını gerektirmez.

Ve son olarak, canlı hücreler içerisinde etkileşimleri gerçek zamanlı olarak takip edebilirsiniz. Bu yöntem, GPCR'ler ve potasyum kanalları arasındaki sinyal iletimi hakkında bilgi sağlayabilmenin yanı sıra; ligand kaynaklı hücre yapışması ve yayılma değişikliklerinden, toksisite, proliferasyon, migrasyon ve plazma membranının optik biyosensöre olan yakınlığındaki her türlü değişimden kaynaklanan hücresel yanıtları incelemek için de kullanılabilir.

Bu teknik, kanal proteinleri üzerindeki farmakolojik ajanların etkilerini test etmek için yüksek kapasiteli bir yöntem olarak kullanılabildiği için, birçok kanalopati gibi iyon kanalları veya reseptör anormalliklerinin neden olduğu hastalıklara yönelik yeni terapötik yaklaşımların keşfinde de kullanılma potansiyeline sahiptir. Protein etkileşimleri. Canlı hücrelerdeki kanal proteini etkileşimlerini inceleyebilecek bir analiz yöntemi geliştirmenin gerekli olduğunu fark ettiğimizde, ilk kez bu yöntemi kullanma fikrini geliştirdik.

384 kuyucuklu optik biyosensör plaka kaplamasına, titanyum dioksit plakayı her kuyucuğa 20 µL steril doku kültürüye uygun su ekleyerek 15 dakika boyunca nemlendirerek başlayın. Ardından, plakayı her kuyucuğa 50 µL fosfat tamponlu salin veya PBS ile bir kez yıkamak için 16 kanallı bir pipet kullanın.

Ardından, hücre dışı matrisi veya ECM'yi oluşturmak için, oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe etmeden önce her bir kuyucuğa 20 µL hazırlanmış fibronektin çalışma çözeltisi ekleyin. Plakayı her kuyucuk başına 50 µL PBS ile bir kez yıkayın; ardından her birine 40 µL hazırlanmış ovalbümin çalışma çözeltisi ekleyin.

Ovalbümin bağlanmasının ardından plakayı bloke etmek için plakayı dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Plakayı, kuyuk başına 50 µL PBS ile üç kez yıkayın. ECM kaplı plakalar, dört derece Celsius'ta 48 saate kadar saklanabilir.

Metin protokolünde açıklandığı şekilde kültüre edilmiş olan, hem rezekte edilmemiş HEK 293 hücrelerinden hem de slack B'yi stabil olarak eksprese eden HEK 293 hücrelerinden büyüme ortamını uzaklaştırın. Ardından, hücreleri plakadan ayırmak için tripsin ekleyin. Hücreleri 1000 ×g kuvvetinde bir dakika boyunca santrifüj ederek toplayın.

Tripsin ortamını uzaklaştırın ve hücreleri büyüme ortamında yeniden süspande edin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayıcı kullanarak, inkübasyon sırasındaki evaporasyon etkilerini minimize etmek amacıyla hücre konsantrasyonunu belirleyin; her kuyucuk için istenen hücre sayısına ulaşmak için hücreleri dilüe edin. Bu deneyler için, 50 µL büyüme ortamı hacminde, kuyucuk başına 1000 hücre.

Her bir kuyucuğa 50 µL seyreltilmiş hücre pipetlenmesinin ardından biyosensöre ekim yapıldı; yerleşen hücrelerin büyüme ortamında, 37 °C'de ve %5 CO2 altında gece boyunca inkübe edilmesine izin verildi. Rezonans dalga boyu gradyanı (RWG) optik biyosensör analizi hazırlamak için, inkübasyonun ardından hücrelerden büyüme ortamı uzaklaştırıldı.

Hücreleri bir kez hank's dengeli tuz çözeltisi ile yıkayın ve ardından her bir kuyuya 25 µL çözelti ekleyin. Biyosensör plağını bağlama tarayıcısına yerleştirin ve hücrelerin bir ila iki saat boyunca oda sıcaklığında dengelenmesini sağlayın. Bu sırada, analiz sırasında biyosensör plağına ilgili ligandların ekleneceği ayrı bir bileşik plağı hazırlayın.

Bu analizler için, toplam hacim 50 µL olacak şekilde, biyosensör plakasındaki her bir kuyucuğa bileşik içeren çözeltiden 25 µL eklenmiştir. RWG optik biyosensör analizini gerçekleştirmek için, 384 kuyucuklu plakanın yarısını temsil eden A1'den P12'ye kadar olan kuyucuklar için tarayıcı sistemi ile bir başlangıç ölçümü alın; Bind Scan yazılımını kullanarak her kuyucuğun merkezi 1,5 mm'lik alanı için piksel başına 3,75 µm maksimum çözünürlük kullanın; bu başlangıç taraması yaklaşık 30 dakika sürecektir.

