Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Bu prosedürün genel amacı, iyi huylu meme fenotipini malign meme fenotipinden ayırt etmek için üç boyutlu kültür sistemini kullanmaktır. Bu, ilk olarak kontrol ve deney hücrelerinin, sekiz kuyucuklu bir lam içinde bir büyüme faktörü azaltılmış matrigel tabakası üzerine üç kopyalar halinde kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, her dört günde bir% 2 GFR Matrigel ile taze tam ortam değişiklikleri vermek ve asinin benzeri kolonilerin 10 ila 15 gün boyunca büyümesine izin vermektir.

Daha sonra, 3D olarak büyütülen aser benzeri kolonilerin faz kontrast görüntüleri beş x çözünürlükte elde edilir. Son adım, ilgili moleküler belirteçlerle immünosito kimyasal analiz için aser benzeri kültürlerin işlenmesi ve ardından orta kesitte C iki immüno-leke aser benzeri kolonilerin konfokal görüntülerinin elde edilmesidir. Sonuç olarak, 3D kültürde büyütülen hücrelerin faz kontrastı ve konfokal görüntüleri, hücresel fenotipik ve moleküler değişiklikleri tanımlamak ve böylece iyi huylu meme hücrelerini kötü huylu hücrelerden ayırt etmek için kullanılır.

Bu tekniğin iki boyutlu kültürler, invazyon veya migrasyon testleri gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, iyi huylu memenin doku mimarisini ve malign transformasyon sırasındaki organizasyon kaybını özetleyebilmesidir. Bu nedenle, bu teknik, iyi huylu meme hücrelerini kötü huylu meme hücrelerinden ayırt etmek için etkili bir şekilde kullanılabilir. Bu yöntem, hücre fenotipi üzerindeki sinyal yolaklarının kusuru gibi meme kanseri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına ve yeni onkojenik ve/veya tümör baskılayıcı yolakların belirlenmesine yardımcı olabilir.

Deneye başlamak için, büyüme faktörü azaltıldı veya GFR matrigel'i gece boyunca dört santigrat derecede çözdürün. Ardından, tüm HME ortamını 37 santigrat derecede ısıtın ve soğuması için sekiz kuyulu odacıklı bir slaytı buz üzerine yerleştirin. Önceden soğutulmuş sürgünün her bir oyuğunun ortasına 40 mikrolitre GFR Matrigel ekleyin.

Menisküs oluşumuna yol açabilecek kabarcıklardan ve aşırı yayılmadan kaçınarak bir P 200 pipet ucu kullanarak jeli mümkün olduğunca eşit bir şekilde yayın. Daha sonra, matri jeli tripsin gözlerini, HME hücrelerini katılaştırırken, slaydı 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe ederek matri jeli katılaştırın, daha sonra bunları 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve hücreleri dört dakika boyunca yerçekiminin 150 katı döndürün, hücreleri sayın ve mililitre başına 12.500 hücreye seyreltin. Komple ortamda,% 2'lik bir nihai konsantrasyonda hücre süspansiyonuna GFR matrigel ekleyin ve önceden kodlanmış oda Slaytının her bir oyuğuna 400 mikrolitre çözelti ekleyin.

Ardından slaydı CO2 tamponlu bir inkübatöre yerleştirin. Medyayı 15 gün boyunca her dört günde bir yeni tam medya ile değiştirin. İnhibitör çalışmaları için, kaplama sırasında tam ortama küçük moleküllü inhibitörler ekleyin, ardından büyüme hücrelerini başlatmak ve her tedavi seti için üçlü katlar yapmak için her üç günde bir inhibitörlerle desteklenen taze ortam değişiklikleri yapın.

Bir slayt değiştiriciye ve bir bilgisayara bağlı bir faz kontrast mikroskobu kullanarak her bir kuyucuktan aser yapılarının faz kontrast görüntülerini beş x çözünürlükte alın. Slaytı bir çerçeveden diğerine hareket ettirerek, odacıklı slaydın tüm kuyusunu geniş bir şekilde kaplayarak görüntüleri çekin. Aser yapılarının toplam sayısını, tek yuvarlak düz asisinin sayısını ve çok aser yapıların veya organizasyondan yoksun gelişigüzel büyüyen yapıların sayısını sayın.