Ardından, A 1 ile P 12 arasındaki her bir kuyucuğa 25 µL bileşik çözeltisi ekleyin. Daha sonra, A 13 ile P 24 arasındaki kuyucukların bazal ölçümünü yapın. Bu kuyucukların bazal ölçümü tamamlandıktan sonra, A 13 ile P 24 arasındaki her bir kuyucuğa 25 µL bileşik çözeltisi ekleyin.

Son adım olarak, A1'den P12'ye kadar olan kuyucuklar için bileşik sonrası ölçüm yapın ve ardından A13'ten P24'e kadar olan kuyucuklar için işlemi tekrarlayın. Deney verilerini analiz etmek için, Windows'ta başlangıç ölçümüne ait bağlama deneyi verilerini açın ve hücre seçimini etkinleştirmek için ızgara düzenleyici düğmesine tıklayın. Yazılım, kullanıcı tarafından tanımlanan ilgili metrikleri hesaplayacaktır; hücre bulucu ve başlangıç veya fonksiyon seti parametrelerini içeren eklentileri açın ve hücrelerin biyosensör arka planından ayırt edilebilmesi için hücre bulucudaki parametreleri ayarlayın.

Bazal ölçüm için hücre bulucu verilerini içeren hücre haritası dosyasını dışa aktarın. Bu adımları bileşik ekleme sonrası verileri için tekrarlayın. Ardından bazal veya eklentiyi açın ve bazal ölçümden gelen hücre haritasını içeri aktarın.

Yazılım, arka plan ile bileşik sonrası veriler arasındaki pik dalga boyu değeri (PWV) kaymasını hesaplayacaktır. Hücreler için ortalama PWV kaymasının çıktısını almak üzere delta hücre ortalamasını (delta cell mean) seçin. Veriler daha sonra ileri analizler için Microsoft Excel'e aktarılabilir.

S-lac b stabil olarak transfekte edilmiş HEK 2 93 hücreleri ve kontrol olarak rezekte edilmemiş HEK 2 93 hücreleri, 384 kuyucuklu, ECM kaplı RWG biyosensör plakalarına kuyucuk başına 1000 hücre olacak şekilde yerleştirildi; bileşik eklemesi öncesinde ve sonrasında 30. dakikada bind scan ile kütle yoğunluk gradyan haritaları oluşturuldu.

Kırmızıyla gösterilen yazılım alanları hücrelere ait olduğu belirlenen pikselleri, sarı çizgiler ise hücreleri gri plaka arka planından ayıran sınırları temsil etmektedir. Bileşik eklemesi sonrası PWV değerinin bazal PWV değerinden çıkarılmasıyla, GPCR agonisti eklemesi üzerine PWV'deki kaymayı belirlemek için bind view yazılımı kullanılmıştır. Bu durum, kırmızının pik dalga boyu değerinde pozitif bir kaymayı, mavinin ise herhangi bir değişikliği temsil ettiği bir renk gradyanı ile gösterilmiştir.

Karbahol'e karşı endojen M1 muskarinik reseptör, hem rezeke edilmemiş kontrol HEK 2 93 hücrelerine hem de slack B'yi stabil olarak eksprese eden HEK 2 93 hücrelerine uygulanmış ve kontrol hücrelerine kıyasla pik dalga boyu değerinde pozitif bir artışla sonuçlanmıştır. Slack B transfekte edilen hücrelerde pik dalga boyu değerindeki artış daha yüksek olmuştur. Endojen GPCR proteazla aktive edilen reseptör birine karşı agonist aktivite gösteren S-F-L-L-R NH iki, tri florasetat tuzu ve terminal trombin reseptör aktive edici peptit pentapeptit de rezeke edilmemiş ve slack B transfekte edilmiş hücrelerde farklı yanıtlar göstermiştir.

Bu sonuçlar, Slack B kanalının varlığının, HEK hücrelerinde endojen G PCR aktivasyonu sonrası meydana gelen PWV kaymasını önemli ölçüde artırdığını göstermekte ve kanal protein etkileşimlerini incelemek için bu analiz yönteminin kullanımının uygulanabilirliğini kanıtlamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, etiketsiz bir optik biyosensör analizinin nasıl geliştirileceği ve uygulanacağı konusunda kapsamlı bir anlayış edinmiş olmalısınız. Hücreler ve reaktifler bu prosedür sırasında dikkatle hazırlandığı takdirde, bu teknik uzmanlaşıldığında iki gün içerisinde tamamlanabilir.

Ekilecek hücre sayısı, ligandların inkübasyon süresi vb. gibi assay parametrelerinin farklı hücre hatları için optimize edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu prosedürü gerçekleştirdikten sonra, sinyaldeki gözlemlenen değişikliğin hangi spesifik proteinler tarafından sağlandığını belirlemeye çalışmak için R ve AI gibi diğer yöntemleri kullanabilirsiniz. İnsan hücre kültürleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygularken biyogüvenlik kabininde çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.