Ve yayılan dallanma süreçleriyle, tek yuvarlak düz aser yapıların kötü huylu yapılara karşı yüzdesini hesaplayın ve bilgileri çizin. Sütun grafiği olarak. İki kuyruklu eşleşmemiş öğrenci T testi ile anlamlılığı hesaplayın.

Ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi immünofloresan boyama için reaktifler hazırlayın. Ardından, şartlandırılmış ortamı dikkatli bir şekilde aspire etmek için bir P 200 pipet kullanın. Daha sonra ASIN'i veya yapıları taze hazırlanmış% 2 para formaldehit ile oda sıcaklığında fiksasyondan sonra 20 dakika boyunca sabitleyin, hücrelere dört santigrat derecede 10 dakika boyunca% 0.5 tritton X 100 ile nüfuz edin.

Daha sonra kültürleri her yıkama için 10 ila 15 dakika boyunca 100 milimetre glisin ile üç kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca birincil blok tamponunda bloke edin. Daha sonra kültürleri, matrigeldeki amino reaksiyona giren fare IgG türlerini bloke etmek için 30 dakika boyunca ikinci bloke edici çözelti olarak da adlandırılan birincil blok tamponunda mililitre başına 20 mikrogram keçi anti fare fab iki parçasında inkübe edin.

Bloke ettikten sonra, hücreleri birincil antikor ile ikinci bloke etme solüsyonunda gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri üç kez immünofloresan tamponu ile yıkayın veya her yıkama için 10 ila 15 dakika boyunca hafifçe sallayarak tamponlayın. Daha sonra hücreleri floresan konjuge ikincil antikorlarla if F tamponunda 45 dakika inkübe edin.

Daha sonra, hücreleri her biri 10 dakika boyunca üç kez F tamponu ve hafifçe sallayarak yıkayın. Çekirdekleri görselleştirmek için slaytları DPI içeren solma önleyici reaktif ile monte edin. Slaytların gece boyunca oda sıcaklığında kurumasına izin verin.

Daha sonra, matrijelin üzerinde büyüyen hücrelerin koloni orta bölümünde konfokal görüntüler elde edin ve asner yapısının tüm uzunluğu boyunca bir dizi optik kesit elde edin, z istifleme ile DPI lekeli HME kontrollü ve C CN altı knockdown hücrelerinin konfokal görüntüleri beşinci günde knockdown hücrelerinin organizasyondan yoksun olduğunu göstermektedir. 15. günde, kontrol hücreleri, invaziv bir dallanma ve tübüler fenotip sunan, yıkılmış hücrelerden ayrılan farklılaşmış ASIN veya yapılar ve iyi tanımlanmış lümen ile büyüme durdurulur. İmmünofloresan boyama, sırasıyla bazal membranın bozulmasını, bazal polaritenin kaybını ve hücre hücresi temasını gösteren laminin v alfa altı integrin ve ECA herrin'in ekspresyon kaybını gösterir.

Kötü huylu hücrelerde, kontrol hücreleri, alfa altı integrin apikal ekspresyonu GM one 30 ve eca'nın asinin bazal ekspresyonu etrafında sağlam bir tabaka gösterir. Burada, hücre hücresi kavşağında, CCN altı knockdown HME hücrelerinin malign fenotipi, saflaştırılmış rekombinant insan CCN altı proteininin, iki yüksek metastatik meme hücresi hattının, bazı 1 49 ve M-D-A-M-B 2 31'in eksojen tedavisi ile tersine çevrildi. Malign davranışı azaltan P 38 map kinaz inhibitörleri, SB 2 0 3 8 50 ve SB 2 0 2 1 90 ile tedavi edildi.

Bu videoyu izledikten sonra, meme hücrelerinin 3D kültürde nasıl büyütüleceğini iyi anlamalı ve iyi huylu meme hücresi fenotiplerini kötü huylu meme hücresi fenotiplerinden ayırt etmek için matrigel üzerinde sino benzeri büyümeyi etkili bir şekilde kullanmalısınız.